本發(fā)明涉及高分子聚合物領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的交替殘基組成的雜多糖。在體內(nèi)正常生理?xiàng)l件下，透明質(zhì)酸的糖醛酸分子上羧基與體內(nèi)鈉離子結(jié)合而形成透明質(zhì)酸鈉。獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)使透明質(zhì)酸鈉在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，例如促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、心血管形成、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合等。

未經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)很容易被透明質(zhì)酸酶等降解，降解吸收速度較快，從而影響其在臨床上的應(yīng)用。因此，可以通過(guò)交聯(lián)使透明質(zhì)酸鈉分子鏈加大，以延長(zhǎng)其在體內(nèi)降解時(shí)間，從而擴(kuò)大其在臨床的應(yīng)用范圍。

透明質(zhì)酸鈉的自身交聯(lián)是指透明質(zhì)酸鈉的羧基經(jīng)交聯(lián)劑活化后，與相同或不同的透明質(zhì)酸鈉的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)。與其他交聯(lián)反應(yīng)相比，透明質(zhì)酸鈉的自身交聯(lián)產(chǎn)物中無(wú)交聯(lián)劑分子嵌入，因此其生物相容性與未經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸鈉分子一致，但是由于其分子鏈的增大，其力學(xué)性能增強(qiáng)，水溶性相對(duì)降低，從而使其在體內(nèi)的降解時(shí)間延長(zhǎng)。

透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠目前在組織填充方面有廣泛的應(yīng)用。上市的產(chǎn)品中，常用的交聯(lián)劑包括1,4-二丁基二縮水甘油醚(BDDE)，二乙烯基砜，1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷等。雖然交聯(lián)后的透明質(zhì)酸表現(xiàn)出良好的耐酶解性能，在體內(nèi)的降解時(shí)間得到延長(zhǎng)，但是交聯(lián)劑的使用難免帶來(lái)生物安全性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，許多研究致力于在減少交聯(lián)劑使用的前提下，保持透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠良好的物理化學(xué)性質(zhì)，從而能更好的使用在臨床上。

瑞藍(lán)(Restylane)等市面上常見(jiàn)的軟組織填充產(chǎn)品一般使用BDDE單一的交聯(lián)劑，而目前未修飾的透明質(zhì)酸分子量一般不超過(guò)百萬(wàn)的級(jí)別。因此為了延長(zhǎng)透明質(zhì)酸凝膠的降解時(shí)間，又保證極低的交聯(lián)劑殘留量，需要嚴(yán)格控制交聯(lián)劑的使用量和復(fù)雜的交聯(lián)劑去除工藝。

專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1200951C采用多種交聯(lián)劑制備透明質(zhì)酸多重交聯(lián)產(chǎn)物。該專(zhuān)利公布了使用不同類(lèi)型的交聯(lián)劑，分別對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行醚化、酯化、酰胺化等不同方式的修飾。但是，透明質(zhì)酸不同基團(tuán)與交聯(lián)劑反應(yīng)的條件不同，例如醚化反應(yīng)常在堿性環(huán)境中發(fā)生，而酯化反應(yīng)常在酸性或中性的條件下發(fā)生。另外，多種交聯(lián)劑的添加，增加了產(chǎn)物的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102863631A使用含環(huán)氧基的長(zhǎng)鏈烷烴及含環(huán)氧基的交聯(lián)劑制備交聯(lián)質(zhì)酸凝膠。該專(zhuān)利制備的透明質(zhì)酸凝膠的羧基連接含有6-18個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈烷烴，同時(shí)透明質(zhì)酸的羥基通過(guò)含環(huán)氧基的交聯(lián)劑連接。長(zhǎng)鏈烷烴的引入并不能明顯增加透明質(zhì)酸的分子量，只是增加了其疏水的性能。另外，透明質(zhì)酸鈉的羧基直接與長(zhǎng)鏈烷烴發(fā)生反應(yīng)的效率并不高，且根據(jù)經(jīng)驗(yàn)此反應(yīng)過(guò)程通常是在非質(zhì)子化溶劑，如二甲基亞砜(DMSO)中進(jìn)行，因此增加了反應(yīng)的復(fù)雜程度。

專(zhuān)利文獻(xiàn)CN104086788A在兩種pH條件下制備兩種不同交聯(lián)度的凝膠，再通過(guò)混合使兩種凝膠進(jìn)行二次交聯(lián)。兩種不同交聯(lián)度的凝膠都是使用同一種交聯(lián)劑制備而得，通過(guò)交聯(lián)劑的添加量不同，得到交聯(lián)程度不同的凝膠。但是二次交聯(lián)是通過(guò)透明質(zhì)酸網(wǎng)狀穿插來(lái)實(shí)現(xiàn)的，交聯(lián)度很難量化，因此不利于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化。另外，該專(zhuān)利公布的二次交聯(lián)技術(shù)使用同一種交聯(lián)劑，因此在減少交聯(lián)劑使用量方面，并沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠的制備方法。本發(fā)明將透明質(zhì)酸常規(guī)的交聯(lián)技術(shù)與自交聯(lián)工藝相結(jié)合，從而在減少常規(guī)交聯(lián)劑的使用情況下，使透明質(zhì)酸表現(xiàn)出更加優(yōu)異的凝膠性能。本發(fā)明提供的方法可以降低交聯(lián)劑的用量，增加透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠的生物相容性，從而保證了臨床應(yīng)用時(shí)的安全性。

具體而言，本發(fā)明提供的方法包括：以透明質(zhì)酸或其鹽為原料，在自交聯(lián)催化劑的作用下進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)以及與交聯(lián)劑進(jìn)行分子間交聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明所述自交聯(lián)反應(yīng)與分子間交聯(lián)反應(yīng)依次進(jìn)行，且二者的先后順序不限。

其中，所述交聯(lián)反應(yīng)為本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的反應(yīng)。所述自交聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選為：向反應(yīng)體系中加入自交聯(lián)催化劑，于0℃～80℃發(fā)生自交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后在水中對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析，透析后的溶液干燥后即可。

本發(fā)明所述透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為50萬(wàn)～200萬(wàn)道爾頓，優(yōu)選為80萬(wàn)～120萬(wàn)道爾頓。在實(shí)際操作中，所述透明質(zhì)酸或其鹽可選用透明質(zhì)酸鈉。

本發(fā)明采用的自交聯(lián)催化劑為水溶性碳化二亞胺或2-氯-N-吡啶鹽；優(yōu)選為二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、2-氯-N-十二烷基吡啶鹽碘化物或2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物；更優(yōu)選為2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述自交聯(lián)催化劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1：2～100，優(yōu)選為1:50～100。

本發(fā)明采用的交聯(lián)劑可選用與透明質(zhì)酸或其鹽發(fā)生酯化、醚化、酰胺化等反應(yīng)的交聯(lián)劑，優(yōu)選為酯化交聯(lián)劑或醚化交聯(lián)劑，進(jìn)一步優(yōu)選為醚化交聯(lián)劑。根據(jù)交聯(lián)反應(yīng)類(lèi)型不同，其使用的交聯(lián)劑和交聯(lián)反應(yīng)條件也不同。酯化反應(yīng)一般是透明質(zhì)酸的羧基在酸性或中性條件下發(fā)生的，交聯(lián)劑可以選擇多元醇、碳化二亞胺或雙/多環(huán)氧化物。醚化反應(yīng)一般是透明質(zhì)酸的羧基在中性或者堿性的條件下發(fā)生的，交聯(lián)劑可以選擇戊二醛、二乙烯基砜、1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷或1,4丁二醇二縮水甘油醚。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述交聯(lián)劑優(yōu)選為醚化交聯(lián)劑，即所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽發(fā)生醚化反應(yīng)；具體可選用二乙烯基砜、1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷或1,4丁二醇二縮水甘油醚。采用上述優(yōu)選的交聯(lián)劑可確保自交聯(lián)反應(yīng)與交聯(lián)反應(yīng)更好地發(fā)揮協(xié)同作用，制備得到的凝膠具有更好的彈性模量和更低的降解率。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1：2～200。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述方法包括以下步驟：

(1)在透明質(zhì)酸或其鹽溶液中加入自交聯(lián)催化劑，充分反應(yīng)后，透析去除所述自交聯(lián)催化劑，得自交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)在所述自交聯(lián)產(chǎn)物的溶液中加入交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1：2～200；充分反應(yīng)后，即得。

上述反應(yīng)過(guò)程中，步驟(1)所述透明質(zhì)酸或其鹽溶液的濃度優(yōu)選為0.5％-2.5％，優(yōu)選為0.5～1.5％；所述溶液中，采用的溶劑為水。所述自交聯(lián)催化劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1：2～100，優(yōu)選為1：50～100。

進(jìn)行步驟(2)的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，所述自交聯(lián)產(chǎn)物溶液的濃度1％-5％，優(yōu)選為2.5-5％；所述溶液中，采用的溶劑為酸溶液(如0.5％的HCl溶液)或堿溶液(如0.5％的NaOH溶液)。所述交聯(lián)劑與步驟(1)中使用的起始透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1:2～200，優(yōu)選為1:80～200。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

(1)將分子量為80～100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于水中，充分?jǐn)嚢瑁苽涑蓾舛葹?.5～1.5％的透明質(zhì)酸鈉溶液；向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加2-氯-N-吡啶鹽，所述2-氯-N-吡啶鹽與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1：50～100，充分?jǐn)嚢韬箪o置反應(yīng)；透析去除2-氯-N-吡啶鹽，干燥，得自交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述自交聯(lián)產(chǎn)物溶解于酸或堿溶液中，充分?jǐn)嚢瑁苽涑蓾舛葹?～5％的溶液，加熱至30～50℃后，緩慢滴加酯化交聯(lián)劑或醚化交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑與步驟(1)所述透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100～200，充分?jǐn)嚢韬箪o置反應(yīng)，去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑，干燥，即得。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述方法包括以下步驟：

(1)在透明質(zhì)酸或其鹽溶液中加入交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1：2～200；充分反應(yīng)后，得交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)在所述交聯(lián)產(chǎn)物的溶液中加入自交聯(lián)催化劑，充分反應(yīng)后，透析去除所述自交聯(lián)催化劑，即得。

上述反應(yīng)過(guò)程中，步驟(1)所述透明質(zhì)酸或其鹽溶液的濃度優(yōu)選為0.2％～8％，優(yōu)選為3～6％；所述溶液中，采用的溶劑為酸溶液(如0.5％的HCl溶液)或堿溶液(如0.5％的NaOH溶液)。所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1:2～200，優(yōu)選為1:100～200。

進(jìn)行步驟(2)的自交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，所述交聯(lián)產(chǎn)物溶液的濃度0.2％～5％，優(yōu)選為0.5～2％；所述溶液中，采用的溶劑為水。所述自交聯(lián)催化劑與步驟(1)中使用的起始透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為1：2～100，優(yōu)選為1：50～100。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

(1)將分子量為80～100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于酸或堿溶液中，充分?jǐn)嚢?，制備成濃度?～5％的透明質(zhì)酸鈉溶液；在40～60℃條件下向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加酯化交聯(lián)劑或醚化交聯(lián)劑，使所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100～200，在40～60℃下充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)，去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑，干燥，得到交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述交聯(lián)產(chǎn)物溶解于水中，充分?jǐn)嚢?，配置成濃度?.8～1.2％的溶液，向所述溶液中緩慢滴加2-氯-N-吡啶鹽，使所述2-氯-N-吡啶鹽與步驟(1)所述透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:50～100，充分?jǐn)嚢韬箪o置反應(yīng)；透析去除2-氯-N-吡啶鹽，干燥，即得。

作為本發(fā)明的最優(yōu)選方案，所述方法包括以下步驟：

(1)將分子量為80～100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于水中，充分?jǐn)嚢瑁苽涑蓾舛葹?.5～1.5％的透明質(zhì)酸鈉溶液；向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，所述2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1：50～100，充分?jǐn)嚢韬箪o置反應(yīng)；透析去除2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，干燥，得自交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述自交聯(lián)產(chǎn)物溶解于堿溶液中，充分?jǐn)嚢瑁苽涑蓾舛葹?～5％的溶液，加熱至30～50℃后，緩慢滴加1,4丁二醇二縮水甘油醚，所述1,4丁二醇二縮水甘油醚與步驟(1)所述透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100～200，充分?jǐn)嚢韬箪o置反應(yīng)，去除未反應(yīng)的1,4丁二醇二縮水甘油醚，干燥，即得。

為了獲得能夠?qū)嶋H應(yīng)用的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠，進(jìn)一步滿(mǎn)足軟組織填充的需要，本發(fā)明所述方法還包括對(duì)上述方法制備而成的凝膠進(jìn)行進(jìn)一步處理。

具體為：將上述方法制備而成的凝膠放置于磷酸緩沖液(pH7.0～7.4)中充分溶脹，然后將溶脹的凝膠粉碎過(guò)篩，收集粒徑范圍在200～700μm的凝膠顆粒，同潤(rùn)滑劑進(jìn)行混合，裝入滅菌后的一次性注射器中，使用高壓蒸汽滅菌，既得用于組織填充的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

或，將上述方法制備而成的凝膠放置于磷酸緩沖液(pH 7.0～7.4)中充分溶脹，然后將溶脹的凝膠機(jī)械粉碎，不通過(guò)篩分直接同潤(rùn)滑劑進(jìn)行混合?；旌虾笱b入滅菌后的一次性注射器中，使用高壓蒸汽滅菌，既得用于組織填充的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

其中，所述潤(rùn)滑劑為未交聯(lián)的透明質(zhì)酸、注射用水或注射用生理鹽水。

本發(fā)明同時(shí)保護(hù)所述方法制備而成的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠能夠滿(mǎn)足軟組織填充的需要，本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠在制備軟組織填充材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的方法將透明質(zhì)酸常規(guī)的交聯(lián)技術(shù)與自交聯(lián)工藝相結(jié)合，有效的降低了常規(guī)交聯(lián)劑的使用量，在減少常規(guī)交聯(lián)劑的使用情況下，使透明質(zhì)酸表現(xiàn)出更加優(yōu)異的凝膠性能，使用本發(fā)明方法制備的透明質(zhì)酸凝膠能夠滿(mǎn)足組織填充所要求的理化性能和生物相容性。

經(jīng)比較，本發(fā)明提供的方法中交聯(lián)劑的用量比單獨(dú)使用常規(guī)交聯(lián)劑進(jìn)行分子間交聯(lián)時(shí)交聯(lián)劑的用量降低3～5倍，由于交聯(lián)劑的使用量減少，且自交聯(lián)反應(yīng)中的自交聯(lián)催化劑并不會(huì)融入透明質(zhì)酸凝膠的結(jié)構(gòu)中，大大降低了產(chǎn)物的毒性，使本發(fā)明提供的方法制備的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠具有良好的生物相容性，且具有更加優(yōu)異的凝膠性能，確保本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠能夠滿(mǎn)足軟組織填充的材料的技術(shù)要求。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

按照以下步驟制備透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠：

(1)將分子量為100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于純化水中，制備成濃度為1.5％的溶液，攪拌使透明質(zhì)酸鈉充分溶解；向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)，使CMPI與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:50，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，室溫靜置12h；使用透析袋對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，定時(shí)更換一次透析用純化水，去除CMPI，冷凍干燥得到自交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述自交聯(lián)產(chǎn)物溶解于0.5％NaOH中，配置成4％溶液。加熱至40℃后緩慢滴加交聯(lián)劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE),使加入BDDE與初始透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100。充分?jǐn)嚢韬箪o置12h，乙醇沉淀除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，干燥得到透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

實(shí)施例2

按照以下步驟制備透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠：

(1)將分子量為100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于純化水中，制備成濃度為2％的溶液，攪拌使透明質(zhì)酸鈉充分溶解；向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)，使CMPI與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，室溫靜置12h；使用透析袋對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，定時(shí)更換一次透析用純化水，去除CMPI，冷凍干燥得到自交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述自交聯(lián)產(chǎn)物溶解于0.5％HCl中，配置成4％溶液。緩慢滴加碳化二亞胺(EDC)，使加入EDC與初始透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:80，充分?jǐn)嚢韬箪o置12h；采用乙醇進(jìn)行沉淀，將沉淀產(chǎn)物裝入透析袋透析除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，干燥得到透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

實(shí)施例3

按照以下步驟制備透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠：

(1)將分子量為100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于0.5％NaOH中，制備成濃度為4％的溶液，攪拌使透明質(zhì)酸鈉充分溶解；在50℃條件下向所述透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)，使BDDE與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:100，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?0℃攪拌5h；乙醇沉淀除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，干燥得到交聯(lián)產(chǎn)物；

(2)將所述交聯(lián)產(chǎn)物溶解于純化水中，配置成1％溶液，向溶液中緩慢滴加2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)，使CMPI與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:50，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，室溫靜置12h；使用透析袋對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，定時(shí)更換一次透析用純化水，去除CMPI，干燥得到透明質(zhì)酸交聯(lián)凝膠。

對(duì)比例1

分子量為100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于0.5％NaOH中，制備成濃度為4％的溶液。攪拌使透明質(zhì)酸鈉充分溶解。在50℃條件下向透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)，使BDDE與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1:20，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?0℃攪拌5h。乙醇沉淀除去交聯(lián)劑，干燥得到交聯(lián)產(chǎn)物。

對(duì)比例2

將分子量為100萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于純化水中，制備成濃度為2％的溶液，攪拌使透明質(zhì)酸鈉充分溶解，向透明質(zhì)酸鈉溶液中緩慢滴加2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)，使CMPI與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為1：25，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，室溫靜置12h，使用透析袋對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，定時(shí)更換一次透析用純化水，去除CMPI，冷凍干燥得到自交聯(lián)產(chǎn)物。

取實(shí)施例1～3和對(duì)比例1、2制備得到的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠，分別檢測(cè)其流變特性和體外降解率。其中，流變特性是評(píng)價(jià)凝膠粘彈性能的重要指標(biāo)之一，包括凝膠的彈性模量(G’)表征，G’高表示凝膠更具有彈性，凝膠硬度大；在相同制備工藝下，交聯(lián)程度越高，凝膠表現(xiàn)出越大的彈性，即G’越高。體外降解是衡量透明質(zhì)酸交聯(lián)程度和分子量大小的指標(biāo)之一，體外降解速率越慢，說(shuō)明凝膠的三維結(jié)構(gòu)越緊密，分子量越大。

所述指標(biāo)的檢測(cè)方法具體為：

(1)G’：通過(guò)旋轉(zhuǎn)流變儀檢測(cè)，取頻率掃描0.1HZ處的G’。

(2)體外降解率：稱(chēng)取凝膠0.1g，充分膨脹后放置于10ml含有透明質(zhì)酸酶的PBS溶液中，透明質(zhì)酸酶含量為50units/ml。酶解24小時(shí)候，過(guò)濾，使用葡萄糖醛酸發(fā)檢測(cè)濾液中游離透明質(zhì)酸含量。

檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1：透明質(zhì)酸鈉凝膠性能檢測(cè)結(jié)果

由表1所示結(jié)果可知，實(shí)施例1～3制備得到的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠的彈性模量?jī)?yōu)于對(duì)比例1和2，且24小時(shí)內(nèi)的降解率低于對(duì)比例1和2。且實(shí)施例1～3使用的常規(guī)交聯(lián)劑是對(duì)比例1的1/4-1/5，證明本發(fā)明提供的方案能夠在減少分子間交聯(lián)劑使用的條件下，制備出性能更加優(yōu)異的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1得到的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠放置于磷酸緩沖液(pH7.0～7.4)中充分溶脹，然后將溶脹的凝膠粉碎過(guò)篩，收集粒徑范圍在200～350μm的凝膠顆粒，同未交聯(lián)的透明質(zhì)酸進(jìn)行混合，混合后未交聯(lián)透明質(zhì)酸含量為4mg/ml，混合后裝入滅菌后的一次性注射器中，使用高壓蒸汽滅菌121℃滅菌15min，即得。

參照YYT 0962-2014整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)本實(shí)施例所得的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2：透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠性能檢測(cè)結(jié)果

由表2所得結(jié)果可知，本實(shí)施例所得的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)凝膠性能優(yōu)異，可用于軟組織填充。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。