本發(fā)明屬于藥用植物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世緯苣苔Tengia scopulorum Chun，又名黔苣苔，中國(guó)貴州特有珍稀瀕危藥用植物。當(dāng)年鄧世緯先生與助手楊昌漢、徐方才、黃孜文四人為了采集這批植物野外染病，相繼殉職，付出了生命的代價(jià)。如今原模式產(chǎn)地（貴定平伐）種群疑似已經(jīng)消亡。就生物多樣性而言，瀕危物種是優(yōu)先保護(hù)對(duì)象。并且世緯苣苔對(duì)于苦苣苔科系統(tǒng)分類和進(jìn)化發(fā)育的研究具有非常重要的科學(xué)價(jià)值與意義，是不可替代的寶貴材料。同時(shí)受資源量限制，世緯苣苔的藥用研究尚屬空白。保護(hù)及進(jìn)一步的科學(xué)研究，面臨的首要問(wèn)題都是原植物的鑒定。而傳統(tǒng)的植物形態(tài)鑒定必須要等到花期，具有較大的時(shí)間限制，對(duì)操作人員的鑒別能力有較高的要求。同時(shí)由于樣本量和相關(guān)研究較少，現(xiàn)有文獻(xiàn)也未公開(kāi)有用于世緯苣苔的DNA鑒定識(shí)別條形碼序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有世緯苣苔的物種鑒定存在鑒別時(shí)間段限制以及鑒別難度較大的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用，本鑒定方法從分子水平分析分析世緯苣苔的遺傳物質(zhì)，進(jìn)而能夠快速準(zhǔn)確的鑒定植物世緯苣苔，為世緯苣苔的保護(hù)和藥用價(jià)值研究奠定基礎(chǔ)。

一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：獲取植物組織樣本并提取樣本DNA；

S2：采用ITS引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

和/或采用trnL-F引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物，電泳檢測(cè)分離出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

S3：將多次測(cè)序得到的序列通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，剪去兩端不一致的不可信序列，得到植物組織樣本的ITS序列和trnL-F序列，將ITS序列與SEQ ID NO.13所示的序列進(jìn)行比對(duì)，將trnL-F序列與SEQ ID NO.14所示的序列進(jìn)行比對(duì)，以鑒定該植物組織樣本是否為世緯苣苔。

進(jìn)一步的，在步驟S1中，所述植物組織樣本為帶有葉綠體的葉片組織樣本，并采用硅膠對(duì)所述植物組織樣本進(jìn)行干燥。

進(jìn)一步的，步驟S1包括：取0.5-2cm3的硅膠干燥葉片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷凍后用磨碎機(jī)碾磨30s，加入800μL65℃預(yù)熱過(guò)的CTAB溶液，再加入0.5%濃度的β-巰基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液為包括體積比為24：1的氯仿和異戊醇，搖勻10min；然后10℃，12000rpm,離心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，離心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，4℃，12000rpm,離心7min；取上清，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管；加入等量-20℃的異丙醇，-20℃下靜置1-2h，使DNA沉淀出來(lái)；靜置后，4℃，12000rpm,離心10min，棄上清；加入300μL 75%乙醇，洗滌兩次，每次4℃，12000rpm，離心10min；自然風(fēng)干30min左右，加60μL的DDH₂O溶解DNA30min左右，得到樣本DNA；用凝膠電泳檢測(cè)總DNA。

進(jìn)一步的，步驟S2中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，ITS上游引物或trnL-F上游引物 2 μL，ITS下游引物或trnL-F下游引物 2μL；

所述dNTP的濃度為2.5 mmol/L，所述ITS上游引物、trnL-F上游引物、ITS下游引物、trnL-F下游引物的濃度均為2 mmol/L。

進(jìn)一步的，步驟S2中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)過(guò)程包括：94℃預(yù)變性4min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)32次，72℃延伸10min。

進(jìn)一步的，步驟S3中還包括：將得到的ITS序列和trnL-F序列輸入植物遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定近緣物種。

如上所述的SEQ ID NO.13序列在世緯苣苔鑒定中的應(yīng)用。

如上所述的SEQ ID NO.14序列在世緯苣苔鑒定中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明提供的世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法，是本發(fā)明人通過(guò)不同引物PCR擴(kuò)增試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，采用ITS引物和trnL-F引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的ITS序列和trnL-F序列具有與其他種類植物較大的區(qū)別特征，即ITS序列和trnL-F序列與其他物種的遺傳序列具有較大的區(qū)分度，將其應(yīng)用于世緯苣苔的物種鑒定，與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定相比，本DNA序列鑒定方法受植物生長(zhǎng)期限制小，鑒定所需的植物組織材料極少，格外適用于珍稀瀕危植物的鑒定；另一方面本方法能夠降低鑒定鑒定過(guò)程的不穩(wěn)定因素，同時(shí)因?yàn)樾蛄械牧炕卣鞫鴾p少了人為主觀的介入，使得世緯苣苔的鑒定過(guò)程更加快速準(zhǔn)確，為世緯苣苔的保護(hù)與研究提供了可靠依據(jù)。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例采用的材料是貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志教授在貴陽(yáng)市發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)世緯苣苔居群的隨機(jī)采樣樣本，憑證標(biāo)本存放于中科院植物研究所王印政研究組，標(biāo)本編號(hào)LMT-2012-016。選取居群不同位置點(diǎn)多個(gè)植株的新鮮葉片各1片，立即用硅膠干燥封存。

取世緯苣苔硅膠干燥的葉片，采用改良后的CTAB法提取總DNA。

提取總DNA操作為：取0.5-2cm3的硅膠干燥葉片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷凍后用磨碎機(jī)碾磨30s，加入800μL65℃預(yù)熱過(guò)的CTAB溶液（十六烷基三甲基溴化銨溶液），再加入0.5%濃度的β-巰基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液為包括體積比為24：1的氯仿和異戊醇，搖勻10min；然后10℃，12000rpm,離心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，離心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，4℃，12000rpm,離心7min；取上清，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管。加入等量-20℃的異丙醇，-20℃下靜置1-2h，使DNA沉淀出來(lái)；靜置后，4℃，12000rpm,離心10min，棄上清；加入300μL 75%乙醇，洗滌兩次，每次4℃，12000rpm，離心10min；自然風(fēng)干30min左右，加60μL的DDH₂O（雙蒸水）溶解DNA30min左右，得到樣本DNA；用凝膠電泳檢測(cè)總DNA（取2μL母液，用6× Loading buffer）。

采用ITS引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，ITS上游引物（2 mM）2 μL，ITS下游引物（2 mM） 2μL。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)過(guò)程包括：94℃預(yù)變性4min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)32次，72℃延伸10min,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

用1%瓊脂糖的凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因做雙向測(cè)序。

用DNAMAN將3次測(cè)得序列進(jìn)行比對(duì)，剪去兩端不一致的不可信序列，得到SEQ ID NO.13序列，長(zhǎng)617個(gè)堿基。

將得到的SEQ ID NO.13序列輸入“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，顯示最接近的物種顯示為Tengia scopulorum [Petrocodon scopulorus]，序列相似性99.2%。

將得到的SEQ ID NO.14序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，最接近的物種顯示為Tengia scopulorum，序列相似性99%。

實(shí)施例2

本實(shí)施例包括如實(shí)施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實(shí)施例中采用trnL-F引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL， trnL-F上游引物（2 mM）2 μL，trnL-F下游引物（2 mM） 2μL。

最終得到SEQ ID NO.14序列，長(zhǎng)838個(gè)堿基。

將得到的SEQ ID NO.14序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，在以“ident”為優(yōu)先排序條件下，最接近的物種顯示為Tengia scopulorum，序列相似性99%。

對(duì)比例1

本對(duì)比例包括如實(shí)施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實(shí)施例中采用rbcL引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述rbcL引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.5所示）和rbcL下游引物（如SEQ ID NO.6所示）。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，rbcL上游引物（2 mM）2 μL，rbcL下游引物（2 mM） 2μL。。

得到SEQ ID NO.15序列，長(zhǎng)636個(gè)堿基。

將SEQ ID NO.15序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，最接近的物種顯示為Primulina liboensis，序列相似性99%。

對(duì)比例2

本對(duì)比例包括如實(shí)施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實(shí)施例中采用matK引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述matK引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.7所示）和matK下游引物（如SEQ ID NO.8所示）。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，matK上游引物（2 mM）2 μL，matK下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.16序列，長(zhǎng)847個(gè)堿基（比對(duì)后末端做了近200個(gè)堿基剪除后的長(zhǎng)度）。

將SEQ ID NO.16序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，最接近的物種顯示為Petrocodon coriaceifolius，序列相似性99%。

對(duì)比例3

本對(duì)比例包括如實(shí)施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實(shí)施例中采用atpI-H引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述matK引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.9所示）和atpI-H下游引物（如SEQ ID NO.10所示）。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，atpI-H上游引物（2 mM）2 μL，atpI-H下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.17序列，長(zhǎng)867個(gè)堿基（比對(duì)后前端做了約70個(gè)堿基剪除后的長(zhǎng)度）。

將SEQ ID NO.17序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，最接近的物種顯示為Petrocosmea iodioides，序列相似性98%。

對(duì)比例4

本對(duì)比例包括如實(shí)施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實(shí)施例中采用rps16引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述rps16引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.11所示）和rps16下游引物（如SEQ ID NO.12所示）。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，rps16上游引物（2 mM）2 μL，rps16下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.18序列，長(zhǎng)760個(gè)堿基

將SEQ ID NO.18序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種鑒定，最接近的物種顯示為Primulina dryas，序列相似性98%。

結(jié)果分析

實(shí)施例1-2、對(duì)比例1-4中所采用的ITS引物、trnL-F引物、rbcL引物、matK引物、atpI-H引物和rps16引物均為現(xiàn)有引物，根據(jù)鑒定效果分析，確定世緯苣苔的DNA鑒定識(shí)別條形碼為核DNA的ITS序列（SEQ ID NO.13序列）和葉綠體DNA的trnL-F序列（SEQ ID NO.14序列）。

DNA片段應(yīng)用于植物鑒定直接而有效，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于數(shù)據(jù)的預(yù)先存儲(chǔ)。就像形態(tài)鑒定依據(jù)的植物志，DNA鑒定所需的植物DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)儲(chǔ)存及鑒定效果評(píng)價(jià)至關(guān)重要。對(duì)比例序列，如世緯苣苔rbcL、matK、atpI-H、rps16，缺少預(yù)先儲(chǔ)存的絕對(duì)近緣DNA數(shù)據(jù)，所以無(wú)法應(yīng)用于鑒定。另一方面，有些片段對(duì)具體物種的區(qū)分度過(guò)低，也無(wú)法應(yīng)用于鑒定；如世緯苣苔的matK序列，與其序列相似性99%的物種序列目前已達(dá)20多個(gè)，難以區(qū)分；rbcL、atpI-H、rps16序列也在植物DNA數(shù)據(jù)庫(kù)找到序列相似性較高的其他物種，區(qū)分度不夠。

DNA鑒定比之形態(tài)鑒定的優(yōu)勢(shì)主要有：受植物生長(zhǎng)期限制極小，鑒定所需采取的材料極少，同時(shí)因?yàn)樾蛄械牧炕卣鞫鴾p少了人為主觀的介入。其中對(duì)生長(zhǎng)期與材料的極小要求特征，格外適用于珍稀瀕危植物的鑒定。

單一序列片段對(duì)廣泛物種鑒定的區(qū)分度有限，需要更可靠的多序列組合鑒定條形碼，來(lái)達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。故本研究確定的ITS和trnL-F序列條形碼相互結(jié)合能達(dá)到對(duì)珍稀瀕危藥用植物世緯苣苔的快速準(zhǔn)確鑒定，為世緯苣苔的保護(hù)與研究提供了可靠依據(jù)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 劉, 明濤

<120> 一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaaatcggt agacgctacg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttgaactg gtgacacgag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtcaccac aaacagaaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgcatgtac ctgcagtagc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggtttcata gatccatctt ttc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttggaacaag ggtatcgaac 20

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tatttacaag yggtattcaa gct 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccaayccagc agcaataac 19

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaggacacg atccgytgtg gat 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgatagacgg ctcattggga ta 22

<210> 13

<211> 617

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 13

catgttcaaa cgtgcttgcg ttcgcgatgg tggatgcttc ttgcgtccaa catcacgacc 60

tcgaccccaa gcggcgcaag tctcttgggc gtaccaacct ctcggcgcgg aaagcgccaa 120

ggaaaagcat accgaacgcc tctccatcct ggtgctgttc gcggtaccca ggacgtgacg 180

aggagcgtct attgagtata gatataacga ctctcggcaa cggatatctc ggctctcgca 240

tcgatgaaga acgtagcgaa atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat 300

cgagtctttg aacgcaagtt gcgtccgaag ccatcaggct gagggcacgt ctgtctgggc 360

gtcacgcgtc tcgtcgcccc ctcccacatc ttcttccccc actcgagggt gccgggagat 420

gatggcgcac gaaggagggg cggatattgg cctcccgttg tccttgtgta gcggctggca 480

caaataacat accgtgtcga aggaagtcac acgatacgtg gtggttggat tcctcaactt 540

gcgagctgtc gtgtaggact gcatcgagcc acgggcacga cccaatggcg aaaggtcgcc 600

ctcgatcgcg accccag 617

<210> 14

<211> 838

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 14

gtgaagactt tcaaattcag agaaaccctg gaattaataa aaatgggcaa tcctgagcca 60

aatcctgttt tctcaaaaca agggttcaga gagcgaaaaa gaggataggt gcagagactc 120

aatgggagct gttctaacaa atggagttga ccgcgttggt agaaaaattg aaacttcaga 180

aaggatgaag gataaacgta tctattgaat actattgatg attaataatg gcccgaatct 240

gtatctgggt ttttgtatat gaaaaataga agaattggtg tgaattgatt tcacattgat 300

aaaagaatcg aatatttatt aatcaaatca ttcactccat agtccgatag atctcttaaa 360

gaacttatta ttcggacgag aataaagata gagtcccgtt ctacatgtca ataccggcaa 420

caatgaaact tatagtaaaa ggaaaatccg tcgactttaa aaatcgtgag ggttcaagtc 480

cctctatccc caaaaaaatc atataattga ctcccaaaat atttatccta tccgctttgt 540

tcgttaacgg ttcaaaattc ctttatcttt ctaattcttt tacaaatgtc tttggtcgta 600

aatgactttc tcttctcaca tgtgatatag aatatacatt caaagaatcc ttattagaat 660

aataatagca ttacacatac tgatacttac aaagtcgtct ttttaaagat ccaagagatt 720

agagacttgg agaaaacttt gtaattttcc cttgtccctt ataattgaca tagaccccag 780

tcccataata aaatgaggat gggatgctac attgggaatg gtcgggatag ctcagctg 838

<210> 15

<211> 636

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 15

gagtacaaat tgacttatta tactcctgaa tatgaaacta aagatactga tatcttggca 60

gcattccgag taactcctca acctggagtt ccgcctgaag aagcaggggc ggcggtagct 120

gccgaatctt ctactggtac atggacaact gtgtggaccg acgggcttac cagccttgat 180

cgttacaaag gacgatgcta ccacatcgag cccgttcctg gagaaacaga tcaatatatc 240

tgttatgtag cttacccttt agaccttttt gaagaaggtt ctgttactaa tatgtttact 300

tccattgtag gcaatgtatt tggattcaaa gcccttcgtg ctctacgtct ggaagatctg 360

cgaatcccta ctgcttatat taaaactttc caaggcccgc ctcatgggat ccaagttgaa 420

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ttattttgtg ccgaagccct ttataaagca caggct 636

<210> 16

<211> 847

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 16

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gaatttt 847

<210> 17

<211> 867

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 17

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<210> 18

<211> 760

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 18

tgaagatgct cttgtctcga catcgtttgt tctgttacac ctgaatcctt tgtttttttg 60

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