本發(fā)明涉及基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種基于CRISPR-Cas9的基因調(diào)控裝置及基因調(diào)控方法。
背景技術(shù)：
：真核細(xì)胞具有復(fù)雜的生物學(xué)行為，如增殖、凋亡、遷移和分化，這些均被細(xì)胞信號(hào)通路和遺傳網(wǎng)絡(luò)所密切調(diào)控。而細(xì)胞信號(hào)通路改造的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在于建立特異性輸入信號(hào)與輸出信號(hào)的密切聯(lián)系。合成生物學(xué)家為了更好地理解不同信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物學(xué)反應(yīng)的機(jī)制，已開始設(shè)計(jì)出各種具有新型信號(hào)通路的工程化細(xì)胞。近期已有相關(guān)研究對構(gòu)建新型傳感器和信號(hào)處理系統(tǒng)做出了很好的闡述及探究，但這類信號(hào)處理系統(tǒng)并不能理想地將特異性信號(hào)的檢測與內(nèi)源基因的表達(dá)建立聯(lián)系。因此，通過目前的技術(shù)手段改造細(xì)胞原有網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)仍然是一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。CRISPR-Cas系統(tǒng)由規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associatedprotein,Cas)組成，而CRISPR-Cas9技術(shù)源自于細(xì)菌Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)。備受矚目的CRISPR-Cas9是一種新興的以RNA介導(dǎo)的基因組編輯及修飾技術(shù)，通過向?qū)NA(singleguideRNA,sgRNA)導(dǎo)向DNA識(shí)別、編輯及修飾。最近，相關(guān)研究證實(shí)在大腸埃希氏大腸桿菌和人類細(xì)胞中重組的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以作為一種基因組調(diào)節(jié)工具。在這些文獻(xiàn)中，通過將效應(yīng)器與失活核酸內(nèi)切酶Cas9(endonuclease-deficientCas9)融合，達(dá)到基因轉(zhuǎn)錄抑制和激活。研究人員還設(shè)計(jì)出在藍(lán)光照射下的條件下，激活內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的光誘導(dǎo)CRISPR-Cas9系統(tǒng)。因?yàn)閟gRNA設(shè)計(jì)的便利，CRISPR-Cas9系統(tǒng)必會(huì)被在基礎(chǔ)生物學(xué)、合成生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域廣泛利用。然而，受限于復(fù)雜多樣的生物學(xué)信號(hào)，CRISPR-Cas9技術(shù)未能理想地改造內(nèi)源性基因網(wǎng)絡(luò)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調(diào)控裝置及基因調(diào)控方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調(diào)控裝置，該基因調(diào)控裝置包括一核苷酸序列，該核苷酸序列本身是一sgRNA或者經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為一sgRNA，該sgRNA在結(jié)構(gòu)上包括兩個(gè)部分：與失活Cas9蛋白結(jié)合的第一部分和連接在上述第一部分的3’端的第二部分，其中上述第一部分的5’端有一段反義序列，上述第二部分是適體序列部分，其包括配體結(jié)合部分和適體莖部；當(dāng)不存在配體時(shí)，上述反義序列與上述適體莖部配對結(jié)合；當(dāng)存在配體時(shí)，上述反義序列與上述適體莖部解離以與目標(biāo)DNA配對結(jié)合。進(jìn)一步地，上述sgRNA相對應(yīng)的DNA序列如SEQIDNO:17～50中的任一序列所示。進(jìn)一步地，上述配體是外源性配體或內(nèi)源性配體。進(jìn)一步地，上述外源性配體是茶堿或四環(huán)素，上述內(nèi)源性配體是噬菌體衣殼蛋白MS2。進(jìn)一步地，上述適體是茶堿適體、四環(huán)素適體或噬菌體衣殼蛋白MS2適體。進(jìn)一步地，上述基因調(diào)控裝置還包括一蛋白，上述蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任選地包括與上述Cas9蛋白部分融合的轉(zhuǎn)錄激活因子。進(jìn)一步地，上述轉(zhuǎn)錄激活因子是VP64蛋白。進(jìn)一步地，上述蛋白是dCas9-VP64融合蛋白和/或dCas9蛋白。進(jìn)一步地，上述基因調(diào)控裝置還包括一配體，上述配體與上述配體結(jié)合部分結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調(diào)控方法，該基因調(diào)控方法采用第一方面的基因調(diào)控裝置，上述方法包括將上述基因調(diào)控裝置導(dǎo)入細(xì)胞中，并在失活Cas9蛋白和配體分子的存在下，調(diào)控目標(biāo)DNA的表達(dá)。本發(fā)明的有益效果是：創(chuàng)造性地通過將結(jié)合特異生物信號(hào)的RNA核糖開關(guān)——適體序列部分整合到sgRNA，建立細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度與基因表達(dá)強(qiáng)度的“橋梁”，上述的重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠在識(shí)別任何生物信號(hào)的基礎(chǔ)上，激活或者沉默任何一個(gè)目標(biāo)基因，在信號(hào)配體與細(xì)胞基因之間建立人工聯(lián)系。附圖說明圖1是一種實(shí)施方式的基因表達(dá)調(diào)控方法的工作原理示意圖，包括重組sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在結(jié)構(gòu)上包括兩個(gè)部分：與失活Cas9蛋白(dCas9)結(jié)合的第一部分(M)和連接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反義序列(M1)，第二部分(N)是適體序列部分，其包括配體結(jié)合部分(N1)和適體莖部(N2)。在沒有信號(hào)A(或B)的情況下，即不存在配體時(shí)，sgRNA的反義序列(M1)與適體莖部(N2)配對結(jié)合，這時(shí)sgRNA處于“關(guān)閉”狀態(tài)；在具有信號(hào)A(或B)的情況下，即存在配體時(shí)，重組sgRNA結(jié)構(gòu)改變，狀態(tài)“打開”，此時(shí)，sgRNA的反義序列(M1)與其目標(biāo)DNA配對結(jié)合，通過dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信號(hào)的輸出生產(chǎn)。圖2是顯示外源性配體調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活與沉默的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，VEGF的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測，VEGF蛋白水平測定采用ELISA方法測定。在HEK293細(xì)胞中當(dāng)四環(huán)素(a和b)/茶堿(c和d)存在時(shí)依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGFmRNA和蛋白水的表達(dá)水平被降低/升高，該圖根據(jù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，值取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差。圖3是顯示內(nèi)源性配體調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活與沉默的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，MALAT1和UCA1的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測。在HEK293細(xì)胞中當(dāng)MS2蛋白質(zhì)存在時(shí)依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，MALAT1(a和b)和UCA1(c和d)的mRNA相對表達(dá)水平被降低/升高，該圖根據(jù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，值取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差。圖4是顯示由重組CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信號(hào)通路與NF-kB信號(hào)通路的人工聯(lián)系的結(jié)果圖，(a)重組輸入信號(hào)與輸出信號(hào)的聯(lián)系有助于建立新表型；(b)β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與NF-kB信號(hào)通路之間建立了人工聯(lián)系；(c)β-catenin/NF-kB信號(hào)通路下游基因的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測，通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4的刺激作用；通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4在轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9后的刺激作用；(d)β-catenin/NF-kB信號(hào)通路下游基因的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a的刺激作用，通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a在轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9后的刺激作用；該圖根據(jù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，值取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1示出了一種實(shí)施方式的基因表達(dá)調(diào)控方法的工作原理示意圖，包括重組sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在結(jié)構(gòu)上包括兩個(gè)部分：與失活Cas9蛋白(dCas9)結(jié)合的第一部分(M)和連接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反義序列(M1)，第二部分(N)是適體序列部分，其包括配體結(jié)合部分(N1)和適體莖部(N2)。在沒有信號(hào)A(或B)的情況下，即不存在配體時(shí)，sgRNA的反義序列(M1)與適體莖部(N2)配對結(jié)合，這時(shí)sgRNA處于“關(guān)閉”狀態(tài)；在具有信號(hào)A(或B)的情況下，即存在配體時(shí)，重組sgRNA結(jié)構(gòu)改變，狀態(tài)“打開”，此時(shí)，sgRNA的反義序列(M1)與其目標(biāo)DNA配對結(jié)合，通過dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信號(hào)的輸出生產(chǎn)。在本發(fā)明中，配體可以是外源性配體或內(nèi)源性配體。其中，外源性配體例如茶堿或四環(huán)素，內(nèi)源性配體例如噬菌體衣殼蛋白MS2。相應(yīng)地，適體可以是茶堿適體、四環(huán)素適體或噬菌體衣殼蛋白MS2適體。需要說明的是，本發(fā)明所謂的“基因調(diào)控裝置”，至少包括一核苷酸序列，該核苷酸序列本身是一sgRNA或者經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為一sgRNA，該sgRNA在結(jié)構(gòu)上具有上述描述的特點(diǎn)。也就是說，在一些情況下，本發(fā)明的基因調(diào)控裝置本身就是sgRNA，其是在CRISPR-Cas9系統(tǒng)的sgRNA的基礎(chǔ)上，經(jīng)改造得到的序列結(jié)構(gòu)，這種sgRNA通過一定的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)策略(包括但不限于電轉(zhuǎn))導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在dCas9蛋白或者與dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相應(yīng)的外源性配體或內(nèi)源性配體的存在下，即可激活或沉默相應(yīng)的目標(biāo)基因表達(dá)。在另一些情況下，本發(fā)明的基因調(diào)控裝置是通過轉(zhuǎn)錄可以得到具有上述結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的sgRNA的核苷酸序列，該核苷酸序列可以表現(xiàn)為重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，能夠轉(zhuǎn)錄出具有上述結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的sgRNA，從而在dCas9蛋白或者與dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相應(yīng)的外源性配體或內(nèi)源性配體的存在下，可激活或沉默相應(yīng)的目標(biāo)基因表達(dá)。需要特別強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明的基因調(diào)控裝置只要具有上述描述的結(jié)構(gòu)特征即可，對其具體序列并不做限制，也就是說任何一核苷酸序列，只要其是一具有上述結(jié)構(gòu)特征的sgRNA或者經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為一具有上述結(jié)構(gòu)特征的sgRNA，即可稱為本發(fā)明的基因調(diào)控裝置。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因調(diào)控裝置還包括一蛋白，該蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任選地包括與Cas9蛋白部分融合的轉(zhuǎn)錄激活因子(例如VP64蛋白)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因調(diào)控裝置還包括一配體，該配體與sgRNA的配體結(jié)合部分結(jié)合。以下通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅是示例性的，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。I.技術(shù)與方法1.基因調(diào)控元件的構(gòu)建通過分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA-dCas9-HA(Plasmid#61355,Addgene)和質(zhì)粒M-SPn-VP64(Plasmid#48674,Addgene)，令HEK293T細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)失活Cas9蛋白或Cas9-VP64融合蛋白。sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建過程：設(shè)計(jì)相關(guān)cDNA，合成后插入到質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo的BamHI/BbsI位點(diǎn)。pcDNA3-MS2的構(gòu)建過程：將MS2基因的cDNA序列插入到質(zhì)粒pcDNA3的BamHI/EcoRI。2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染T24(膀胱癌細(xì)胞)，HEK293T(人胚腎臟細(xì)胞)購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC，Manassas，USA)。細(xì)胞系用10％的胎牛血清(Invitrogen)和1％的雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)培養(yǎng)，貼壁生長，37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，0.05％胰酶消化傳代。對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Lipofectamine2000說明書，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％后，使用Lipofectamin2000試劑及質(zhì)粒的混合液處理細(xì)胞。3.RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR總RNA提取按照TRIzolRNA提取試劑(Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)操作說明進(jìn)行，Nanodrop測定總RNA的含量和濃度?？俁NA按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas,Hanover,MD)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR按照All-in-OneTMqPCRMix試劑(GeneCopoieaInc,Rockville,MD)操作說明利用ABIPRISM7000熒光定量PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)執(zhí)行。PCR循環(huán)參數(shù)如以下所示：95℃保持15分鐘,接著40個(gè)循環(huán)：94℃保持15秒，55℃保持30秒和72℃保持30秒。每次試驗(yàn)至少重復(fù)三次。內(nèi)參對照基因?yàn)镚APDH基因，所有數(shù)據(jù)均參照GPADH的表達(dá)作歸一化處理。PCR用到的引物序列如表1所示。表1.實(shí)時(shí)熒光定量qPCR所用的引物名稱序列VEGF-FACAGACACCGCTCCTAGCCC(SEQIDNO:1)VEGF-RCGAGAACAGCCCAGAAGTTGG(SEQIDNO:2)MALAT1-FAAAGCAAGGTCTCCCCACAAG(SEQIDNO:3)MALAT1-RGGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA(SEQIDNO:4)UCA1-FACGCTAACTGGCACCTTGTT(SEQIDNO:5)UCA1-RTGGGGATTACTGGGGTAGGG(SEQIDNO:6)APCDD1-FGGATCATCTATCGGTCAGACG(SEQIDNO:7)APCDD1-RTGGGTCACATCCTGCTGGATG(SEQIDNO:8)MET-FGCAGAAACCCCCATCCAGAATGTC(SEQIDNO:9)MET-RGGCCCCTGGTTTACTGACATACGC(SEQIDNO:10)DPAGT1-FCAATGCCATCAATATCCTA(SEQIDNO:11)DPAGT1-RAATCACCTTCCAACTCTA(SEQIDNO:12)BFL1-FATAACACAGGAGAATGGAT(SEQIDNO:13)BFL1-RAGTATTGCTTCAGGAGAG(SEQIDNO:14)GAPDH-FCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC(SEQIDNO:15)GAPDH-RATCCGTTGACTCCGACCTTCAC(SEQIDNO:16)4.酶聯(lián)免疫吸附測定VEGF蛋白濃度VEGF蛋白濃度測定按照酶聯(lián)免疫吸附測定操作說明進(jìn)行。簡單而言，收集并裂解106個(gè)樣本細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞上的清液。酶標(biāo)儀(Bio-Rad,Hercules,CA)通過檢測比色反應(yīng)和光密度(OD值)定量VEGF蛋白。然后OD值被轉(zhuǎn)換為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白濃度。每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少三次。II.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.信號(hào)轉(zhuǎn)換基因調(diào)控質(zhì)粒的構(gòu)建發(fā)明人基于CRISPR-Cas9及其衍生技術(shù)和核酸開關(guān)構(gòu)建一個(gè)建立外源性配體與內(nèi)源性基因人工聯(lián)系的基因調(diào)控裝置(如圖1所示)，該裝置整合了核酸開關(guān)(是指適體序列部分)和sgRNA，接受特異外源信號(hào)后，可通過dCas9和dCas9-VP64融合蛋白沉默或激活靶基因。當(dāng)特異性信號(hào)A(或B)結(jié)合適體分子結(jié)構(gòu)后可誘導(dǎo)sgRNA的反義鏈結(jié)構(gòu)改變，使其可以與其對應(yīng)的DNA序列靶向結(jié)合后干擾轉(zhuǎn)錄，最終引起另一信號(hào)B(或A)的改變。當(dāng)缺乏特異性信號(hào)時(shí)，因sgRNA反義鏈被適體的反義鏈的莖部結(jié)合，對靶基因的轉(zhuǎn)錄不具有影響。這種方法將現(xiàn)有sgRNA改變?yōu)槟軌驅(qū)⑿盘?hào)輸入與異種信號(hào)輸出聯(lián)系在一起的RNA元件。2.外源性配體可調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活與沉默為了進(jìn)一步在人HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證這種調(diào)控方法，選擇內(nèi)源性VEGF基因作為靶基因。設(shè)計(jì)了四個(gè)靶向VEGF的sgRNA，同時(shí)在每個(gè)sgRNA的3'端插入修飾后的四環(huán)素適體(適配體)。四環(huán)素適體反義鏈的莖部按前述修飾后可與sgRNA的反義鏈結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)配對。qRT-PCR和ELISA的結(jié)果表明，只有在四環(huán)素存在的條件下，dCas9和重組sgRNA復(fù)合體才具有有效的沉默效果(如圖2a所示)。當(dāng)在HEK239T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)dCas9-VP64融合蛋白時(shí)，sgRNA同樣能夠在四環(huán)素刺激下激活基因表達(dá)。加入四環(huán)素后，所設(shè)計(jì)的四個(gè)sgRNA分別跟dCas9-VP64共同表達(dá)后均可顯著提高VEGFAmRNA和蛋白表達(dá)水平(如圖2b所示)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種模塊化設(shè)計(jì)方法的有效性，通過用茶堿適體代替四環(huán)素適體來改造sgRNA。而改造后的sgRNA的莖部與先前設(shè)計(jì)的序列保持一致。當(dāng)茶堿適體sgRNA與dCas9或dCas9-VP64共同表達(dá)時(shí)，且在茶堿刺激下得到與上述類似的效應(yīng)(如圖2c和2d所示)。圖2中，VEGF的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測，VEGF蛋白水平測定采用ELISA方法測定。在HEK293T細(xì)胞中當(dāng)四環(huán)素(圖a和圖b)/茶堿(圖c和圖d)存在時(shí)，依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平被降低/升高。根據(jù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，值取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差。圖a中，左圖的縱坐標(biāo)表示VEGFmRNA相對表達(dá)水平，坐標(biāo)值由下至上分別是0.0、0.2、0.4～1.2；右圖的縱坐標(biāo)表示VEGA蛋白水平，坐標(biāo)值由下至上分別是0、100、200～600，單位是pg/ml；空白柱表示Tetracycline(-)，即沒有四環(huán)素刺激；實(shí)心柱表示Tetracycline(+)，即有四環(huán)素刺激；對于橫坐標(biāo)，從左至右分別是dCas9、dCas9+sgRNA1、dCas9+sgRNA2、dCas9+sgRNA3和dCas9+sgRNA4。圖b中和圖a的區(qū)別是，左圖的縱坐標(biāo)值由下到上是0、1、2～10，右圖的縱坐標(biāo)值由下至上是0、500、1000～2500，橫坐標(biāo)上，從左至右分別是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA5、dCas9-VP64+sgRNA6、dCas9-VP64+sgRNA7和dCas9-VP64+sgRNA8。圖c和圖a的主要區(qū)別是橫坐標(biāo)分別是dCas9、dCas9+sgRNA9、dCas9+sgRNA10、dCas9+sgRNA11和dCas9+sgRNA12。圖d和圖b的主要區(qū)別是橫坐標(biāo)分別是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA13、dCas9-VP64+sgRNA14、dCas9-VP64+sgRNA15和dCas9-VP64+sgRNA16。sgRNA1～16的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:17～32所示。3.內(nèi)源性配體調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活與沉默。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能否對內(nèi)源性蛋白進(jìn)行應(yīng)答并調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，將噬菌體衣殼蛋白MS2適體整合到sgRNA的相應(yīng)結(jié)構(gòu)上并測試其相應(yīng)的效應(yīng)。選擇長鏈非編碼RNAMALAT1和UCA1作為靶基因。在HEK293T細(xì)胞測試中，表達(dá)MS2和重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)與不表達(dá)MS2或不表達(dá)sgRNA的系統(tǒng)對比，MALAT1的表達(dá)具有差異性。其中表達(dá)dCas9可誘導(dǎo)沉默MALAT1表達(dá)(如圖3a所示)，而表達(dá)dCas9-VP64可誘導(dǎo)激活MALAT1表達(dá)(如圖3b所示)。當(dāng)靶基因改為UCA1時(shí)，通過重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)取得了同樣的效果(如圖3c和3d所示)。以上數(shù)據(jù)提示通過重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)可建立出內(nèi)源性蛋白與基因表達(dá)之間的人工聯(lián)系。圖3中，sgRNA17～32的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:33～48所示。4.β-catenin信號(hào)通路與NF-kB信號(hào)通路的人工聯(lián)系按以往經(jīng)驗(yàn)，合成生物學(xué)家為了在細(xì)胞創(chuàng)造出新功能，常設(shè)計(jì)出可替代的基因網(wǎng)絡(luò)。由于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠有效地在兩個(gè)特異性信號(hào)建立全新的聯(lián)系，因此發(fā)明人便嘗試重塑細(xì)胞經(jīng)典信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(如圖4a所示)。通過這種方法，在β-catenin信號(hào)通路和NF-kB信號(hào)通路之間建立兩種類型的人工聯(lián)系。在這次設(shè)計(jì)中，β-catenin信號(hào)的激活可以激活NF-kB信號(hào)通路，而NF-kB信號(hào)被激活時(shí)可抑制β-catenin信號(hào)通路(如圖4b所示)。將β-catenin或NF-kB適體與sgRNA結(jié)合來識(shí)別NF-kB(p65)或β-catenin(CTNNB1)，并在膀胱癌細(xì)胞系T24中表達(dá)dCas9或dCas9-VP64。結(jié)果表明當(dāng)在細(xì)胞中加入β-catenin激活劑LTD4時(shí)，β-catenin的下游基因(DPAGT1和APCDD1)表達(dá)水平提高。與陰性對照相比，僅在重組CRISPR-Cas9作用下LTD4可以明顯提高NF-kB的下游基因(BFL1和MET)的mRNA表達(dá)水平(如圖4c所示)。通過檢測BFL1和MET的表達(dá)水平來檢測TNF-a對NF-kB信號(hào)通路的刺激作用。在實(shí)驗(yàn)組和對照組中，在TNF-a刺激下以上兩個(gè)基因表對均明顯提高。與此同時(shí)，僅dCas9實(shí)驗(yàn)組中DPAGT1和APCDD1mRNA表達(dá)水平測明顯下調(diào)(如圖4d所示)。以上結(jié)果均證實(shí)該基因調(diào)控模式可以有效地重新改編細(xì)胞內(nèi)源性的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。圖4中，sgRNA33～34的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:49～50所示。圖4由重組CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信號(hào)通路與NF-kB信號(hào)通路的人工聯(lián)系。(a)重組輸入信號(hào)與輸出信號(hào)的聯(lián)系有助于建立新表型。(b)β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與NF-kB信號(hào)通路之間建立了人工聯(lián)系。(c)β-catenin/NF-kB信號(hào)通路下游基因的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4的刺激作用。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4在轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9后的刺激作用。(d)β-catenin/NF-kB信號(hào)通路下游基因的mRNA相對表達(dá)水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a的刺激作用。通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a在轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9后的刺激作用。根據(jù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，值取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差。表2sgRNAs對應(yīng)的DNA序列注：本發(fā)明中，sgRNA對應(yīng)的DNA序列以表2所記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。5.結(jié)論在本次研究中，結(jié)果證實(shí)重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)可創(chuàng)造出對自設(shè)信號(hào)進(jìn)行特異性應(yīng)答的細(xì)胞。通過這種方法將更好地理解自然基因網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)原則。受益于細(xì)胞信號(hào)編輯技術(shù)的進(jìn)步，各種強(qiáng)大的應(yīng)用將會(huì)呈現(xiàn)在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域中。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。當(dāng)前第1頁1 2 3