本發(fā)明涉及涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，可應(yīng)用于小麥品質(zhì)育種領(lǐng)域，具體提供了一種小麥沉淀值分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植最為廣泛的三大糧食作物之一，其種植面積、總產(chǎn)及在國(guó)際貿(mào)易中所占的比例均居糧食作物之首。我國(guó)作為世界上小麥生產(chǎn)和消費(fèi)的第一大國(guó)，小麥生產(chǎn)與國(guó)家糧食安全密切相關(guān)。隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)、健康成為現(xiàn)代社會(huì)人們生活的主要追求。由于小麥面粉含有其它作物所欠缺的面筋，適于制作面包、饅頭、面條、餅干、糕點(diǎn)等多種食品，因此對(duì)小麥品質(zhì)的研究是從面筋蛋白質(zhì)開(kāi)始的，而沉淀值是蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量綜合反映，是評(píng)價(jià)面筋強(qiáng)度優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

沉淀值由主基因和微效基因共同控制，基因數(shù)目多且效應(yīng)較低，易受環(huán)境影響。在傳統(tǒng)育種中需要進(jìn)行大量的品質(zhì)檢測(cè)選擇，工作量大，效率低難以滿足現(xiàn)在的需要。另外，沉淀值不像田間農(nóng)藝性狀，可以靠感官選擇，因此不能在田間直接選擇，而實(shí)驗(yàn)室測(cè)定需要量較大，因此，沉淀值在育種中難以在田間依靠傳統(tǒng)育種方法早代選擇。而新興的分子標(biāo)記輔助選擇不受環(huán)境影響，可以進(jìn)行程序化早代選擇和預(yù)測(cè)，可顯著提高目標(biāo)性狀選擇的準(zhǔn)確性，對(duì)加快小麥品質(zhì)改良及保障我國(guó)糧食安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。在小麥品質(zhì)性狀上,1B/1R在我國(guó)主推品種中仍然占很大比例,一些對(duì)品質(zhì)改良有積極作用的優(yōu)異基因和QTL尚未得到充分利用,如Bx14+Byl5、Bxl7+Byl8、Wx-Alb、Wx-Dlb等。而與小麥沉淀值有關(guān)的基因鑒定則更少，缺乏分子標(biāo)記輔助選擇的有效標(biāo)記。

目前小麥沉淀值分子標(biāo)記輔助選擇受到以下方面的限制，一方面：目前多數(shù)發(fā)表的沉淀值QTLs位點(diǎn)沒(méi)有經(jīng)過(guò)育種過(guò)程或品種有效性驗(yàn)證。另外，由于單一遺傳群體定位的基因位點(diǎn)，準(zhǔn)確度差，而且由于置信區(qū)間大，QTLs過(guò)多或存在假陽(yáng)性QTLs，降低了沉淀值分子輔助選擇的實(shí)際效率，甚至沒(méi)法有效應(yīng)用到小麥育種中。

因此需要提供一種針對(duì)于小麥沉淀值的實(shí)用性分子標(biāo)記以利于小麥品質(zhì)育種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長(zhǎng)期研究和探索，提供了一種小麥沉淀值分子標(biāo)記，位于小麥1B染色體WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之間；通過(guò)該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測(cè)小麥品種或品系中是否具有增大沉淀值的QSed1B-26基因位點(diǎn)，以加快小麥高品質(zhì)品種的選育進(jìn)程，由于采用了專用的沉淀值分子標(biāo)記不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了高品質(zhì)小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量，提高了QTL檢測(cè)的效應(yīng)和定位精度，開(kāi)發(fā)了實(shí)效性分子標(biāo)記，研制沉淀值分子輔助育種體系，可以程序化應(yīng)用于育種實(shí)踐。

發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：

一種小麥沉淀值分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥1B染色體WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之間；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。

通過(guò)該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測(cè)小麥品種或品系中是否含有增大沉淀值基因位點(diǎn)的QSed1B-26，具體步驟為：

利用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)植株的的葉片DNA，獲得347bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用Alw44I專一酶酶切后檢測(cè)是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；

判定標(biāo)準(zhǔn)為：不具有增大沉淀值基因的品種或品系中目的條帶被切斷；具有增大千粒重基因的品種或品系中目的條帶未被切斷，保持原樣。

為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計(jì)了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)

反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:4所示)

通過(guò)特異性引物的擴(kuò)增，以及對(duì)產(chǎn)物的酶切結(jié)果進(jìn)行判定，主要原因在于：通過(guò)這種方法可以判定該位點(diǎn)是否含有沉淀值增效基因位點(diǎn)，雖然小麥沉淀值受多個(gè)基因位點(diǎn)控制，但是由于本發(fā)明所判定的位點(diǎn)為主效基因位點(diǎn)，其對(duì)于小麥的沉淀值有著十分重要的增效效果，故而即可獲知待測(cè)小麥品種是否具有沉淀值增效效果的相關(guān)基因；為沉淀值基因聚合、進(jìn)而改良小麥品質(zhì)提供分子基礎(chǔ)，從而可以更好的應(yīng)用于品種改良中去。

綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種小麥沉淀值分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥1B染色體WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之間；通過(guò)該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測(cè)小麥品種或品系中是否具有增大沉淀值基因位點(diǎn)的QSed1B-26，以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。由于采用了專用的沉淀值分子標(biāo)記不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了高品質(zhì)小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

圖1為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對(duì)優(yōu)良品質(zhì)體系和低劣品質(zhì)體系的酶切驗(yàn)證結(jié)果電泳圖，通過(guò)圖中可知，低劣品質(zhì)體系經(jīng)過(guò)酶切后目的片段被切成2段，而優(yōu)良品質(zhì)體系中則沒(méi)有被切斷。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中除特殊說(shuō)明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

實(shí)施例1小麥的葉片DNA提取

(1)取約0.3-0.5g葉片入5mL離心管，液氮速凍后研成粉末；

(2)加入約1600μL已預(yù)熱至65℃的緩沖液S，多次倒置混勻，水浴0.5-1h，其間輕搖幾次以充分混勻；

(3)降溫到室溫，等待10分鐘，加10-15μL RNA酶(10mg/mL)37℃水浴30鐘，其間輕搖幾次以充分混勻，約1次/10min；

(4)取出離心管，加入等體積1600μL,4℃苯酚(Tris-平衡酚)：氯仿：異戊醇(25：24：1(體積比)抽提，輕輕混勻10min，4℃冰箱靜置5min，然后8000rpm離心10min；

(5)取上清液于另一管，約1300μL，加入等體積冷氯仿(4℃冰箱放置)，輕搖10min混勻，8000rpm離心10min；

(6)取上清液于另一管，加100μL 3M NaAC(醋酸鈉)，加入1000μL的冷異丙醇(或2倍體積的冷乙醇)，充分混勻后于-20℃冰箱靜置20min；

(7)用槍頭挑出絮狀的DNA，用70％乙醇清洗2–3次，稍離心5分鐘，去掉乙醇，氣干后(無(wú)乙醇?xì)馕都纯?，溶于200μL 1×TE，輕輕混勻，-20℃儲(chǔ)存；

(8)用微量可見(jiàn)/紫外分光光度計(jì)NanoDrop2000，測(cè)定DNA濃度，稀釋DNA濃度為200ng/μL做為工作液。

附錄：溶液配制：

(1)3M NaAc(pH 5.2)

600mL H₂O中加408.24g NaAc-3H₂O，(或者246.24g無(wú)水醋酸鈉)溶解后用冰醋酸(冰乙酸)調(diào)pH值至5.2，定容至1L，滅菌，備用。

(2)1×TE(pH 8.0)

800mL H₂O中加1.211g Tris、0.3723g Na₂EDTA-2H₂O，用HCL調(diào)pH值至8.0，定容至1L，滅菌，備用。

(3)RNA酶：(若商業(yè)化配置好的1mL處理好的分裝RNA酶，可以直接使用。)

將固體RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶濃度為10mg/mL，加熱至100℃處理15–20min，慢慢冷卻至室溫，然后加入0.1倍體積1M Tris-HCL(pH 7.4)，分裝后于–20℃冰箱保存。

(4)緩沖液S

按照如下配方配制后，定容至1L。

(5)10％SDS配制：

900ml水中100g溶解電泳級(jí)SDS，加熱至68度助溶，加幾滴濃HCL調(diào)節(jié)溶液PH到7.2，加水定容到1L，分裝備用。(SDS微細(xì)晶，易擴(kuò)散，需戴面罩。10％SDS無(wú)需滅菌。

實(shí)施例2目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增

正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)

反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:4所示)

PCR擴(kuò)增：其PCR擴(kuò)增體系為20μL

備注：Mix可用：或(Taq酶0.25μL，DNK 2.0μL,Buffer1.5μL,MgCl 0.4μL配置。)

擴(kuò)增條件：

通過(guò)上述擴(kuò)增即可獲得347bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

實(shí)施例3PCR產(chǎn)物專一性酶切：

酶切體系10μL：

專一酶Alw44I：0.3μL

PCR產(chǎn)物：2μL

10×NE buffer:1.0μL

ddH₂O:6μL

酶切反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中添加0.3μL Alw44I專一酶(市場(chǎng)購(gòu)得)，37℃水浴4h.然后將酶切體系65℃滅火5min。

將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為347bp，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，不具有增大沉淀值基因的品種或品系(低沉淀值)目的條帶被切斷，而具有增大沉淀值基因的品種或品系中該片段未被切碎，保持原樣。