本發(fā)明涉及一種重組干擾素標準品的制備方法，具體涉及一種重組犬干擾素α標準品、其制備方法及效價測定方法。

背景技術：

隨著社會進步和人民生活方式的改變，犬作為伴侶動物已成為人們生活的一部分。犬瘟熱、犬細小等病毒性傳染病嚴重危害養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，目前無有效治療藥物，主要用疫苗接種進行預防，但免疫效果欠佳。同時，狂犬病等人畜共患病也引起人們的重視，因此，采用一種安全無副作用的藥物來預防和治療犬病毒病就顯得尤為重要。

干擾素是一類由病毒及脂多糖等物質誘導機體產生的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用的蛋白質，1957年由Issacs和Lindeman首先發(fā)現，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照干擾素的產生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、γ三種型?，F已知，干擾素α在體內可有選擇性地作用于病毒感染細胞，通過抑制受染細胞內的病毒蛋白質的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用，但對正常宿主細胞無作用。

Himmler等在1987年首先對犬干擾素α進行了研究，我國也在1999年開始進行了相關研究，并得到了一系列犬干擾素相關產品。

對于生物制品來說，其質量評價的有效性指標多采用生物學方法，如動物法和細胞法等進行檢測，這些方法本身變異性較大，因此，標準品是生產中必不可少的組成部分，在生物制品標準化、質量控制和效力評價中，標準品是藥品質量評價的標尺，起著非常重要的作用。

目前已有人干擾素標準品面世，豬的干擾素標準品已獲得發(fā)明專利，然而目前國際國內均沒有重組犬干擾素α的標準品，由于干擾素具有種屬特異性，人或者豬的的干擾素標準品并不適用于犬干擾素，這給犬干擾素在防治病毒性疾病中應用研究和生產工作帶來很多不便。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種重組犬干擾素α標準品的制備方法，按照此方法制備的重組犬干擾素α抗病毒活性標準品效價為：1.0×10⁴IU/mL；SDS-PAGE檢測其純度為97.34％；HPLC檢測其純度為99.79％；相對分子量為33KD。

本發(fā)明還提供了按照上述制備方法制備得到的重組犬干擾素α標準品，其N-末端氨基酸序列從第十個氨基酸開始為CHLPDTHSLRWRVLTL。

本發(fā)明還提供了重組犬干擾素α標準品的效價測定方法。

本發(fā)明采取的技術方案為：

一種重組犬干擾素α標準品的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將重組犬干擾素α的重組菌進行發(fā)酵和誘導，直接收集菌體破碎后上清提取總蛋白，所述重組犬干擾素α的重組菌為BL21/pET-28α-rCaIFNα工程菌；

(2)總蛋白經親和層析純化、陰離子交換層析純化、分子篩層析純化，即可得到重組犬干擾素α純化后蛋白溶液；

(3)重組犬干擾素α純化后蛋白溶液過濾除菌、稀釋后加入凍干保護劑，經真空冷凍干燥，即可制得重組犬干擾素α標準品。

所述步驟(1)具體包括以下步驟：

(1-1)培養(yǎng)工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα，得到工程菌菌液；

(1-2)將工程菌菌液按體積比1：10接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后作為發(fā)酵種子菌液；

(1-3)發(fā)酵種子菌液接種到裝有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵、誘導，得到發(fā)酵液；

(1-4)發(fā)酵液離心、破碎后收集上清液，即可得到重組犬干擾素α蛋白。

所述步驟(1-3)具體包括以下步驟：將發(fā)酵種子菌液接種到裝有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵種子菌液與LB培養(yǎng)基的體積比為1:10，設置溫度為37℃、溶氧為30％、轉速為200～220r/min、pH為7.0～7.4條件下發(fā)酵；當發(fā)酵罐內的OD₆₀₀達到1.0時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mmol/L，繼續(xù)誘導表達4～6h，得到發(fā)酵液。

所述步驟(1-3)還包括：接種發(fā)酵種子菌液之前，裝有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐要進行原位滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min。

所述步驟(1-4)具體包括以下步驟：將發(fā)酵液4℃條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml生理鹽水重懸菌體，在900bar壓力下高壓細胞破碎，重復破碎兩次，4℃條件下8000r/min離心15min，收集上清；重復離心一次，收集上清液，即可得到重組犬干擾素α蛋白。

所述親和層析純化所用的洗脫液為50mMTris與20mM～500mM咪唑組成的混合液，pH為8.0～9.0。梯度洗脫，20mM～200mM咪唑洗脫雜蛋白，200mM～500mM咪唑洗脫目的蛋白。此步驟可以去除80％雜蛋白，使純度達到80％。然后透析于50mM Tris與50mM NaCl組成的混合液,pH為6.5。

所述陰離子交換層析所用的洗脫液為50mM Tris與500mM NaCl組成的混合液，其pH值為6.5。洗脫下來的目的蛋白純度在90％以上。

所述分子篩層析所用的洗脫液為50mM Na₂HPO₄與0.15M NaCl組成的混合液，其pH值為7.4。此步既可以更換緩沖液為磷酸鹽緩沖液，又可以去除小分子雜蛋白，洗脫下來的目的蛋白純度在98％左右。

采用以上三種層析柱進行純化，既可以使得目的蛋白純度達到95％以上，又可以去除大量的內毒素。

所述步驟(3)具體包括以下步驟：將重組犬干擾素α純化后蛋白溶液用0.22μm濾膜過濾除菌，用PH值為7.4的10mmol/L PBS稀釋后加入終濃度達10％(質量百分濃度)甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以2.2ml西林瓶容量分裝，真空冷凍干燥后即可制得重組犬干擾素rCaIFN-α標準品。

本發(fā)明還提供了按照上述制備方法制備得到的重組犬干擾素α標準品，其N-末端氨基酸序列從第十個氨基酸開始為CHLPDTHSLRWRVLTL。

所述重組犬干擾素α標準品的效價為1.0×10⁴IU/mL；SDS-PAGE檢測其純度為97.34％；HPLC檢測其純度為99.79％；相對分子量為33KD。

本發(fā)明提供了重組犬干擾素α標準品的效價測定方法，牛腎細胞作為測試細胞，重組犬干擾素α標準品作為供試品，重組人干擾素α標準品作為對照品，將供試品和對照品分別制成不同的稀釋度，在MDBK/VSV系統(tǒng)上對重組犬干擾素α標準品效價進行標定。

按照本發(fā)明方法制得的重組犬干擾素α標準品為凍干制劑，其優(yōu)點為：效價高、穩(wěn)定，以現有人標準干擾素作為參比準確，生產成本低廉。

目前國際國內均沒有重組犬干擾素α的標準品，本發(fā)明提供一種重組犬干擾素α生物學活性檢測用標準品的制備方法，為建立重組犬干擾素α質量標準奠定基礎。

按此方法制備的重組犬干擾素α作為標準品可用于重組犬干擾素α特性鑒別和效價測定的比對，以此為標準可使不同批次測定的重組犬干擾素α效價檢測結果更為可靠可信。

附圖說明

圖1為重組犬干擾素αHPLC C18反相層析C蛋白純度檢測結果圖

圖2為重組犬干擾素α免疫印跡檢測結果圖

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的；所涉及的PBS緩沖溶液的pH值均為7.4；工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα的構建方法參見2008年1月9日公開的中國專利CN101100664。

實施例1

重組犬干擾素α標準品的制備

1.重組犬干擾素α蛋白溶液的制備

1.1將工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα接種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～24小時，將陽性克隆接種至3ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩培養(yǎng)18h，得到菌液；

1.2將步驟1.1得到的菌液接種至50ml培養(yǎng)基中，菌液與培養(yǎng)基的體積比為1:10，置37℃搖床培養(yǎng)18h，轉速為200r/min，作為發(fā)酵種子菌液；

1.3將配好的LB培養(yǎng)基加到發(fā)酵罐中，連接pH探針、溶氧探針進行原位滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min；

1.4將發(fā)酵種子菌液接種到裝有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵種子菌液與LB培養(yǎng)基的體積比為1:10，設置溫度為37℃、溶氧為30％、轉速為220r/min、pH為7.2條件下發(fā)酵；當發(fā)酵罐內的OD₆₀₀達到1.0時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mmol/L，繼續(xù)誘導表達4h，得到發(fā)酵液；

1.5將發(fā)酵液4℃條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml生理鹽水重懸菌體，在900bar壓力下高壓細胞破碎，重復破碎兩次，4℃條件下8000r/min離心15min，收集上清；重復離心一次，收集上清液，即可得到重組犬干擾素α蛋白。

2.重組犬干擾素α蛋白溶液的純化

2.1His親和層析

粗制的重組犬干擾素α用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在AKTA explorer 100蛋白純化系統(tǒng)上，用Binding Buffer(PBS)平衡好的His親和層析柱，用PBS緩沖液洗去未結合的蛋白，直到A_280nm穩(wěn)定，再用由Tris、咪唑組成的洗脫液洗脫，Tris的濃度為50mM，咪唑的濃度為20mM～500mM，收集rCaIFN-α蛋白峰。

2.2DEAE陰離子交換層析

將經過His親和層析純化后收集的蛋白置換到Binding BufferⅡ(50mMTris pH6.5)中后，上樣通過用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE陰離子交換層析柱，再用Binding BufferⅡ過柱至A_280nm值穩(wěn)定后用Elution BufferⅡ(50mMTris,500mM NaCl,pH6.5)線性梯度洗脫，收集rCaIFN-α蛋白峰。

2.3分子篩層析

將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用Binding BufferⅢ(50mM Na₂HPO₄ 0.15M NaCl pH7.4)平衡好Superdex 200分子篩層析柱，用Binding BufferⅢ洗脫，收集rCaIFN-α蛋白峰。

3.重組犬干擾素α標準品的制備

將重組犬干擾素α純化后蛋白溶液用0.22μm濾膜過濾除菌，用PH值為7.4的10mmol/L PBS稀釋后加入終濃度達10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以2.2ml西林瓶容量分裝。分裝后迅速冷凍真空干燥，按制品冷凍真空干燥法進行，即可制得重組犬干擾素rCaIFN-α標準品。

實施例2

重組犬干擾素α標準品的檢測

1.蛋白質含量測定

對上述純化后的rCaIFN-α標準品用Lowry法檢測蛋白濃度，其蛋白含量為0.4mg/ml。

2.SDS-PAGE進行純度鑒定

對rCaIFN-α標準品進行SDS-PAGE鑒定純度，其純度為97.34％。

3.HPLC純度鑒定

rCaIFN-α標準品經μRPC C18ST 4.6/100反相層析柱進行分析只得到一個主吸收峰如圖2，有1個峰為雜峰。通過計算峰面積得出主峰面積占總面積的99.79％(圖1)。

4.N-端氨基酸序列測定

4.1酶切：取純化后的rCaIFN-α蛋白200μg，加4單位重組腸激酶，與酶切緩沖液中4℃條件下酶切16小時。

4.2SDS-PAGE電泳：取酶切產物進行SDS-PAGE電泳，上樣前先將配置好的聚丙烯酰胺凝膠裝到垂直電泳儀上，用50V恒壓空跑30min。

4.3轉膜：將蛋白電轉到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，電轉緩沖液用CAPS緩沖液。

4.4立春紅染色：將PVDF膜放到立春紅染液中染色，待看到蛋白條帶后拿出，用水洗去背景顏色。

4.5將目的條帶剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法進行N端氨基酸測序。

4.6N-末端氨基酸序列從第十個氨基酸開始為CHLPDTHSLRWRVLTL。

實施例3

重組犬干擾素α標準品的效價測定

本檢測方法根據rCaIFN-α可以保護牛腎細胞(MDBK)免受水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的侵害作用的原理，以干擾素抑制病毒致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)現象作為檢測其活性的方法。即以每毫升干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數定為干擾素單位(或稱效價)，常以單位(U)表示，并用國家標準品校正結果。該結果經用結晶紫染料對存活MDBK細胞染色觀察后，根據著色深淺，按Reed-Munch公式計算出所測定干擾素的效價。

1.實驗材料

重組人干擾素α標準品：購自北京中國食品藥品鑒定研究院，干擾素α國家標準品，批號：97/04，下稱標化干擾素；

細胞：牛腎細胞(MDBK)，購自ATCC；

病毒：攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV)，由安徽醫(yī)科大學臨床病毒研究所惠贈。

96孔細胞培養(yǎng)板：其編號方法為：從左至右的12列分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12進行編號；從上至下的前五行分別用A、B、C、D、E、F進行編號。

2.主要操作步驟和方法

2.1供試品溶液的制備

在無菌條件下操作，將重組犬α干擾素標準品加入1ml PBS溶解后，用測定培養(yǎng)液1:10²稀釋后，在96孔細胞培養(yǎng)板中，從1:2稀釋度開始做2倍遞增系列稀釋，共10個稀釋度(橫排放，為1-10孔)，每個稀釋度加2孔，第11孔為MDBK細胞對照組，第12孔為VSV病毒對照組。病毒對照和細胞對照不加干擾素(設為C、D行)。

2.2對照重組人干擾素α的制備

在無菌條件下操作，將人干擾素對照品按標示量在96孔細胞培養(yǎng)板中稀釋，從同樣稀釋度開始，做2倍遞增系列稀釋，共計制作10個稀釋度，每個稀釋度加入2孔，第11孔為MDBK細胞對照組，第12孔為VSV病毒對照組，病毒對照和細胞對照不加干擾素(設為A、B行)。

2.3效價測定

取培養(yǎng)的細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次后，消化和收集細胞，用營養(yǎng)培養(yǎng)液配制成每毫升含4×10⁵～5×10⁵個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。

將配制完成的不同稀釋度對照品溶液移入接種MDBK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板的A、B行的1-10列中，每孔加入100μl，將配制完成的不同稀釋度供試品溶液移入接種MDBK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板的C、D行的1-10列中，每孔加入100μl，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)18～24h。

棄去細胞培養(yǎng)板中的上清液，將保存的水皰性口炎病毒(VSV，－70℃保存)用培養(yǎng)液稀釋至約100TCID₅₀/ml，移入接種MDBK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板的A、B、C、D行的1-10及12列中，每孔100μl，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h(鏡檢供試品溶液的50％病變點在1U/ml)。

2.4結果觀察

將置溫箱24h培養(yǎng)物于倒置顯微鏡下觀察。首先觀察“細胞對照孔”和“病毒對照孔”，每孔中出現的CPE用“+”表示。當病毒對照孔出現“+++或++++”，即病毒對照孔中的細胞出現75～100％的明顯病變，正常細胞對照孔中的細胞全部生長良好無病變時，則表明本次實驗對照系統(tǒng)合格，否則棄去重做。

當干擾素保護孔CPE不再進展，即可觀察結果。

將上述細胞板蓋打開，棄去各孔內液體于消毒液中，加結晶紫染色液1～2滴/孔，3～5min后用細水流沖洗孔內殘余染液，干燥后即可記錄結果：

++++表示全部細胞病變；+++表示75％細胞病變；

+++表示50％細胞病變；+表示25％細胞病變。

2.6結果觀察

重組犬干擾素α標準品效價(IU)計算方法及結果。供試品組結果記錄如下表1、2：

表1.某批重組犬干擾素α標準品結果以“+”“－”記號記錄形式

表2. 50％保護細胞的干擾素稀釋度計算(Reed Muench計算)

據Reed-Munch公式計算

按表2中，此次重組犬干擾素α標準品能保護半數(50％)細胞不被病毒損害的最高稀釋度在1：64×10²～1：128×10²。

即此次重組犬干擾素α標準品稀釋到2^-6.65×10²(1:1.0×10⁴)時，能保護半數細胞免受“攻擊病毒”損害。即此次犬干擾素α標準品的工作單位為1.0×10⁴IU/ml。

經過測試，制備的重組犬干擾素α標準品工作效價達到1.0×10⁴IU/ml。

上述參照實施例重組犬干擾素α標準品、其制備方法及效價測定方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。