本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及從干燥的杜仲葉中分離得到的一種新的內(nèi)酯化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.屬被子植物門，杜仲科，杜仲屬，落葉喬木，高達(dá)20m，樹(shù)皮灰褐色，連同枝、葉、根均含膠，折斷有銀白色細(xì)絲。葉橢圓或橢圓伏卵型，長(zhǎng)6～18cm，邊緣有鋸齒，下邊脈上有毛，葉柄長(zhǎng)1～2cm，果為翅果扁平而薄，內(nèi)含一種子。杜仲作為中藥在我國(guó)已有2000多年的藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》均將其列為上品，其具有多種功效，主要用于治療腎虛腰痛，筋骨無(wú)力，妊娠漏血，胎動(dòng)不安，高血壓癥。

近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)杜仲化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，目前分離得到并經(jīng)鑒定的有機(jī)化合物有70種以上，無(wú)機(jī)礦物元素不少于15種。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲皮、花、葉和枝條等各部分中含有相似的化學(xué)成分，主要包括木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類和甾體類等有機(jī)化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)證明，杜仲具有多種功能活性，如降血壓、抗衰老、抗癌、抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎，利尿、鎮(zhèn)靜、安神，抗病毒作用，增強(qiáng)機(jī)體非特異免疫力，并能對(duì)細(xì)胞免疫進(jìn)行雙相調(diào)節(jié)等功效，另外對(duì)神經(jīng)中樞也有一定作用。杜仲也因其顯著的生理活性得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。

現(xiàn)代研究表明，有些植物不但具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，還具有非特異性的抗病毒功能。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-Adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAH水解酶)是一類具有獨(dú)特廣譜抗病毒活性的腺苷衍生物的作用靶，尤其是抗出血熱病毒抑制劑的目的靶，廣泛存在于脊椎動(dòng)物(如人、牛、狗、兔、大鼠、小鼠)、植物、真菌及其他微生物細(xì)胞內(nèi)，具有重要的生理功能。SAH水解酶與轉(zhuǎn)甲基作用密切相關(guān)，真核細(xì)胞及病毒mRNA 5’-末端必須具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，才能進(jìn)行翻譯。mRNA 5’-末端甲基化依賴于腺苷甲硫氨酸的多種甲基轉(zhuǎn)移酶催化，SAH是酶反應(yīng)產(chǎn)物，亦是該酶的競(jìng)爭(zhēng)性反饋抑制劑。SAH水解酶可將SAH水解成腺苷及L-高半胱氨酸，該反應(yīng)是可逆的，體外趨向合成，體內(nèi)趨向水解。體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基化產(chǎn)生的SAH被SAH水解酶不斷水解，使轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，無(wú)SAH的累積。如SAH水解酶被抑制，細(xì)胞內(nèi)SAH積累，抑制轉(zhuǎn)甲基酶，進(jìn)而影響mRNA功能，病毒蛋白不能合成，也就不能生成子代病毒，病毒復(fù)制受到抑制。大多數(shù)病毒mRNA需甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，且對(duì)轉(zhuǎn)甲基酶的抑制比細(xì)胞mRNA敏感，細(xì)胞內(nèi)SAH濃度稍有增加，便首先受到波及，此特點(diǎn)賦于SAH水解酶抑制劑有選擇性。因此，SAH水解酶在國(guó)際上被用于作為篩選抗出血熱病毒抑制劑的體外篩選模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從干燥的杜仲葉中分離得到的一種新的內(nèi)酯化合物；

本發(fā)明的另一目的在于提供該新化合物的制備方法；

本發(fā)明的再一目的在于提供該化合物用于制備抗病毒藥物的醫(yī)藥用途。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)干燥的杜仲葉用75％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65％的甲醇水溶液等度洗脫，收集9-12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)。

進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。

藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的化合物(Ⅰ)在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。

該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物(Ⅰ)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。

所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。

說(shuō)明書附圖

圖1為化合物(Ⅰ)結(jié)構(gòu)式；

圖2為化合物(Ⅰ)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較；

圖3為化合物(Ⅰ)二維ROESY譜；

圖4為空白對(duì)照曲線及SAH水解酶活性測(cè)定結(jié)果；

圖5為化合物(Ⅰ)對(duì)SAH水解酶的抑制作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證

藥材和試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。干燥的杜仲葉購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地湖北。

制備方法：(a)干燥的杜仲葉(8kg)用75％乙醇熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水飽和的正丁醇(6L×3次)萃取，濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(288g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用純凈水溶解至1.5L，醫(yī)用脫脂棉過(guò)濾，濾液用AB-8型大孔樹(shù)脂(1.5kg)分離，依次用10％乙醇(12L)和75％(15L)乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏(126g)；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(10個(gè)柱體積)、45:1(10個(gè)柱體積)、20:1(8個(gè)柱體積)、10:1(9個(gè)柱體積)和1:1(4個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3(28g)用200-300目正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(5個(gè)柱體積)、20:1(8個(gè)柱體積)和10:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2(8g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠ODS-C18分離，用體積百分濃度為65％的甲醇水溶液等度洗脫，收集9-12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)(22mg)。

結(jié)構(gòu)確證：淡黃色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇；HR-ESIMS顯示[M+Na]⁺為m/z 581.2442，結(jié)合核磁特征可得分子式為C₃₀H₃₈O₁₀，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ_H(ppm,CDCl₃,400MHz)：H-1(6.65，d，J＝12.4)，H-2(6.05，d，J＝12.4)，H-5(2.53，m)，H-6(2.56，m)，H-6(2.96，m)，H-9(2.61，s)，H-11(5.36，s)，H-12(5.15，s)，H-15(3.72，s)，H-16(2.07，m)，H-16(2.31，m)，H-17(2.89，m)，H-18(0.81，s)，H-19(1.57，s)，H-21(7.12，s)，H-22(6.07，s)，H-23(7.33，s)，H-28(1.53，s)，H-29(1.44，s)，H-30(1.43，s)，OAc-11(2.22，s)，OAc-12(1.96，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ_C(ppm,CDCl₃,100MHz)：151.5(CH，1-C)，120.9(CH，2-C)，166.3(C，3-C)，83.6(C，4-C)，48.3(CH，5-C)，39.6(CH₂，6-C)，206.8(C，7-C)，51.3(C，8-C)，56.4(CH，9-C)，44.0(C，10-C)，75.0(CH，11-C)，79.9(CH，12-C)，44.7(C，13-C)，67.6(C，14-C)，56.0(CH，15-C)，32.3(CH₂，16-C)，41.7(CH，17-C)，15.6(CH₃，18-C)，18.6(CH₃，19-C)，122.0(C，20-C)，140.4(CH，21-C)，111.2(CH，22-C)，142.7(CH，232-C)，25.7(CH₃，28-C)，31.5(CH₃，29-C)，21.0(CH₃，30-C)，169.4(C，OAc-11)，21.0(CH₃，OAc-11)，169.3(C，OAc-12)，21.3(CH₃，OAc-12)。¹H和¹³C NMR譜的進(jìn)一步分析可知該合物母核為A-seco環(huán)檸檬苦素類母核，結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的Surenone相似。兩個(gè)化合物之間化學(xué)位移的差異主要是由于羥基信號(hào)的缺失以及兩個(gè)乙?；?δH2.22，s，1.96，s；δC169.4，21.0，169.3，21.3)和羰基碳信號(hào)(δC206.8)引起的。HMBC譜中，H-11與OAC-11(δC169.4，21.0)以及H-12與OAC-12(δC169.3，21.3)的相關(guān)性表明兩個(gè)乙酰基分別位于C-11和C-12上。H-5與H-6和C-7的相關(guān)性可知酮羰基(δC206.8)位于C-7位上。圖3所示ROESY譜中，Me-19與Me-30和H-12以及H-12與H-17的相關(guān)性表明這些基團(tuán)為β-構(gòu)型。反過(guò)來(lái)，H-5與H-9，H-9與Me-18，Me-18與H-15，Me-18與H-11之間的相關(guān)性表明這些基團(tuán)為α構(gòu)型，確定該化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示，并通過(guò)ECD實(shí)驗(yàn)得到確證，實(shí)驗(yàn)值與理論值基本一致(圖2)。

實(shí)施例2：化合物(Ⅰ)藥理作用試驗(yàn)

一、材料和試劑

Ado，Sigma公司；L-Hey，Sigma公司；DTNB，Sigma公司；二硫蘇糖醇(DTT)，分析純，上海伯奧生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，分析純，天津市遠(yuǎn)航化學(xué)品有限公司)；硫酸銨，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；wistar大鼠，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、試驗(yàn)方法

2.1SAH水解酶的提取

4℃下取新鮮大鼠肝臟，用2倍于肝臟重量的10mmol/L pH7.6磷酸緩沖液(含2mmol/L DTT，1mmol/L EDTA)制成勻漿。肝漿在4℃10,000rad/min離心30min，取上清液，4℃10,000rad/min離心60min，取上清液，上清液用38％硫酸銨沉淀，于4℃10,000rad/min離心后，棄上清，取沉淀凍干備用。

2.2SAH水解酶活性測(cè)定

用比色法測(cè)定SAH水解酶的活性。SAH水解酶能可逆性地催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)分解為腺苷(Ado)、高半胱氨酸(Hcy)，半胱氨酸可與二硫硝基苯甲酸(DTNB)發(fā)生硫醇-二硫化物交換反應(yīng)，反應(yīng)中1分子的半胱氨酸引起1分子的硫硝基苯甲酸的釋放。它在PH 8.0時(shí)，在412nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收，因此可利用比色法定量測(cè)定-SH基，測(cè)定吸收光度值以檢測(cè)SAH水解酶活性。

空白對(duì)照曲線繪制：將100μl反應(yīng)混合物(含DTT 2mM，EDTA 1mM，腺苷2mM，D,L-高半胱氨酸2mM，磷酸鉀緩沖液pH 7.6120mM)6份，分別在37℃水浴中培養(yǎng)0秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒，然后各取20μl，分別加入到盛有60μl Tris-Cl緩沖液(PH 8.0)的離心管中混勻，再各取20μl分別加入到6支盛有100μl DTNB分析液的離心管中，準(zhǔn)確靜置5min，使其充分顯色，在412nm處檢測(cè)吸光值。

SAH水解活性曲線繪制：將100μl反應(yīng)混合物(含DTT 2mM，EDTA 1mM，腺苷2mM，D,L-高半胱氨酸2mM，磷酸鉀緩沖液pH 7.6120mM，SAH水解酶3μl)6份，實(shí)驗(yàn)方法同上。

2.3化合物(Ⅰ)對(duì)SAH水解酶活性的抑制作用

將化合物(Ⅰ)用蒸餾水配制成濃度為0.05mg/ml的樣品溶液。將100μl反應(yīng)混合物(含DTT 2mM，EDTA 1mM，腺苷2mM，D,L-高半胱氨酸2mM，磷酸鉀緩沖液pH 7.6120mM，SAH水解酶3μl，化合物(Ⅰ)樣品溶液3μl)6份，實(shí)驗(yàn)方法同上。

三、結(jié)果及結(jié)論

3.1空白對(duì)照曲線及SAH水解酶活性測(cè)定

圖4中可見(jiàn)，反應(yīng)底物腺苷和高半胱氨酸在不加SAH水解酶的情況下，會(huì)緩慢的向合成的方向反應(yīng)，空白對(duì)照曲線中底物的吸光度逐漸降低。SAH水解酶是該反應(yīng)的催化劑，在底物腺苷和高半胱氨酸濃度非常高的情況下，SAH水解酶催化腺苷和高半胱氨酸迅速反應(yīng)，但是10秒后，該反應(yīng)合成和水解達(dá)到平衡，反應(yīng)體系中高半胱氨酸的量趨于穩(wěn)定。圖4中酶活性檢測(cè)曲線前10秒底物吸光度迅速降低，10秒后底物的吸光度逐漸趨于穩(wěn)定，反應(yīng)就達(dá)到了平衡。

3.2化合物(Ⅰ)對(duì)SAH水解酶的抑制作用

圖5中可見(jiàn)，加入化合物(Ⅰ)后，腺苷和高半胱氨酸持續(xù)向合成的方向反應(yīng)，并沒(méi)有出現(xiàn)SAH水解酶加速反應(yīng)并迅速達(dá)到反應(yīng)平衡的現(xiàn)象。說(shuō)明化合物(Ⅰ)抑制了SAH水解酶的活性。分析可能具有抗病毒的活性。

實(shí)施例3

片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實(shí)施例4

口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。

實(shí)施例5

膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。

實(shí)施例6

注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例7

無(wú)菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射用水中，攪拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針劑。