本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成利那洛肽的方法。
背景技術(shù)：
：利那洛肽（linaclotide）為ironwood開發(fā)的新產(chǎn)品，是一種新型GC-C（腸上皮細(xì)胞尿苷酸環(huán)化酶C）受體激動劑，該化合物為14個氨基酸組成的多肽，通過固相合成技術(shù)得到。美國FDA批準(zhǔn)了利那洛肽用于治療成人慢性特發(fā)性便秘和便秘型腸易激綜合癥（IBS-C）。利那洛肽在血漿中的濃度基本無法測出，但與腸道GC-C結(jié)合后，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)鳥苷酸（cGMP）濃度升高。細(xì)胞內(nèi)cGMP升高可以刺激腸液分泌，加快胃腸道移行，從而增加排便頻率。利那洛肽結(jié)構(gòu)序列如下：H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH(3對二硫鍵為：1-6、2-10、5-13）。中國專利CN104974229A公開了一種合成利那洛肽的方法，其以ACM、Trt、tBu分別保護3對Cys進行合成，后期采用三步法氧化得到利那洛肽成品，其總收率依據(jù)記載最高可達71.2%。中國專利CN105017387A公開了一種合成利那洛肽的方法，其首先合成6肽片段，環(huán)化得到含一對二硫鍵的片段；再與另一片段肽樹脂縮合得到含一對二硫鍵的利那洛肽肽樹脂，經(jīng)裂解得到含有一對二硫鍵的利那洛肽粗肽，經(jīng)分步氧化得到環(huán)化后的利那洛肽粗品。經(jīng)純化獲得利那洛肽。其總收率依據(jù)記載最高可達59%。然而該方法采用片段縮合，分步氧化，其操作復(fù)雜，成本高，不適合方大生產(chǎn)。中國專利CN104231051A公開了一種利那洛肽的制備方法，以特殊的Cys保護基進行合成，氧化時采用EDTA和DMSO進行，氧化時間為8-15小時，其總收率依據(jù)記載最高可達32.15%。相比CN105017387A、CN104974229A專利，專利CN104231051A在總收率方面較低，但是綜合考慮工藝復(fù)雜程度，其它兩個工藝由于工藝復(fù)雜，不適合于放大生產(chǎn)。專利CN104231051A采用特殊氨基酸合成，成本較高。如何在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上簡化工藝，提高總收率，同時避免使用特殊原料，降低生產(chǎn)成本，開發(fā)出便于放大生產(chǎn)的工藝，是我們的主要研究方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成利那洛肽的方法，使得本發(fā)明所述方法能夠顯著簡化生產(chǎn)工藝，提高利那洛肽的總收率，同時減少氧化體系的體積，適合于放大生產(chǎn)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種合成利那洛肽的方法，包括以下步驟：步驟1、固相合成在SEQIDNO:1所示氨基酸序列，Thr、Cys、Asn、Tyr、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護基，在C端偶聯(lián)有樹脂載體的利那洛肽樹脂。步驟2、利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護基和樹脂載體，得到未環(huán)化的利那洛肽線性粗肽，然后采用Cystine/Cysteine的鹽酸胍氧化體系對利那洛肽線性粗肽進行氧化反應(yīng)，按照其N端到C端的氨基酸順序，形成Cys1和Cys6、Cys2和Cys10、Cys5和Cys13的二硫鍵，得到利那洛肽粗品，純化后即得到利那洛肽。在本發(fā)明所述方法中，按照利那洛肽線性肽主鏈N端至C端的氨基酸順序（即SEQIDNO:1所示氨基酸序列），如下式：H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH作為優(yōu)選，所述Cystine/Cysteine的鹽酸胍溶液pH值用Tris或鹽酸水溶液調(diào)至7.0-9.0，Cystine的濃度為0.5-5mM，Cystine和Cysteine的摩爾比為1：1~1：5，線性利那洛肽濃度為0.1-5mg/ml。更優(yōu)選的，所述Cystine/Cysteine的鹽酸胍溶液pH值用Tris或鹽酸水溶液調(diào)至7.0-9.0，Cystine的濃度為1-3mM，Cystine和Cysteine的摩爾比為1：1~1：5，線性利那洛肽濃度為0.1-5mg/ml。更進一步優(yōu)選的，所述Cystine/Cysteine的鹽酸胍溶液pH值用Tris或鹽酸水溶液調(diào)至8.5，Cystine的濃度為1-3mM，Cystine和Cysteine的摩爾比為1：1~1：5，線性利那洛肽濃度為0.1-5mg/ml。作為優(yōu)選，步驟1為：在活化體系存在下，將Fmoc-Tyr（tBu）-OH與樹脂載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護基得到H-Tyr(tBu）-樹脂載體，然后按照利那洛肽線性氨基酸序列，按照SEQIDNO:1所示氨基酸序列，從C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯(lián)有Fmoc保護基以及側(cè)鏈連有保護基的氨基酸連接到肽樹脂上，得到利那洛肽樹脂：H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-樹脂固相載體。所述剩余保護氨基酸N端保護基均為Fmoc保護基。本發(fā)明所述保護基是在多肽合成領(lǐng)域常用的保護氨基酸主鏈氨基以及側(cè)鏈上氨基、羧基、羥基、巰基等干擾合成的基團的保護基團，防止上述活性基團在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成雜質(zhì)。本發(fā)明中的N端保護基為Fmoc，對于本發(fā)明中需要保護側(cè)鏈的氨基酸來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及知曉采用常用保護基來保護氨基酸側(cè)鏈上的氨基、羧基、羥基、巰基等基團，作為優(yōu)選，本發(fā)明優(yōu)選的側(cè)鏈保護氨基酸見表1。表1Fmoc-Tyr(tBu)Fmoc-Cys(Trt)Fmoc-Thr(tBu)Fmoc-Asn(Trt)Fmoc-Glu(OtBu)在合成Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂載體中，其取代度為0.2-1.2mmol/g的樹脂，更優(yōu)選的取代值為0.3-0.7mmol/g的樹脂。在偶聯(lián)時，每個保護氨基酸用量優(yōu)選為樹脂或肽樹脂摩爾數(shù)的1.5-6倍，更優(yōu)選為2.5-3.5倍；所述偶聯(lián)反應(yīng)時間優(yōu)選為60-240分鐘，更優(yōu)選為120-180分鐘。在偶聯(lián)后，采用普通方法進行脫除N端保護基再進行下一步偶聯(lián)即可。作為優(yōu)選，所述樹脂為CTC樹脂或羥基類樹脂。更優(yōu)選地，采用羥基類樹脂，更進一步優(yōu)選，采用羥基類Wang樹脂。作為優(yōu)選，所述縮合試劑優(yōu)選為DIC、DCC、HBTU/有機堿、HATU/有機堿中的一種。所述縮合試劑的摩爾量優(yōu)選為肽樹脂中總摩爾數(shù)的1.5-6倍，更優(yōu)選為2.5-3.5倍。作為優(yōu)選，所述有機堿為：DIPEA、NMM、TEA，更優(yōu)選為DIPEA。作為優(yōu)選，本發(fā)明合成過程中，采用DMF作為溶劑。作為優(yōu)選，所述裂解采用由體積百分比為80-90%的TFA，體積百分比為1-8%的EDT，體積百分比為1%的TIS，余量為水組成的混合酸解液酸解。作為優(yōu)選，利那洛肽粗品，氧化后采用0.45μm微孔有機濾膜過濾，純化備用；采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），緩沖體系為0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取粗品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并純度達到要求的收集液得利那洛肽樣品液；采用高效液相色譜法進行換鹽，緩沖體系為0.5%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取樣品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液得利那洛肽精制液，減壓濃縮，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷凍干燥，得利那洛肽成品。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明在線性肽合成時，采用價格相對低廉的Fmoc-Cys(Trt)-OH作為反應(yīng)原料，大大降低了合成成本；環(huán)化時采用一步氧化方法制備利那洛肽，避免了分步氧化的繁瑣氧化過程；同時，本發(fā)明采用Cystine/Cysteine的鹽酸胍氧化體系，多肽濃度可達5mg/ml，可有效降低氧化體系的體積，更適合于放大生產(chǎn)；且氧化后的粗肽純度好，有利于下一步純化過程。所述方法從氧化體系方面著手，改進了利那洛肽的生產(chǎn)方法，以較簡便、較快捷的工藝步驟提高了利那洛肽的總收率，總收率在38%以上，且產(chǎn)品純度穩(wěn)定在99%以上，單一雜質(zhì)控制在0.1%以下。同時在氧化時，由于多肽濃度可提高至5mg/ml，極大地減少了氧化體系的體積，更有利于放大生產(chǎn)，相比現(xiàn)有技術(shù)更加具有實用價值和應(yīng)用前景。具體實施方式本發(fā)明公開了一種合成利那洛肽的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改經(jīng)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的化合物和制備方法進行改動和適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實施方式中，所有保護氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護氨基酸購自于蘇州天馬精細(xì)化學(xué)品有限公司，所用樹脂購自于西安藍曉科技新材料股份有限公司，申請文件中所用英文縮寫對應(yīng)的中文含義見表2.表2英文縮寫釋義英文縮寫中文名稱英文縮寫中文名稱Fmoc9-芴甲氧羰基NMMN-甲基嗎啡啉tBu叔丁基TEA三乙胺OtBu叔丁氧基PIP哌啶Trt三苯甲基DMFN,N-二甲基甲酰胺DICN,N-二異丙基碳二亞胺DMAP4-N,N-二甲基吡啶DCCN,N-二環(huán)己基碳二亞胺Cys半胱氨酸HBTU苯并三氮唑-N,N,N’,N’,-四甲基脲六氟磷酸鹽Glu谷氨酸HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N’,N’,-四甲基脲六氟磷酸酯Tyr酪氨酸CTC三苯甲基氯Pro脯氨酸DIPEAN,N-二異丙基乙胺Ala丙氨酸Cystine胱氨酸Thr蘇氨酸Cysteine半胱氨酸Gly甘氨酸下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂的合成取600g取代度為0.6mmol/g的Wang樹脂，加入DMF溶脹樹脂。取0.72molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用適量DMF溶解，加入到上述樹脂中，攪拌均勻后再加入0.72molDIC、0.72molHOBt、0.072molDMAP，攪拌反應(yīng)5小時，抽濾掉反應(yīng)液，再用DMF洗滌3次后，再用DCM洗滌3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂。其取代值為0.41mmol/g。實施例2：利那洛肽樹脂的制備取0.2mol實施例1的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，用20%PIP/DMF溶液去保護20分鐘，洗滌過濾，得到去除Fmoc的H-Tyr(tBu)-Wang樹脂。取0.25molFmoc-Cys(tBu)-OH,用適量DMF溶解后加入到裝有上述H-Tyr(tBu)-Wang樹脂的反應(yīng)器中，另取0.24molHBTU和0.25molDIPEA，分別慢慢加入到鼓氮氣的上述反應(yīng)器中。偶聯(lián)反應(yīng)30~120分鐘，反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，洗滌過濾，再用20%PIP/DMF溶液去除保護20分鐘，洗滌過濾，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang樹脂。同上法依次接入表3中剩余保護氨基酸，得到利那洛肽肽樹脂：H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang樹脂。表3編號氨基酸編號氨基酸3Fmoc-Gly9Fmoc-Cys(Trt)4Fmoc-Thr(tBu)10Fmoc-Cys(Trt)5Fmoc-Cys(Trt)11Fmoc-Tyr(tBu)6Fmoc-Ala12Fmoc-Glu(OtBu)7Fmoc-Pro13Fmoc-Cys(Trt)8Fmoc-Asn(Trt)14Fmoc-Cys(Trt)實施例3：利那洛肽線性肽粗品的制備取實施例2所得利那洛肽樹脂，加入體積比為TFA：EDT：Tis：H2O=89：5：1：5的混合酸解液（用量為每克利那洛肽樹脂加入酸解液8ml），室溫?fù)u床反應(yīng)3小時，反應(yīng)混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液后加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗滌沉淀3次，抽干得到類白色粉末，真空減壓干燥至恒重，得利那洛肽線性肽粗品325.1g，純度為78.2%。實施例4：利那洛肽粗品的制備取實施例3所得利那洛肽線性肽粗品100g，用1mMCystine/5mMCysteine的鹽酸胍溶液溶解利那洛肽線性肽粗品，并稀釋至3mg/ml，再用Tris或鹽酸水溶液調(diào)pH至8.5，慢速攪拌12小時，得到利那洛肽粗品液。實施例5：利那洛肽粗品的制備取實施例3所得利那洛肽線性肽粗品100g，用1mMCystine/5mMCysteine的鹽酸胍溶液溶解利那洛肽線性肽粗品，并稀釋至5mg/ml，再用Tris或鹽酸水溶液調(diào)pH至9.0，慢速攪拌12小時，得到利那洛肽粗品液。實施例6：利那洛肽粗品的制備取實施例3所得利那洛肽線性肽粗品100g，用1mMCystine/5mMCysteine的鹽酸胍溶液溶解利那洛肽線性肽粗品，并稀釋至5mg/ml，再用Tris或鹽酸水溶液調(diào)pH至7.0，慢速攪拌12小時，得到利那洛肽粗品液。實施例7：利那洛肽粗品的純化取實施例4所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔濾膜過濾，純化備用。采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），緩沖體系為0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取粗品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并純度達到要求的收集液得利那洛肽樣品液；采用高效液相色譜法進行換鹽，緩沖體系為0.5%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取樣品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液得利那洛肽精制液，減壓濃縮，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷凍干燥，得利那洛肽成品39.1g，總收率為41.4%，分子量：1527.8（100%M+H)，純度：99.6%，最大單一雜質(zhì)為0.07%。實施例8：利那洛肽粗品的純化取實施例5所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔濾膜過濾，純化備用。采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），緩沖體系為0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取粗品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并純度達到要求的收集液得利那洛肽樣品液；采用高效液相色譜法進行換鹽，緩沖體系為0.5%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取樣品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液得利那洛肽精制液，減壓濃縮，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷凍干燥，得利那洛肽成品38.6g，總收率為40.9%，分子量：1527.8（100%M+H)，純度：99.5%，最大單一雜質(zhì)為0.08%。實施例9：利那洛肽粗品的純化取實施例6所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔濾膜過濾，純化備用。采用高效液相色譜法進行純化，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），緩沖體系為0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取粗品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并純度達到要求的收集液得利那洛肽樣品液；采用高效液相色譜法進行換鹽，緩沖體系為0.5%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為反相LunaC18（10μm），100*250mm色譜柱流速為200ml/min，采用線性梯度洗脫。取樣品液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液得利那洛肽精制液，減壓濃縮，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷凍干燥，得利那洛肽成品36.5g，總收率為38.6%，分子量：1527.8（100%M+H)，純度：99.5%，最大單一雜質(zhì)為0.08%。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3