本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種氯代異香豆素(chlorinated isocoumarin)衍生物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種對(duì)香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)和水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)具有強(qiáng)抑制活性的氯代異香豆素衍生物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病害一直是農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要制約因素之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因病害造成的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的平均損失約占總產(chǎn)量的10％～15％，每年直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)上千億美元。植物病原真菌引起的病害約占植物病害的70～80％，它們?nèi)肭种参锏囊恍┎课?，引起萎蔫、壞死、腐爛等不良癥狀。例如水稻紋枯病使水稻不能抽穗或抽穗的秕谷較多，粒重下降，是當(dāng)前水稻生產(chǎn)上的主要病害之一。香蕉炭疽病使香蕉果實(shí)的果柄和表皮上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，并進(jìn)一步引起整個(gè)果實(shí)變黑腐爛，尤其在貯運(yùn)期間發(fā)病最為嚴(yán)重，造成巨大損失。因此，尋找高效安全的農(nóng)用殺菌劑防治植物真菌病害已成為維持農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮急需解決的課題。植物內(nèi)生真菌寄生在植物內(nèi)部而不引起明顯的癥狀表明其代謝產(chǎn)物對(duì)植物無(wú)毒或低毒。同時(shí)由于生活環(huán)境的不同，使其具有有別于其他來(lái)源微生物的獨(dú)特代謝方式，能夠產(chǎn)生新穎的生物活性物質(zhì)。然而，迄今為止，尚未見到從植物來(lái)源的內(nèi)生真菌中獲得有重要抗植物病原真菌活性的氯代異香豆素化合物作為殺菌劑的使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種氯代異香豆素衍生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述氯代異香豆素衍生物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述氯代異香豆素衍生物的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種氯代異香豆素衍生物，其分子式為C16H14Cl2O7，結(jié)構(gòu)式為：
所述的氯代異香豆素衍生物是一種白色針狀結(jié)晶，名稱為Dichlorodiaportinolide。
所述的氯代異香豆素衍生物的制備方法，包括以下步驟：先在菌種培養(yǎng)基中對(duì)苦檻藍(lán)(Myoporum bontioides A.Gray)內(nèi)生真菌Trichoderma sp.09進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再將菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得菌絲用乙醇-水或甲醇-水混合液浸提減壓濃縮后，用有機(jī)溶劑萃??；萃取液濃縮后進(jìn)行硅膠柱層析、Sephdex LH-20凝膠柱層析，將所得洗脫液濃縮后重結(jié)晶得到白色晶體，即為所述氯代異香豆素衍生物。
優(yōu)選的，所述的菌種培養(yǎng)基含有以下重量百分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖1.0～3.5％，酵母膏0.02～1.5％，蛋白胨0.01～1.5％，瓊脂1.0～2.5％，氯化鈉0.2～2.0％和水余量；使用時(shí)將培養(yǎng)基制成試管斜面。
更優(yōu)選的，所述的菌種培養(yǎng)基含有以下重量百分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖1.0～3.5％，酵母膏0.02～0.5％，蛋白胨0.1～1.5％，瓊脂1.0～1.5％，氯化鈉0.2～2.0％和水余量；
優(yōu)選的，所述的菌種培養(yǎng)的條件為：在20～35℃下培養(yǎng)3～10天。更優(yōu)選為在28℃下培養(yǎng)3～7天。
優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有以下重量百分?jǐn)?shù)的組分：大米10.0～70.0％，氯化鈣0.3～2.5％，氯化鈉1.0～5.5％和水余量。
更優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有以下重量百分?jǐn)?shù)的組分：大米30.0～50.0％，氯化鈣0.5～1.5％，氯化鈉1.0～2.5％和水余量。
優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：在25～30℃下培養(yǎng)30～80天。更優(yōu)選為在25～30℃下培養(yǎng)30～60天。
優(yōu)選的，所述的乙醇-水或甲醇-水混合液的體積比為100：0～80：20；更優(yōu)選為95：5～80：20。
所述的浸提的次數(shù)為2～4次。
優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯和正丁醇中的一種。
優(yōu)選的，所述的硅膠柱層析是在200～300目硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑為洗脫劑梯度洗脫，其中乙酸乙酯所占體積百分?jǐn)?shù)從0逐步增加到40％；所述的Sephdex LH-20凝膠柱層析采用流動(dòng)相體積比為石油醚:氯仿:甲醇＝2:2:1；所述的重結(jié)晶是在氯仿、丙酮或乙酸乙酯中進(jìn)行。
所述的氯代異香豆素衍生物在制備防治植物病原菌農(nóng)用殺菌劑中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述的植物病原菌為香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)和水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
本發(fā)明氯代異香豆素衍生物具有很強(qiáng)的抑制香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌的作用，可用作微生物農(nóng)用殺菌劑，而且原料可以大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例中所用到的香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、水稻紋枯病菌(即：立枯絲核菌)(Rhizoctonia solani)在專利“201110423435.3、枯草芽孢桿菌NB12及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用”中公開。
Trichoderma sp.09在文獻(xiàn)“Li Chunyuan,Gong Bing,Cox G.Daniel,Li Caili,Wang Jinhua,Ding Wcijia.Dicltlorodiaportinol A,a new chlorine-containing isocoumarin from an endophytic fungus Trichoderma sp.09 from Myoporum bontioides A.Gray and its cytotoxic activity.Pltarmacognosy magazine,10(37):s153-s158,2014.”中公開。
實(shí)施例1
通過(guò)以下步驟制備氯代異香豆素衍生物：
(1)先在培養(yǎng)基里對(duì)苦檻藍(lán)內(nèi)生真菌Trichoderma sp.09進(jìn)行菌種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有葡萄糖1.0％(重量百分?jǐn)?shù)，下同)，酵母膏0.02％，蛋白胨0.1％，瓊脂1.0％，氯化鈉0.2％，其余為水，使用時(shí)將其制成試管斜面，上述菌種在28℃下培養(yǎng)7天；
(2)再對(duì)Trichoderma sp.09進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有大米50.0％，氯化鈣1.5％，氯化鈉1.0％和水余量，于室溫25℃下靜置培養(yǎng)40天；
(3)將步驟(2)發(fā)酵好的菌株用乙醇-水混合液(95:5)浸提3次，減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取多次(乙酸乙酯可用正丁醇代替)，濃縮萃取液，在200～300目硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，其中乙酸乙酯所占體積百分?jǐn)?shù)從0逐步增加到40％；合并20％～30％石油醚/乙酸乙酯的洗脫液再用Sephdex LH-20凝膠柱層析采用流動(dòng)相體積比為石油醚:氯仿:甲醇＝2:2:1進(jìn)行分離，所得固體再用氯仿(可用丙酮、乙酸乙酯代替)進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶純化，得到白色針狀結(jié)晶，即為所述氯代異香豆素衍生物。
實(shí)施例2
通過(guò)以下步驟制備氯代異香豆素衍生物：
(1)先在培養(yǎng)基里對(duì)苦檻藍(lán)內(nèi)生真菌Trichoderma sp.09進(jìn)行菌種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有葡萄糖2.5％(重量百分?jǐn)?shù)，下同)，酵母膏0.2％，蛋白胨0.3％，瓊脂1.0％，氯化鈉0.5％，其余為水，使用時(shí)將其制成試管斜面，上述菌種在28℃下培養(yǎng)3天；
(2)再對(duì)Trichoderma sp.09進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有大米30.0％，氯化鈣1.5％，氯化鈉2.0％和水余量，于30℃下靜置培養(yǎng)60天；
(3)將步驟(2)發(fā)酵好的菌株用甲醇-水混合液(90:10)浸提2次，減壓濃縮后，用正丁醇萃取多次(正丁醇可用乙酸乙酯代替)，濃縮萃取液，在200～300目硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，其中乙酸乙酯所占體積百分?jǐn)?shù)從0逐步增加到40％；合并20％～30％石油醚/乙酸乙酯的洗脫液再用Sephdex LH-20凝膠柱層析采用流動(dòng)相體積比為石油醚:氯仿:甲醇＝2:2:1進(jìn)行分離，所得固體再用丙酮(可用氯仿、乙酸乙酯代替)進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶純化，得到白色針狀結(jié)晶，即為所述氯代異香豆素衍生物。
實(shí)施例3
通過(guò)以下步驟制備氯代異香豆素衍生物：
(1)先在培養(yǎng)基里對(duì)苦檻藍(lán)內(nèi)生真菌Trichoderma sp.09進(jìn)行菌種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有葡萄糖3.5％(重量百分?jǐn)?shù)，下同)，酵母膏0.5％，蛋白胨1.0％，瓊脂1.5％，氯化鈉1.5％，其余為水，使用時(shí)將其制成試管斜面，上述菌種在28℃下培養(yǎng)5天；
(2)再對(duì)Trichoderma sp.09進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有大米40.0％，氯化鈣0.5％，氯化鈉2.5％和水余量，于30℃下靜置培養(yǎng)50天；
(3)將步驟(2)發(fā)酵好的菌株用乙醇-水混合液(80:20)浸提4次，減壓濃縮后，用正丁醇萃取多次(正丁醇可用乙酸乙酯代替)，濃縮萃取液，在200～300目硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，其中乙酸乙酯所占體積百分?jǐn)?shù)從0逐步增加到40％；合并20％～30％石油醚/乙酸乙酯的洗脫液再用Sephdex LH-20凝膠柱層析采用流動(dòng)相體積比為石油醚:氯仿:甲醇＝2:2:1進(jìn)行分離，所得固體再用丙酮(可用氯仿、乙酸乙酯代替)進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶純化，得到白色針狀結(jié)晶，即為所述氯代異香豆素衍生物。
經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例1、2和3所得化合物氯代異香豆素衍生物Dichlorodiaportinolide的波譜數(shù)據(jù)如下：mp 185-187℃；[α]D25+17°(c 0.04,丙酮)；IR(KBr)cm-1 3382,2810,1760,1681,1625,1511,1302。UVλmax(CH3OH)nm 330,274,245。HR-ESI-MS m/z:389.0184([M+H]+,C16H15Cl2O7,calcd.389.0188)。1H-NMR(600MHz,CD3COCD3):11.02(1H,s,8-OH),6.70(1H,s,H-4),6.63(1H,d,2.4,H-5),6.52(1H,s,H-14),6.51(1H,d,2.4,H-7),5.55(1H,d,6.0,12-OH),4.74(1H,m,H-12),3.92(3H,s,6-OCH3),3.32(2H,dd,15.0Hz,8.4Hz,H-9),3.03(1H,dd,7.2Hz,15.0Hz,H-10b),2.42(1H,dd,7.2Hz,15.0Hz,H-10a)。13C-NMR(150MHz,CD3COCD3):174.7(C-13),167.0(C-1),165.6(C-6),165.3(C-8),150.9(C-3),139.1(C-4a),109.0(C-4),101.7(C-5),100.8(C-7),100.1(C-8a),85.2(C-10),76.3(C-14),67.5(C-12),55.5(C-6-OCH3),40.3(C-9),36.6(C-11)。
實(shí)施例1、2和3所得化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
實(shí)施例4
本發(fā)明化合物對(duì)香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌抑菌活性試驗(yàn)：
采用二倍稀釋法測(cè)定所得化合物對(duì)香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌的最小抑菌濃度(MIC)。待測(cè)菌株于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察試管中菌的生長(zhǎng)情況，沒(méi)有菌生長(zhǎng)的試管所對(duì)應(yīng)的濃度即為其最小抑菌濃度。多菌靈作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示本發(fā)明化合物對(duì)香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌的最小抑菌濃度分別為25μg/mL和6.25μg/mL，其中后者的活性與多菌靈(對(duì)兩菌MIC＝6.25μg/mL)一致。
實(shí)施例5
本發(fā)明化合物對(duì)水稻紋枯病菌溫室田間殺菌活性試驗(yàn)：
本發(fā)明化合物按照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》，在大棚中測(cè)試其對(duì)水稻紋枯病菌感染水稻的防治效果。結(jié)果表明本發(fā)明化合物對(duì)水稻紋枯病菌具有顯著的殺菌活性。在對(duì)感染水稻紋枯病菌的水稻進(jìn)行預(yù)防性葉面噴灑試驗(yàn)中，當(dāng)濃度為400，200，100ppm時(shí)本發(fā)明化合物對(duì)水稻紋枯的抑菌率分別為98％，96％，92％，與多菌靈活性相當(dāng)或接近(98％，98％，98％)；在對(duì)感染水稻紋枯病菌的水稻進(jìn)行治療性葉面噴灑試驗(yàn)中，當(dāng)濃度為400ppm時(shí)本發(fā)明化合物對(duì)水稻紋枯的抑菌率為90％，與多菌靈活性接近(95％)。
實(shí)施例6
本發(fā)明化合物對(duì)香蕉炭疽病菌在香蕉采后保藏的殺菌活性試驗(yàn)：
對(duì)感染香蕉炭疽病菌的香蕉進(jìn)行預(yù)防性蕉體噴灑，自然風(fēng)干后，放入室內(nèi)18℃～20℃保存14天，當(dāng)濃度為400ppm時(shí)，經(jīng)本發(fā)明化合物制劑噴灑后的好果率>80％，未噴灑本發(fā)明化合物制劑的空白對(duì)照好果率為10％。
效果實(shí)施例4，5，6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明化合物對(duì)香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌具有很強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用，可以添加各類溶劑、助劑，制成噴劑或粉劑用作農(nóng)用殺菌劑。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。