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檢測腫瘤相關(guān)的50個(gè)熱點(diǎn)突變基因的捕獲文庫和試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):12347822閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:包括篩選出的207個(gè)突變基因,其基因名稱和染色體坐標(biāo)信息為:

PIK3CA 178936022~178936123

PTEN 89720698~89720821

SMAD4 48584554~48584676

RET 43613796~43613915

KDR 55972955~55973069

APC 112175146~112175266

ABL1 133738276~133738398

KIT 55561657~55561782

ERBB4 212578291~212578413

ERBB4 212589762~212589892

ERBB2 37880215~37880338

PTEN 89692812~89692937

ERBB4 212587137~212587252

PIK3CA 178938790~178938916

TP53 7573912~7574034

RB1 48955507~48955610

PDGFRA 55144075~55144200

NOTCH1 139390766~139390884

SMARCB1 24133956~24134062

CDKN2A 21971093~21971217

SMO 128850235~128850363

RET 43609063~43609195

SMO 128851501~128851625

PIK3CA 178952104~178952239

TP53 7579833~7579962

STK11 1221201~1221333

HNF1A 121431973~121432098

ATM 108206502~108206631

SMAD4 48575559~48575675

MPL 43814971~43815084

RB1 48942600~48942709

GNAS 57484399~57484502

PTEN 89624171~89624305

KDR 55960933~55961065

ATM 108155074~108155187

NPM1 170837504~170837614

FLT3 28610096~28610207

NRAS 115256507~115256582

KIT 55593418~55593548

ATM 108172363~108172473

KDR 55946091~55946206

MET 116340158~116340268

EGFR 55221795~55221917

ATM 108204573~108204683

PIK3CA 178927849~178927985

HRAS 534223~534306

FBXW7 153258904~153259021

APC 112175743~112175860

FGFR3 1808884~1809004

GNAQ 80409378~80409496

STK11 1220483~1220601

KRAS 25380245~25380363

FBXW7 153249358~153249475

PTEN 89720787~89720898

KRAS 25398189~25398302

EGFR 55241638~55241769

KDR 55980241~55980357

FGFR3 1808275~1808404

APC 112173865~112173988

ERBB4 212812073~212812181

ERBB4 212530054~212530178

SMARCB1 24145480~24145596

JAK3 17945619~17945732

PDGFRA 55152027~55152152

MET 116417430~116417540

ERBB2 37880951~37881082

ATM 108117766~108117865

ATM 108236159~108236284

BRA1 140481394~140481513

ATM 108218018~108218142

KDR 55953728~55953860

PTPN11 112888111~112888227

NOTCH1 139399337~139399459

STK11 1206980~1207102

KIT 55592143~55592251

PIK3CA 178916778~178916879

FGFR3 1806070~1806202

ABL1 133748282~133748415

EZH2 148508702~148508808

PIK3CA 178947814~178947917

KIT 55597425~55597544

AKT1 105246448~105246581

RB1 48923142~48923253

FGFR2 123274705~123274837

TP53 7578183~7578296

KIT 55599262~55599373

NRAS 115252189~115252299

ERBB2 37881327~37881451

TP53 7577018~7577149

RET 43615549~43615685

FBXW7 153247234~153247368

APC 112175318~112175441

SMAD4 48603029~48603130

KIT 55594156~55594291

JAK2 5073732~5073855

ATM 108137921~108138036

EGFR 55248968~55249088

SMAD4 48591817~48591929

FGFR1 38282143~38282252

PTEN 89717506~89717618

VHL 10183765~10183899

MLH1 37067210~37067331

ATM 108180900~108181021

CDH1 68847172~68847301

NRAS 115258678~115258813

CDH1 68835574~68835704

GNAS 57484549~57484684

APC 112174554~112174665

TP53 7578355~7578481

ABL1 133747443~133747574

MET 116403134~116403249

PTEN 89717669~89717778

CSF1R 149433573~149433707

EGFR 55211026~55211145

HNF1A 121431336~121431462

ALK 29432559~29432683

ABL1 133750297~133750423

STK11 1223017~1223142

KDR 55962447~55962546

PTEN 89685261~89685372

PIK3CA 178921462~178921573

RET 43609877~43610008

KRAS 25378552~25378656

RB1 49027098~49027217

ERBB4 212576802~212576908

RB1 48919182~48919310

FLT3 28608230~28608346

KIT 55602671~55602779

EGFR 55259510~55259626

VHL 10191422~10191536

EGFR 55232951~55233067

FGFR3 1807835~1807962

SMO 128846299~128846432

ATM 108170460~108170573

TP53 7579353~7579483

RB1 48953756~48953872

APC 112175923~112176033

SMAD4 48604661~48604772

PIK3CA 178951981~178952112

KIT 55593578~55593693

PTEN 89711807~89711930

BRA2 140453105~140453219

ERBB4 212652713~212652822

RB1 49033830~49033932

PDGFRA 55140984~55141101

FLT3 28592576~28592702

SMO 128845951~128846078

FGFR3 1803555~1803672

ATM 108236042~108236170

ATM 108200919~108201045

JAK3 17954110~17954231

PTPN11 112926838~112926959

PDGFRA 55144540~55144675

NOTCH1 139397765~139397882

PIK3CA 178928068~178928195

CDKN2A 21970943~21971064

SMAD4 48593402~48593517

ATM 108225549~108225667

SMARCB1 24143196~24143317

ATM 108119810~108119926

KDR 55955047~55955168

TP53 7577491~7577616

TP53 7578493~7578609

ATM 108123515~108123623

ALK 29443610~29443727

HRAS 533815~533928

ATM 108173618~108173740

RB1 49037828~49037944

KIT 55595452~55595581

FBXW7 153245408~153245517

FLT3 28602253~28602378

RB1 48941604~48941722

CTNNB1 41266032~41266145

ATM 108205722~108205835

JAK3 17947958~17948082

SMO 128845066~128845186

MET 116411881~116411995

APC 112175570~112175701

SMAD4 48581193~48581300

FGFR2 123279610~123279711

CSF1R 149452944~149453073

RB1 49039151~49039280

IDH2 90631827~90631952

STK11 1220313~1220448

ERBB4 212288879~212288989

KDR 55946253~55946369

AKT1 105241436~105241517

PIK3CA 178927408~178927523

SMAD4 48575071~48575194

GNA11 3118882~3119004

RET 43617317~43617431

MET 116423369~116423503

PIK3CA 178916934~178917033

SMARCB1 24176262~24176389

EGFR 55249083~55249202

KDR 55979536~55979662

MET 116339578~116339701

EGFR 55242414~55242538

FGFR2 123279420~123279542

FBXW7 153250818~153250928

FGFR1 38285854~38285973

FGFR2 123257942~123258066

VHL 10188189~10188304

CDH1 68846027~68846149

IDH1 209113103~209113210

SMAD4 48586254~48586359

SRC 36031668~36031799。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:還包括擴(kuò)增權(quán)利要求1所述207個(gè)突變基因的引物,其堿基序列如SEQ ID NO.1~414所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:還包括利用權(quán)利要求2所述的引物,用標(biāo)化的人基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、分別定量后,均一等量混合207個(gè)PCR產(chǎn)物,將混合的PCR產(chǎn)物通過進(jìn)行片斷化處理,獲得大小為70-130 bp的DNA片斷,通過表面帶有鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠來分離純化帶有生物素標(biāo)記的含有目標(biāo)基因DNA片斷,從而獲得帶有生物素標(biāo)記的捕獲文庫。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:所述進(jìn)行片斷化處理的方法為超聲波打斷法。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:所述PCR擴(kuò)增體系為:

2×GC 緩沖液 12.5uL

權(quán)利要求2所述的濃度為10uM的每組上下游引物 各0.5uL

濃度為10mM的dATP、dGTP、dCTP 各0.2uL

濃度為10mM的dTTP 0.15uL

濃度為1mM的Biotin-11-dUTP 0.5uL

Ex Taq 0.2uL

100ng標(biāo)準(zhǔn)的人基因組DNA模板 2uL

ddH2O 8.05uL

PCR擴(kuò)增條件為:

95℃、5min;95℃、30s,55℃、30s,72℃、30s,35個(gè)循環(huán);72℃、10min;4℃、∞。

6.利用權(quán)利要求1所述方法獲得的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫。

7.利用權(quán)利要求5所述的捕獲文庫制備的腫瘤相關(guān)突變基因的檢測試劑盒。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒,其特征在于:包括以下試劑:

建庫試劑:KAPA Hyper Prep Kit Illumina platforms

封閉試劑:COT DNA、封閉引物

雜交試劑:Hybridiation 緩沖液

探針:權(quán)利要求5所述的雜交捕獲文庫

生物素親和磁珠:Invitrogen Dynabeads? MyOneTM Streptavidin T1

洗脫試劑:緩沖液1×SSC,0.1% SDS, 緩沖液0.1×SSC,0.1% SDS;

富集試劑:KAPA HiFi HotStart ReadyMix,Post-LM-PCR Oligos 1&2,5uM。

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