本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-(2-脫氧-2-取代氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基硫脲化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，具體涉及新穎的N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-(2-脫氧-2-取代氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基硫脲化合物及其制備方法和對碳酸酐酶IX的抑制作用，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
碳酸酐酶(Carbonic anhydrases，CAs)普遍存在于生物體內(nèi)，是一類含鋅金屬酶，主要生理作用是催化二氧化碳的可逆水合反應(yīng)，對諸如體內(nèi)的氣體交換、離子交換和維持細(xì)胞內(nèi)外pH的平衡等生理過程至關(guān)重要。其中，碳酸酐酶IX(CA IX)為跨膜蛋白，目前已經(jīng)被鑒定為腫瘤相關(guān)蛋白，除了胃腸粘膜組織有一定表達(dá)外，在其它正常組織中幾乎不表達(dá)，而在許多實(shí)體瘤中卻高度表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲(Kim S.J.,et a1.Clin Cancer Res,2004,l0:7925–7933；Shurin G.V.,et al.Cancer Res,2001,61:363–369.)。因此，CA IX已經(jīng)成為了一個潛在的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)，其抑制劑的研究已經(jīng)發(fā)展成為一個令人矚目的新型抗腫瘤策略。
盡管CA IX為跨膜蛋白，但其胞外催化域是生物功能的關(guān)鍵區(qū)域，催化中心位于一個錐形腔內(nèi)，該空腔從蛋白質(zhì)表面貫穿到中心，分為疏水區(qū)和親水區(qū)兩部分，Zn2+離子則位于這個空腔的最底部，成為抑制劑分子的主要結(jié)合位點(diǎn)。這種結(jié)構(gòu)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)碳酸酐酶CA I和CA II的活性中心大體類似，功能也基本相同，但也為設(shè)計高選擇性CA IX抑制劑創(chuàng)造了極大的難題(Monti S.M.,et al.Curr Med Chem,2012,19:821–830.)。
由于CA I、CA II和CA IX晶體結(jié)構(gòu)的高度相似性，單純以酶的結(jié)構(gòu)為依據(jù)設(shè)計選擇性抑制劑比較困難，近些年出現(xiàn)了“非膜滲透性抑制劑”的理論，從這些同工酶的亞細(xì)胞定位的不同上來設(shè)計靶向不同的同工酶的抑制劑(Thiry,A.,et al.J Med Chem,2008,51:3051–3056.)。從亞細(xì)胞定位上看，CA I、CA II只存在于細(xì)胞質(zhì)中，而腫瘤相關(guān)的CA IX則存在于細(xì)胞膜上，并且其活性中心位于細(xì)胞膜外。因此，合理設(shè)計非膜滲透性抑制劑，可以實(shí)現(xiàn)靶向CA IX，而不會作用于CA I和CA II，由此可避免藥物脫靶造成的副作用，大大提高了抑制劑的成藥性。
此外，研究發(fā)現(xiàn)，CA IX中有一些氨基酸殘基是其他同工酶所不具有的，比如天門冬氨酸(Asp132)殘基的存在，可以在抑制劑中引入帶正電的側(cè)鏈，使其與Asp132形成離子相互作用，增加分子與酶的結(jié)合力。另外，帶有游離羥基的蘇氨酸(Thr69)殘基位于空腔的親水口袋、帶有胍基的精氨酸(Arg130)殘基位于空腔的入口處，可以在抑制劑中引入能與之形成氫鍵的基團(tuán)。此外，CA IX一級序列的131位為纈氨酸(Val131)，而其胞質(zhì)同工酶CA II為苯丙氨酸(Phe131)，因此加大抑制劑的空間位阻或許可以增加對CA IX的作用選擇性(Alterio,V.,et al.J Am Chem Soc,2006,128:8329–8335；Thiry,A.,et al.J Med Chem,2006,49:2743–2749.)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于設(shè)計與合成一類新型的N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-(2-脫氧-2-取代氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基硫脲化合物，進(jìn)行具有治療癌癥的藥物創(chuàng)制研究。
為了完成本發(fā)明之目的，可采用如下技術(shù)方案：
本發(fā)明是涉及具有通式(I)結(jié)構(gòu)的新型N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-(2-脫氧-2-取代氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基硫脲化合物，及其光學(xué)活性體，非對映異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽。
其中：
R為取代或未取代的苯基，所述取代基為C1－C3烷氧基；
優(yōu)選地，R為取代或未取代的苯基，所述取代基為甲氧基；
進(jìn)一步地，
R優(yōu)選為(1)2-甲氧基苯基，(2)3-甲氧基苯基(3)4-甲氧基苯基，(4)2,3-二甲氧基苯基，(5)2,4-二甲氧基苯基，(6)2,5-二甲氧基苯基，(7)2,6-二甲氧基苯基，(8)3,4-二甲氧基苯基，(9)3,5-二甲氧基苯基，(10)2,3,4-三甲氧基苯基，(11)2,3,5-三甲氧基苯基，(12)2,3,6-三甲氧基苯基，(13)2,4,5-三甲氧基苯基，(14)2,4,6-三甲氧基苯基，(15)3,4,5-三甲氧基苯基的一種；
R特別優(yōu)選為(1)2-甲氧基苯基，(2)3-甲氧基苯基(3)4-甲氧基苯基，(4)2,3-二甲氧基苯基，(5)2,4-二甲氧基苯基，(6)2,4,5-三甲氧基苯基，(7)3,4,5-三甲氧基苯基的一種；
本發(fā)明還包括如下具體的N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-(2-脫氧-2-取代氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基硫脲化合物，及其光學(xué)活性體，非對映異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽：
為了制備本發(fā)明通式(I)所述的化合物，及其光學(xué)活性體，非對映異構(gòu)體，采用如下路線合成該類化合物：將氨基葡萄糖鹽酸鹽的氨基以2,2,2-三氯乙氧?；Ｗo(hù)得中間體2，中間體2引入苯甲?；玫街虚g體3，中間體3在氫溴酸的醋酸溶液中發(fā)生取代反應(yīng)得到中間體4，中間體4與硫氰酸銨發(fā)生取代反應(yīng)得到中間體5，中間體5與磺胺反應(yīng)生成中間體6，中間體6用鋅粉-冰醋酸處理脫去2,2,2-三氯乙氧?；玫街虚g體7，中間體7在冰浴條件下與各種取代的肉桂酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng)制得中間體8，最后在堿性溶液中脫去糖上的全部苯甲酰基得到通式(I)的化合物。
反應(yīng)式如下：
更具體地，反應(yīng)式為：
其中，
R為取代或未取代的苯基，所述取代基為C1-C3烷氧基。
本發(fā)明基于CA IX的結(jié)構(gòu)特征和亞細(xì)胞定位，設(shè)計合成選擇性非膜滲透性CA IX抑制劑，選用親水性的氨基葡萄糖為骨架，通過硫脲柔性連接基團(tuán)引入靶向CA IX活性中心的經(jīng)典藥效團(tuán)磺胺片段，并在糖上氨基以酰胺形式接入取代肉桂酰基結(jié)構(gòu)，以此與天門冬氨酸(Asp132)殘基產(chǎn)生作用，整體結(jié)構(gòu)可選擇性抑制胞外的CA IX催化活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。
具體實(shí)施方式
聯(lián)系如下實(shí)施例，將更好地理解本發(fā)明的化合物和他們的制備，這些實(shí)施例旨在闡述而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-4’-甲氧基肉桂酰基)-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A1)
將氨基葡萄糖鹽酸鹽(15g，69mmol)溶于150mL水中，加入碳酸氫鈉(17.39g，207mmol)和氯甲酸三氯乙酯(11.45mL，83mmol)，反應(yīng)5h，抽濾，干燥，得白色固體20g，產(chǎn)率90％。
將上述產(chǎn)物懸浮于吡啶(50mL)中，冰浴下滴加70mL苯甲酰氯，反應(yīng)5h。待溶液澄清后，加入200mL水?dāng)嚢?0min，用二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層水洗3次，稀鹽酸調(diào)pH至5，飽和碳酸氫鈉調(diào)pH至7，水洗2次，無水硫酸鈉干燥。過濾，減壓除去溶劑得中間體3。
將上述粗品溶于干燥二氯甲烷，冰浴下滴加70mL HBr/AcOH溶液，反應(yīng)2h后加入200mL水?dāng)嚢?0min，用二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層水洗3次，稀鹽酸調(diào)pH至5，飽和碳酸氫鈉調(diào)pH至7，水洗2次，無水硫酸鈉干燥。柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)得到26g中間體4，兩步產(chǎn)率62％。
稱取溴代糖(26g，35.76mmol)和干燥的硫氰酸銨(2.7g，35.76mmol),加入丙酮和無水乙腈各50mL，50℃攪拌2h。濾掉白色固體，濾液濃縮，以石油醚/乙酸乙酯(5:1)柱層析得14g白色固體5，產(chǎn)率55％。
將磺胺(3.4g，19.77mmol)和中間體5(14g，19.77mmol)溶于吡啶，室溫反應(yīng)1h。反應(yīng)液用二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層水洗3次，稀鹽酸調(diào)pH至5，飽和碳酸氫鈉調(diào)pH至7，水洗2次，無水硫酸鈉干燥。柱層析(二氯甲烷：甲醇＝40:1)得到16g中間體6，產(chǎn)率92％。
中間體6(16g，18mmol)溶于40mL的冰乙酸中，加入鋅粉(39g，600mmol)，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)液濃縮，柱層析(二氯甲烷：甲醇＝25:1)提純，得10.8g中間體7，產(chǎn)率85％。
中間體7(200mg，0.284mmol)溶于10mL吡啶，冰浴條件下滴加對甲氧基肉桂酰氯，反應(yīng)1h，用甲醇淬滅反應(yīng)，濃縮，二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層水洗3次，稀鹽酸調(diào)pH至5-6，飽和碳酸氫鈉調(diào)pH至7，水洗2次，無水硫酸鈉干燥。柱層析(二氯甲烷：甲醇＝15:1)提純，得到200mg中間體8，產(chǎn)率81％。
中間體8(100mg，0.11mmol)加入10mL的甲醇中，加入1M甲醇鈉/甲醇溶液0.3mL，室溫反應(yīng)10min，加入陽離子交換樹脂攪拌調(diào)pH至7左右，過濾，濾液濃縮，柱層析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得到白色固體55.9mg，產(chǎn)率87.5％。
Mp 165.5–167.2℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.22(s,1H),8.02(s,1H),7.71(dd,J＝23.0,8.8Hz,4H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝15.5Hz,1H),7.27(s,2H),6.98(d,J＝8.7Hz,2H),6.51(d,J＝15.8Hz,1H),5.42(s,1H),5.04(s,2H),3.82(d,J＝9.3Hz,1H),3.78(s,3H),3.65(d,J＝10.8Hz,1H),3.52(dd,J＝11.8,4.5Hz,1H),3.44(d,J＝7.0Hz,2H),3.23(dd,J＝17.2,8.4Hz,1H),3.16(d,J＝9.9Hz,1H)；ESI-MS(m/z):575.4[M+H]+。
實(shí)施例2：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-3’-甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A2)
實(shí)施例2的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用間甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體57.4mg，產(chǎn)率89.8％。
Mp 170.9–172.7℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),8.33(d,J＝6.6Hz,1H),8.03(s,1H),7.73(d,J＝8.9Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.41(d,J＝15.5Hz,1H),7.33(t,J＝7.9Hz,1H),7.29(s,2H),7.14(d,J＝7.4Hz,1H),7.12(s,1H),6.97–6.94(m,1H),6.66(d,J＝15.5Hz,1H),5.43(s,1H),5.10(s,2H),3.83(d,J＝9.0Hz,1H),3.78(s,3H),3.64(d,J＝11.0Hz,1H),3.51(dd,J＝11.8,4.4Hz,1H),3.44(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H),3.23(t,J＝9.1Hz,1H),3.16(d,J＝8.8Hz,1H)；ESI-MS(m/z):575.4[M+Na]+。
實(shí)施例3：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-2’-甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A3)
實(shí)施例3的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用鄰甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體53.2mg，產(chǎn)率83.3％。
Mp 172.9–174.5℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.31(s,1H),8.01(s,1H),7.72(d,J＝14.0,8.8Hz,5H),7.52(d,J＝7.3Hz,1H),7.37(t,J＝7.8Hz,1H),7.27(s,2H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),6.99(t,J＝7.5Hz,1H),6.70(d,J＝15.7Hz,1H),5.43(s,1H),5.07(d,J＝20.3Hz,2H),4.52(s,1H),3.85(s,3H),3.65(s,1H),3.55–3.50(m,1H),3.44(dd,J＝7.0,5.1Hz,2H),3.24(dd,J＝14.8,9.0Hz,1H),3.16(d,J＝6.6Hz,1H)；ESI-MS(m/z):575.5[M+Na]+。
實(shí)施例4：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-2’,3’-二甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A4)
實(shí)施例4的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用2,3-二甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體50mg，產(chǎn)率76.8％。
Mp 164.6–166.7℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),8.37(d,J＝7.7Hz,1H),8.01(t,J＝15.3Hz,1H),7.76–7.66(m,5H),7.30(d,J＝10.1Hz,2H),7.15(d,J＝7.7Hz,1H),7.11(t,J＝7.8Hz,1H),7.07(d,J＝8.0Hz,1H),6.67(d,J＝15.9Hz,1H),5.43(s,1H),5.10(s,2H),3.90–3.82(m,1H),3.81(s,3H),3.72(s,3H),3.64(s,1H),3.52(dd,J＝12.0,4.2Hz,1H),3.4–3.42(m,2H),3.24(t,J＝9.1Hz,1H),3.17–3.12(m,1H)；ESI-MS(m/z):605.4[M+Na]+。
實(shí)施例5：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-2’,4’-二甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A5)
實(shí)施例5的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用2,4-二甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體56.2mg，產(chǎn)率86.5％。
Mp 148.5–150.2℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.46(d,J＝66.9Hz,1H),8.25(dd,J＝27.8,7.6Hz,1H),8.03(s,1H),7.83–7.74(m,1H),7.71(dd,J＝22.9,8.8Hz,4H),7.61(d,J＝16.2Hz,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.29(s,2H),6.60(s,1H),6.60–6.57(m,1H),5.40(s,1H),5.08(s,2H),4.56(s,1H),3.85(s,3H),3.80(s,3H),3.76(s,1H),3.63(s,1H),3.54–3.49(m,2H),3.23(dd,J＝16.4,7.5Hz,1H),3.12(s,1H)；ESI-MS(m/z):605.4[M+Na]+。
實(shí)施例6：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-2’,4’,5’-三甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A6)
實(shí)施例6的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用2,4,5-三甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體54.7mg，產(chǎn)率82.6％。
Mp 164.4–167.2℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.40(s,1H),8.19(s,1H),8.02(s,1H),7.73(d,J＝8.6Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.65(d,J＝15.8Hz,1H),7.29(s,2H),7.07(s,1H),6.71(s,1H),6.57(d,J＝15.8Hz,1H),5.39(s,1H),5.08(s,2H),4.55(s,1H),3.84(s,3H),3.83(s,3H),3.78(d,J＝11.5Hz,1H),3.74(s,3H),3.54–3.49(m,1H),3.44(d,J＝7.0,5.1Hz,2H),3.23(dd,J＝14.7,8.8Hz,1H),3.14(s,1H)；ESI-MS(m/z):635.4[M+Na]+。
實(shí)施例7：N-4-苯磺酰胺基-N’-1-脫氧-[(2-脫氧-2-氨基-N-反-3’,4’,5’-三甲氧基肉桂?；?-β-D-吡喃葡萄糖酰胺基]硫脲(A7)
實(shí)施例7的化合物制備方法同實(shí)施例1，只是使用3,4,5-三甲氧基肉桂酰氯替代了對甲氧基肉桂酰氯，得白色固體57.6mg，產(chǎn)率92.7％。
Mp 207.4–210.6℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),8.25(s,1H),8.03(s,1H),7.73(d,J＝8.7Hz,2H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),7.38(d,J＝15.6Hz,1H),7.27(s,2H),6.90(s,2H),6.61(d,J＝15.5Hz,1H),5.41(s,1H),5.06(d,J＝16.4Hz,2H),4.52(s,1H),3.81(s,7H),3.68(s,3H),3.67–3.63(m,1H),3.54–3.50(m,1H),3.44(d,J＝6.8Hz,1H),3.25–3.21(m,1H),3.17(s,1H)；ESI-MS(m/z):635.5[M+Na]+。
本發(fā)明產(chǎn)物的藥理研究
(1)采用酶水解法測定化合物A1－A7對人源碳酸酐酶IX(hCA IX)的抑制作用。用分析緩沖液將底物稀釋到2mM，用分析緩沖液將酶稀釋到20ng/μL，將50μL酶加入到96孔板中，加入抑制劑，室溫下孵育15min，加入25μL2mM底物起始反應(yīng)，10min后酶標(biāo)儀讀取348nm吸光度值。測試7個不同濃度的抑制率得到IC50值，抑制率計算公式如下：
％inhibition＝(1-sample activity/total activity)*100
所測結(jié)果如下表：
(2)采用MTT法測定化合物A1－A7對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的細(xì)胞活力抑制作用。取對數(shù)生長期的上述細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×104個/孔埋入96孔板，37℃培養(yǎng)24小時后，除陰性對照組外，每組設(shè)三個平行孔，加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)于37℃下培養(yǎng)24小時后每孔加入MTT(0.5mg/mL)溶液培養(yǎng)3小時，棄去上清液，以PBS清洗殘留藥物后，每孔加入100μL DMSO，于微量振蕩器振蕩10分鐘以將結(jié)晶完全溶解，隨后用Emax Microplate Reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)測定各孔在540nm處的吸光值，根據(jù)陰性對照組計算細(xì)胞活力抑制率：
Inhibitory ratio(％)＝(A540,control–A540,experiment)/(A540,control–A540,blank)×100
所測結(jié)果如下表：