本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種工程菌及其構建方法與在制備香葉醇中的應用。
背景技術：
：香葉醇(Geraniol，3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇，C10H18O，分子量為154.2493)，又名牦牛兒醇，是從植物揮發(fā)油中發(fā)現的一種無環(huán)單萜類化合物。由于香葉醇具有溫和的玫瑰花味道，被廣泛用于花香型日用香精，GB2760-1996規(guī)定，香葉醇為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果、桃、杏、李、草莓、檸檬、姜、肉桂、肉豆蔻等香精。它被作為玫瑰系香精的主劑，是各種花香香精中不可缺少的調香原料，可用于化妝品、肥皂等。香葉醇也是生產香茅醇、紫羅蘭酮、維生素A等的原料，香葉醇形成的酯也是很好的香料。除了被用于香精，香葉醇還具有一定的藥理活性，可以用于抗菌、驅蟲以及慢性支氣管炎的臨床治療，還被證明可用于癌癥的治療。此外，由于香葉醇能量高、吸濕性低、揮發(fā)性相對較弱的特性，它還被認為是一種優(yōu)于乙醇的汽油替代品。但是天然生產的香葉醇產量有限，化學合成又存在安全問題，面對不斷增加的市場需求，微生物細胞工廠不失為一個優(yōu)良的香葉醇生產平臺。微生物合成具有成本低、產量高和產品安全而且易于操作等優(yōu)點。目前，在微生物合成香葉醇的研究中，所采用的宿主主要集中于大腸桿菌、釀酒酵母以及甲烷球菌。微生物生產香葉醇的方法最早出現于2013年，江南大學的工業(yè)生物科技實驗室通過加強前體供應的方法在釀酒酵母中實現了香葉醇的生產。隨后，不斷的有微生物生產香葉醇的成功案例出現，但大多以是大腸桿菌作為宿主。釀酒酵母作為公認的安全模式微生物，遺傳背景清楚、基因操作簡單、可進行大規(guī)模發(fā)酵生產。相比大腸桿菌，它的菌體維生素、蛋白質含量高，可作食用藥用和飼料，而且發(fā)酵過程不需要添加抗生素類物質。因此，實現香葉醇在釀酒酵母中的高產將會在香葉醇微生物生產產業(yè)化上展現極大的競爭力。然而，截至目前利用釀酒酵母合成香葉醇的報道較少且產量很低。相比于香葉醇在大腸桿菌中的產量，香葉醇在釀酒酵母中的產量仍相對較低，遠遠不能達到工業(yè)化的要求。因此，亟待開發(fā)高產香葉醇的重組釀酒酵母。技術實現要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種工程菌及其構建方法與在制備香葉醇中的應用，本發(fā)明提供的菌株能夠發(fā)酵產生香葉醇，產生香葉醇的最高濃度可達360mg/L。本發(fā)明提供了經改造的GES基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～7中任一項所示；或為SEQIDNO:1～7任一項所示核苷酸序列中經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸得到的核苷酸序列。本發(fā)明提供的GES基因分別來自7種不同的植物，其中：SEQIDNO:1所示核苷酸序列改造自細毛樟(Cinnamomumtenuipile)的GES基因(CtGES)；SEQIDNO:2所示核苷酸序列改造自甜舌草(Lippiadulcis)的GES基因(LdGES)；SEQIDNO:3所示核苷酸序列改造自葡萄(Vitisvinifera)的GES基因(VvGES)；SEQIDNO:4所示核苷酸序列改造自紫蘇檸檬桉(Perillacitriodora)的GES基因(PcGES)；SEQIDNO:5所示核苷酸序列改造自長春花(Catharanthusroseus)的GES基因(CrGES)；SEQIDNO:6、7所示核苷酸序列改造自纈草(Valerianaofficinalis)的GES基因(VoGES)；其中，SEQIDNO:6(VoGES1)與SEQIDNO:7(VoGES2)所表達GES蛋白之間只有一個氨基酸的區(qū)別；。本發(fā)明實驗表明，在酵母菌轉化如IDIl基因和tHMG基因的酵母菌中，進一步轉入SEQIDNO:1～7所示核苷酸序列的GES基因，能夠使酵母菌產生香葉醇。在SEQIDNO:1～7任一項所示的核苷酸序列中經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸得到的核苷酸序列，且能夠編碼具有GES酶活性的蛋白質的DNA分子，也在本發(fā)明的保護范圍之內。根據檢測結果分析，GES定位于葉綠體，但是釀酒酵母中沒有葉綠體，可能會導致GES不能很好地折疊從而影響其活性，所以對其定位序列進行截短。GES蛋白的膜定位序列位于N端，因此，對GES基因序列的5’端進行截短。GES蛋白的膜定位序列的長度約14～88個氨基酸。本發(fā)明實施例對LdGES、CrGES、VoGES1、VoGES2截短后的效果進行驗證，在LdGES截短N端28個氨基酸，CrGES分別截短N端14個、28個、43個氨基酸，而VoGES1、VoGES2分別截短N端58個和88個氨基酸，以表達上述截短后GES蛋白的基因轉入酵母菌，能夠進一步的提高香葉醇的產量。本發(fā)明提供的經改造的GES基因的序列為SEQIDNO:1～7任一項所示核苷酸序列的5’端的缺失一個或多個核苷酸。所述多個為42個～264個，具體為42個、69個、84個、129個、174個、264個。本發(fā)明實施例中，經改造的GES基因序列如SEQIDNO:8～15任一項所示。一些具體實施例中，在SEQIDNO:2所示核苷酸序列的5’端缺失69個核苷酸(SEQIDNO:8)；在SEQIDNO:5所示核苷酸序列的5’端缺失42個核苷酸(SEQIDNO:9)、84個核苷酸(SEQIDNO:10)、129個核苷酸(SEQIDNO:11)；在SEQIDNO:6所示核苷酸序列的5’端缺失174個核苷酸(SEQIDNO:12)、264個核苷酸(SEQIDNO:13)；在SEQIDNO:7所示核苷酸序列的5’端缺失174個核苷酸(SEQIDNO:14)、264個核苷酸(SEQIDNO:15)。實驗表明，對LdGES基因5’端截短84個核苷酸后，LdGES酶N端被截短28個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由4.53mg/L提高至127.68mg/L，提高了約28倍；對CrGES基因5’端截短42個核苷酸后，CrGES酶N端被截短14個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由42.63mg/L提高至283.36mg/L，提高了約7倍；對CrGES基因5’端截短84個核苷酸后，CrGES酶N端被截短28個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由42.63mg/L提高至295.62mg/L，提高了約7倍；對CrGES基因5’端截短129個核苷酸后，CrGES酶N端被截短43個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由42.63mg/L提高至360.06mg/L，提高了約8倍；對VoGES1基因5’端截短174個核苷酸VoGES1酶N端被截短58個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由2.73mg/L提高至102.46mg/L，提高了約37.53倍；對VoGES1基因5’端截短264個核苷酸后，VoGES1酶N端被截短88個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由2.73mg/L提高至12.41mg/L，提高了約5倍；對VoGES2基因5’端截短174個核苷酸后，VoGES2酶N端被截短58個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由9.51mg/L提高至241.28mg/L，提高了約25倍；對VoGES2基因5’端截短264個核苷酸后，VoGES2酶N端被截短88個氨基酸，轉化入酵母菌后，香葉醇的產量由9.51mg/L提高至98.54mg/L，提高了約10倍?？梢姡D化SEQIDNO:11所示核苷酸序列可將香葉醇的產量提高至360.06mg/L。轉化SEQIDNO:9～11、SEQIDNO:14任一項所示核苷酸序列可將香葉醇的產量提高至200mg/L以上。轉化SEQIDNO:8～12、SEQIDNO:14任一項所示核苷酸序列可將香葉醇的產量提高至100mg/L以上。轉化SEQIDNO:8～12、SEQIDNO:14～15任一項所示核苷酸序列可將香葉醇的產量提高至98.5mg/L以上。本發(fā)明提供的經改造的GES基因在構建產香葉醇的工程菌中的應用。本發(fā)明還提供了一種工程菌，其表達IDI1基因、tHMG基因和經改造的GES基因；所述IDI1基因的序列如SEQIDNO:16所示；所述tHMG基因序列如SEQIDNO:17所示。根據香葉醇的生物合成途徑(圖1)，HMGCoA經HMGR、IDIl、ERG20、GES作用后形成香葉醇。本發(fā)明通過使底盤菌表達IDI1基因、tHMG基因和經改造的GES基因，從而實現了在工程菌中高產香葉醇。本發(fā)明所述的工程菌選自藻類、酵母菌、霉菌或細菌。其中，酵母菌優(yōu)選解脂屬酵母、克魯維屬酵母或釀酒酵母；所述釀酒酵母選自CEN.PK系列、BY系列；所述霉菌優(yōu)選鏈霉菌；細菌優(yōu)選大腸桿菌或枯草芽孢桿菌。在本發(fā)明實施例中，其起始菌株為酵母菌CEN.PK2-1C。所述IDIl基因和tHMG基因來自酵母CEN.PK2-1基因組。所述IDIl基因和tHMG基因整合在酵母菌CEN.PK2-1C的GAL80基因位置，酵母菌CEN.PK2-1C的GAL80基因被敲除。所述經改造的GES基因采用著絲粒質粒導入。本發(fā)明提供的工程菌的基因型為CEN.PK2-1C，Δgal80::tHMG-PGAL1,10-IDI1-His3，pRS415-GPM1t-PGAL7-GES-GPDt。其中，GES的基因序列如SEQIDNO:1～7任一項所示，或為SEQIDNO:1～7任一項所示核苷酸序列中經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸得到的核苷酸序列。本發(fā)明實施例中，經改造的GES基因序列如SEQIDNO:8～15任一項所示。本發(fā)明提供的工程菌在生產香葉醇中的應用。采用本發(fā)明提供的工程菌能夠使香葉醇的產量提高至360.1mg/L。為了構建本發(fā)明提供的工程菌，本發(fā)明還提供了一種敲除盒，包括順序連接的gal80左同源臂，ADH1t終止子、GAL1/10啟動子、TDH2t終止子、His營養(yǎng)標簽，gal80右同源臂。所述gal80左同源臂的長度為400bp，gal80右同源臂的長度為400bp。作為優(yōu)選，敲除盒的骨架為pRS425K。其中，gal80左同源臂、gal80右同源臂、ADH1t終止子、GAL1/10啟動子、TDH2t終止子來自酵母CEN.PK2-1。His營養(yǎng)標簽來自酵母菌S288C。擴增gal80左同源臂的引物對如SEQIDNO:20～21所示。擴增ADH1t終止子的引物對如SEQIDNO:22～23所示。擴增GAL1,10啟動子的引物對如SEQIDNO:24～25所示。擴增TDH2t終止子的引物對如SEQIDNO:26～27所示。擴增gal80右同源臂的引物對如SEQIDNO:28～29所示。擴增His營養(yǎng)標簽的引物對如SEQIDNO:30～31所示。本發(fā)明提供的敲除盒的構建方法包括：步驟1：將gal80左同源臂，ADH1t終止子、GAL1/10啟動子、TDH2t終止子、His營養(yǎng)標簽，gal80右同源臂通過OE-PCR方法順次拼接得到片段gal80up-ADH1t-PGAL1/10-TTDH2t-His-gal80down；步驟2：將片段gal80up-ADH1t-PGAL1/10-TTDH2t-His-gal80down與多拷貝質粒pRS425K通過NotI酶切位點連接，得到Δgal80::ADH1t-PGAL1,10-TDH2t-His3敲除盒。所述OE-PCR以如SEQIDNO:20的引物為上游引物，以如SEQIDNO:31的引物為下游引物。進一步的，將IDIl和tHMG連接入敲除盒，獲得敲除盒Δgal80::ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His3，具體方法為：步驟1：將tHMG片段通過BsmBI酶切位點與敲除盒Δgal80::ADH1t-PGAL1,10-TDH2t-His3連接后經NotI酶切后回收敲除盒，將敲除盒轉移到pLD2載體上獲得含有tHMG基因的敲除盒；步驟2：將IDI1片段通過BsaI酶切位點連接到含有IDIl基因的敲除盒上，獲得pLD2-gal80up-ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His-gal80down。本發(fā)明提供的敲除盒Δgal80::ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His3在構建產香葉醇的工程菌中的應用。為了構建產香葉醇的工程菌，本發(fā)明還提供了一種含有改造后GES基因的著絲粒質粒，其構建方法和質粒圖譜如圖3所示。該著絲粒質粒以pRS415質粒為骨架，包括順序連接的GPM1t、GAL7啟動子、GES基因、GPDt。該著絲粒質粒的構建以表達盒pLD2-GPM1t-PGAL7-GPDt為起始，將經改造的GES基因通過BsaI酶切連入表達盒中得到pLD2-GPM1t-PGAL7-GES-GPDt。利用NotI酶切位點，將表達盒轉移到單拷貝質粒pRS415上。本發(fā)明對GES基因片段的制備方法不做限定，為了將GES基因連接入表達盒，在GES基因的5’端添加序列gcggccgcggtctcca(SEQIDNO:18)；3’添加序列taaaggagaccgcggccgc(SEQIDNO:19)。本發(fā)明提供的工程菌的構建方法，將IDI1基因、tHMG基因和經改造的GES基因轉化入起始菌。具體的，本發(fā)明提供的工程菌的構建方法包括：步驟1：以敲除盒Δgal80::ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His3將IDI1基因和tHMG基因轉化入起始菌獲得底盤菌；步驟2：將含有改造后GES基因的著絲粒質粒轉化入底盤菌，獲得本發(fā)明提供的工程菌。本發(fā)明中，起始菌為酵母菌，優(yōu)選的酵母菌為CEN.PK2-1C。步驟1、步驟2中所述轉化采用醋酸鋰高效轉化法。本發(fā)明還提供了一種香葉醇的制備方法，發(fā)酵本發(fā)明提供的工程菌。所述發(fā)酵為兩相發(fā)酵；所述兩相發(fā)酵的有機相采用十四酸異丙酯。本發(fā)明采用兩相發(fā)酵法盡可能減小香葉醇對釀酒酵母細胞的傷害。所述發(fā)酵的培養(yǎng)基包括：合成酵母氮源YNB6.7g/L；葡萄糖20g/L；缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L。所述十四酸異丙酯體積為發(fā)酵培養(yǎng)基的20％。所述發(fā)酵的溫度為30℃，200rpm震蕩。所述發(fā)酵具體為：以初始OD600＝0.2接種于新鮮的5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)12h左右至菌體生長至對數中期，以初始OD600＝0.2接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入體積分數為20％的十四酸異丙酯在30℃、200rpm條件下進行兩相發(fā)酵，20h時補加10g/L無水乙醇，120h后結束發(fā)酵。采用本發(fā)明提供的工程菌發(fā)酵，由于初始培養(yǎng)基中因有葡萄糖存在，GES的轉錄受到葡萄糖抑制；隨著發(fā)酵的進行，葡萄糖逐漸被消耗，發(fā)酵19h左右葡萄糖耗盡，葡萄糖抑制效應解除，在GAL80已經敲除的情況下PGAL啟動子自動開啟，GES開始轉錄并翻譯，從而逐漸積累香葉醇。利用PGAL使得菌體生長和產物生產得以分開，從而減小了產物毒性對細胞生長的不利影響，進而使香葉醇產量的進一步提升成為可能。所述發(fā)酵結束后，還包括提取的步驟。所述提取為：取十四酸異丙酯層，除水后獲得含有香葉醇的溶液。本發(fā)明提供了一種工程菌及其構建方法與在生產香葉醇中的應用，本發(fā)明提供的工程菌中表達IDI1基因、tHMG基因和經改造的GES基因。相對于現有技術中的菌株，本發(fā)明提供的工程菌產香葉醇的產量更高發(fā)酵120h，香葉醇的濃度可達360.06mg/L。附圖說明圖1示利用重組釀酒酵母合成香葉醇的路徑圖；圖2示底盤菌株敲除盒構建圖；圖3示GES基因表達盒構建圖；圖4示不同發(fā)酵環(huán)境下細胞的生長曲線圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種工程菌及其構建方法與在制備香葉醇中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明中，合成香葉醇的前體物質是GPP，GPP在香葉醇合酶(geraniolsynthase，GES)的作用下合成香葉醇。本發(fā)明采用的GES基因來源及序列如表1。本發(fā)明中，英文縮寫表示的含義如下：GES香葉醇合酶tHMG3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因IDI1異戊烯基焦磷酸異構酶gal80upGAL左同源臂gal80downGAL右同源臂PGAL1GAL1啟動子TTDH2tTDH2t終止子PGAL1/10GAL1/10啟動子△ga80l::Gal80被敲除后，被：：后面的序列取代Glucose葡萄糖Acetyl-CoA乙酰輔酶AHMG-CoA3-羥基-3甲基戊二酰輔酶mevalonate甲羥戊酸IPP異戊二烯焦磷酸DMAPP二甲基丙烯基二磷酸-三銨鹽GPP牻牛兒基焦磷酸Geraniol香葉醇ALD基因醛脫氫酶基因OE-PCR重疊延伸PCR本發(fā)明提供的釀酒酵母工程菌株及其構建方法、應用中所用質粒等生物材料均可由市場購得，引物序列均可由生物公司合成。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1構建底盤菌株以CEN.PK2-1C為初始菌株，構建敲除基因GAL80同時在GAL80位置整合idi1(SEQIDNO:16)和tHMGR(SEQIDNO:17)基因的釀酒酵母菌株CEN.PK2-1C，Δgal80::tHMG-PGAL1,10-IDI1-His3，得到最終底盤菌株SyBE_Sc020201。具體構建過程如下：構建過程中用到的引物序列如表1：表1：引物序列擴增gal80左同源臂SEQIDNO:20～21擴增ADH1t終止子SEQIDNO:22～23擴增GAL1,10啟動子SEQIDNO:24～25擴增TDH2t終止子SEQIDNO:26～27擴增gal80右同源臂SEQIDNO:28～29擴增His營養(yǎng)標簽SEQIDNO:30～31擴增OE-PCRSEQIDNO:20、31擴增基因IDI1SEQIDNO:35～36擴增基因tHMGSEQIDNO:37～38菌落PCRSEQIDNO:35-38以釀酒酵母CEN.PK2-1基因組為模板，設計上、下游引物PCR擴增gal80上下游400bp同源臂、ADH1t終止子、PGAL1,10啟動子、TDH2t終止子、His營養(yǎng)標簽，然后將gal80上游同源臂、ADH1t終止子、PGAL1,10啟動子、TDH2t終止子、His營養(yǎng)標簽、gal80下游同源臂通過OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含NotI酶切位點且在PGAL1啟動子和TDH2t終止子之間包含兩個BsaI酶切位點，在PGAL10啟動子和ADH1t終止子之間包含兩個BsmBI的片段gal80up-ADH1t-PGAL1/10-TTDH2t-His-gal80down，與多拷貝質粒pRS425K通過NotI酶切位點連接，得到Δgal80::ADH1t-PGAL1,10-TDH2t-His3敲除盒。以釀酒酵母CEN.PK2-1基因組為模板，設計上下游引物分別擴增基因IDI1和tHMG，首先將擴增得到的tHMG通過BsmBI酶切位點與敲除盒連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)TransT1中，菌落PCR篩選，提質粒進行NotI酶切驗證以及測序驗證得到正確的質粒pRS425K-gal80up-ADH1t-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His-gal80down，將該質粒經NotI酶切后回收敲除盒，將敲除盒轉移到pLD2載體上，經藍白斑篩選、菌落PCR驗證和NotI酶切驗證得正確克隆，其質粒為pLD2-gal80up-ADH1t-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His-gal80down。然后將擴增得到的IDI1通過BsaI酶切位點連接到上一步得到的質粒中進而得到pLD2-gal80up-ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His-gal80down，同樣經過測序以及酶切驗證以后得到正確的克隆。敲除盒構建完成以后，用NotI內切酶進行酶切，得到片段gal80up-ADH1t-IDI1-PGAL1/10-tHMG-TTDH2t-His-gal80down，采用醋酸鋰高效轉化法將得到的片段單獨轉化釀酒酵母菌株CEN.PK2-1C，通過GAL80左右同源序列與酵母基因組上GAL80位點發(fā)生同源重組而整合至釀酒酵母基因組上。轉化后采用SC-drop固體培養(yǎng)基(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純和富集培養(yǎng)后提取酵母基因組進行PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并命名為SyBE_Sc020201(CEN.PK2-1C，Δgal80::tHMG-PGAL1,10-IDI1-His3)。實施例2生產香葉醇釀酒酵母菌株的構建1、外源功能基因元件的獲得外源基因包括用于合成香葉醇的香葉醇合成酶基因GES：選取9種不同來源的功能基因篩選合成香葉醇最優(yōu)的基因來源(如表2)，本發(fā)明共涉及10個合成香葉醇的外源基因。上述基因均為經過釀酒酵母密碼子優(yōu)化并適當規(guī)避常用限制性酶切位點后，在基因5’端添加gcggccgcggtctcca(SEQIDNO:18)、3’添加taaaggagaccgcggccgc(SEQIDNO:19)通過人工合成得到。表2經改造CrtZ基因來源及序列其中VoGES1和VoGES2編碼的蛋白之間只有一個氨基酸的區(qū)別。5’端缺失片段的獲得方式為：通過網站http://www.cbs.dtu.dk/index.shtml預測LdGES、CrGES、VoGES的膜定位序列，并根據預測結果進行梯度截短。截短方法如下：以合成的基因LdGES、CrGES、VoGES為模板，設計上下游引物(表3)擴增得到截短且兩端帶有BsaI酶切位點的tGES。LdGES截短N端23個氨基酸，CrGES分別截短N端14個、28個、43個氨基酸，而VoGES1、VoGES2分別截短N端58個和88個氨基酸。表3擴增截短序列的上下游引物目的片段引物序列SEQIDNO:8SEQIDNO:46、SEQIDNO:47SEQIDNO:9SEQIDNO:39、SEQIDNO:42SEQIDNO:10SEQIDNO:40、SEQIDNO:42SEQIDNO:11SEQIDNO:41、SEQIDNO:42SEQIDNO:12SEQIDNO:43、SEQIDNO:45SEQIDNO:13SEQIDNO:44、SEQIDNO:45SEQIDNO:14SEQIDNO:43、SEQIDNO:45SEQIDNO:15SEQIDNO:44、SEQIDNO:452、生產香葉醇釀酒酵母菌株的構建利用實驗室已有表達盒pLD2-GPM1t-PGAL7-GPDt(其序列如SEQIDNO:48所示)，將10種人工合成的GES通過BsaI酶切連入表達盒中得到pLD2-GPM1t-PGAL7-GES-GPDt。利用NotI酶切位點，將表達盒轉移到單拷貝質粒pRS415上，轉化大腸桿菌TransT1，經過藍白斑篩選、菌落PCR驗證以及測序驗證后得到正確的克隆，其質粒為pRS415-GPM1t-PGAL7-GES-GPDt。通過醋酸鋰高效轉化法將得到的質粒分別轉入優(yōu)化后的釀酒酵母菌株SyBE_Sc020201中，轉化后采用SC-drop固體板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純和富集培養(yǎng)后進行菌落PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名：菌種命名與轉入序列對應關系如表4：表4菌種命名及轉入GES基因序列SyBE_Sc020202SEQIDNO:1SyBE_Sc020204SEQIDNO:32SyBE_Sc020205SEQIDNO:33SyBE_Sc020206SEQIDNO:2SyBE_Sc020207SEQIDNO:3SyBE_Sc020208SEQIDNO:4SyBE_Sc020209SEQIDNO:5SyBE_Sc020210SEQIDNO:6SyBE_Sc020211SEQIDNO:7SyBE_Sc020212SEQIDNO:34SyBE_Sc020215SEQIDNO:8SyBE_Sc020216SEQIDNO:9SyBE_Sc020217SEQIDNO:10SyBE_Sc020218SEQIDNO:11SyBE_Sc020219SEQIDNO:12SyBE_Sc020220SEQIDNO:13SyBE_Sc020221SEQIDNO:14SyBE_Sc020222SEQIDNO:15實施例3香葉醇的制備試驗材料：實施例2構建的生產香葉醇釀酒酵母菌株試驗方法：種子培養(yǎng)基：合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L發(fā)酵培養(yǎng)基：合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L從固體劃線平板上挑取單菌落接種于5mlSC-Leu液體培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm條件下培養(yǎng)20h左右至菌體生長達到對數中期的時候，以初始OD600＝0.2接種于新鮮的5mlSC-Leu液體培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)12h左右至菌體生長至對數中期，以初始OD600接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基Sc-Leu中，同時加入20％的十四酸異丙酯在30℃、200rpm條件下進行兩相發(fā)酵，20h時補加10g/L無水乙醇，120h后結束發(fā)酵。香葉醇提取方法：將發(fā)酵液倒入50ml離心管中，12000rpm離心5min，用移液器將上層十四酸異丙酯轉移至2ml離心管中，向其中加入適量烘干的無水硫酸鈉上下翻轉數次并靜置10min左右進行除水，最后通過0.22μm有機濾膜過濾以及正己烷稀釋后，利用GC-MS進行檢測分析。檢測結果如表5：表5各菌種香葉醇產量實驗結果：初始培養(yǎng)基中因有葡萄糖存在，GES的轉錄受到葡萄糖抑制；隨著發(fā)酵的進行，葡萄糖逐漸被消耗，發(fā)酵19h左右葡萄糖耗盡，葡萄糖抑制效應解除，在GAL80已經敲除的情況下PGAL啟動子自動開啟，GES開始轉錄并翻譯，從而逐漸積累香葉醇。利用PGAL使得菌體生長和產物生產得以分開，從而減小了產物毒性對細胞生長的不利影響，進而使香葉醇產量的進一步提升成為可能。由表4可知，未進行截短的序列轉化酵母菌后，SyBE_Sc020209的香葉醇產量最高，顯著優(yōu)于其它轉化未截短序列的酵母菌(p<0.01)。SyBE_Sc0202010和SyBE_Sc020211雖然只有一個氨基酸的差異但是產量卻相差接近4倍。由此可知，尋求最優(yōu)的基因來源，采用PGAL啟動子對于高效生產香葉醇有著積極的意義。轉化截短的序列后，大多數酵母菌株的香葉醇產量大幅提升，其中，SyBE_Sc020218的香葉醇產量高達360mg/L顯著優(yōu)于其它菌株(p<0.01)。對于三種不同截短的CrGES，香葉醇產量都有明顯提升，且按照預測結果將定位序列完全截短所得到的香葉醇產量最高，顯著優(yōu)于部分截短的菌株(p<0.01)；而LdGES、VoGES1、VoGES2截短后香葉醇產量都有一定程度的提高，但是對于VoGES1和VoGES2按照預測結果將定位序列完全截短的效果不如部分截短好。實施例4兩相發(fā)酵對細胞生長的影響1、對照菌株的構建將質粒pRS415通過醋酸鋰高效轉化法將得到的質粒分別轉入優(yōu)化后的釀酒酵母菌株SyBE_Sc020201中，轉化后采用SC-Leu固體板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養(yǎng)后進行菌落PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為SyBE_Sc020214。2、比較兩相發(fā)酵和水相發(fā)酵對細胞生長及香葉醇生產的影響試驗材料：SyBE_Sc020209、SyBE_Sc020214試驗方法：種子培養(yǎng)基：合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L發(fā)酵培養(yǎng)基：合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L從固體劃線平板上挑取單菌落接種于5mlSD-Leu液體培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm條件下培養(yǎng)20h左右至菌體生長達到對數中期的時候，以初始OD600＝0.2接種于新鮮的5mlSC-Leu液體培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)12h左右至菌體生長至對數中期，以初始OD600接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基Sc-Leu中，在30℃、200rpm條件下進行發(fā)酵。對于SyBE_Sc020209接種時分別加入20％的十四酸異丙酯或者正癸烷進行兩相發(fā)酵，對于SyBE_Sc020214接種時加入20％的十四酸異丙酯進行兩相發(fā)酵。此外，對于SyBE_Sc020209也同時用水相進行了單相發(fā)酵。19h時補加10g/L無水乙醇，120h后結束發(fā)酵。實驗結果：如圖4所示，未添加十四酸異丙酯的SyBE_Sc020209對照組在19h以后生長顯著低于實驗組，說明19h左右葡萄糖逐漸耗完，香葉醇開始積累，對細胞產生毒性而十四酸異丙酯可以很好的緩解香葉醇對細胞的毒性；添加正癸烷的實驗組細胞生長明顯不如其他組細胞，說明正癸烷對細胞有較大的毒性；添加十四酸異丙酯的SyBE_Sc020214對照組生長與添加十四酸異丙酯的SyBE_Sc020209實驗組生長基本一致，進一步說明十四酸異丙酯可以很好的緩解香葉醇產生的細胞毒性。由此可知，采用十四酸異丙酯作為有機相進行兩相發(fā)酵對于釀酒酵母高效生產香葉醇有著積極的意義。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3