神經(jīng)節(jié)苷脂是最復(fù)雜的鞘糖脂，微量地存在于脊椎動物幾乎所有的組織中，但在哺乳動物的大腦和脊髓組織中含量最高。具有增強(qiáng)人腦功能的發(fā)育和增強(qiáng)記憶的功能，神經(jīng)節(jié)苷脂也是神經(jīng)系統(tǒng)中的信息調(diào)節(jié)因子，它在治療和生物的保護(hù)方面，具有明顯的療效和作用。哺乳動物腦和脊髓組織中主要的神經(jīng)節(jié)苷脂為GM1、GD1b、GD1a和GT1b等。神經(jīng)節(jié)苷脂分子的生理功能主要包括：1)作為膜脂質(zhì)雙層和細(xì)胞糖萼的組分；2)維持膜表面負(fù)電荷；3)參與細(xì)胞識別與信號傳遞；4)保護(hù)缺血(氧)性神經(jīng)損害等。
生物膜的基本結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)雙層，根據(jù)脂類骨架結(jié)構(gòu)的不同，可將這些脂類分為脂肪、磷酸甘油酯、鞘磷脂、糖脂和類固醇五大類。糖脂根據(jù)脂肪連不同，進(jìn)一步分為甘油衍生的甘油糖脂、類固醇衍生的糖脂、多萜醇衍生的糖脂、神經(jīng)鞘氨醇衍生的鞘糖脂。神經(jīng)節(jié)苷脂屬于鞘糖脂，都有一個共同的目核結(jié)構(gòu)——神經(jīng)酰胺。至今已分離鑒定出70余種。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1是哺乳類神經(jīng)節(jié)苷脂的主要種類。
單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)被證明具有顯著的神經(jīng)修護(hù)及再生活性，是神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)損傷的良好的治療藥物，目前已被應(yīng)用于阿爾茨海默癥、帕金森癥等疾病的治療中。由于生產(chǎn)技術(shù)的制約，GM1的價格非常昂貴。
在現(xiàn)有技術(shù)公開了眾多制備GM1的方法，中國專利申請公開第102020684A號，公開了一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)制備方法，共分為四步：
第一步：總脂的提取，以豬腦、牛腦、水牛腦等為原料，勻漿后用甲醇和氯仿混合溶劑提取，上清液加水和0.2％NaOH溶液水解，分層后得到水相粗提物。
第二步：粗孔樹脂交換柱分離，粗提物用大孔樹脂吸附，待飽和后用水洗至澄清，然后解吸，解樣液濃縮后用丙酮沉淀，得神經(jīng)節(jié)苷脂混合體。
第三步：硅膠柱層析，神經(jīng)節(jié)苷脂混合體用硅膠柱層析，收集GM1部分，經(jīng)濃縮得神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)粗品。
第四步：離子交換樹脂柱分離，GM1濃縮液溶解后上陽離子交換樹脂柱， 用5％鹽酸、甲醇洗脫，然后蒸餾、濃縮，再用丙酮沉淀，真空干燥得GM1精制品。
中國專利申請公開第103951715A號，公開了單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1及其分離和純化方法，特別涉及豬來源的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，是根據(jù)下列純化單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的方法制備的，所述方法包括：使用含有鉀或銫離子的洗脫液通過離子交換柱色譜，從含有單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1作為主要神經(jīng)節(jié)苷脂組分的脂質(zhì)混合物中，將單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1與巖藻糖酰GM1分離。
在現(xiàn)有的方法中，通過層析方法從諸多神經(jīng)節(jié)苷脂中分離GM1，工藝過程比較復(fù)雜，再加上本來神經(jīng)節(jié)苷總脂中GM1的含量就比較低，那么，通過復(fù)雜工藝提出來的GM1量也是比較少的，比較浪費成本。如果在提出神經(jīng)節(jié)苷總脂提取物的時候，可以提高GM1的含量，也可以為GM1量的提取節(jié)約成本，換而言之，同樣的提取方法得到GM1的量大。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種神經(jīng)節(jié)苷脂提取物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述制備方法制備得到的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。
為達(dá)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)節(jié)苷脂提取物的制備方法，所述方法包括如下步驟：
(1)取新鮮的豬腦，撕掉腦膜及表面血管，再將豬腦進(jìn)行微波真空干燥處理，所述的微波真空干燥的真空度0.04～0.09Mpa，得到水份含量低于5wt％的干豬腦，將干豬腦粉碎成豬腦粉；
(2)在步驟(1)得到的豬腦粉中加入無水乙醇，在溫度到35～55℃條件攪拌2.0～5.0小時，經(jīng)過過濾，得到沉淀物I；
(3)在步驟(2)的沉淀物I中加入pH5.0～5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷混合溶劑，在室溫條件下攪拌60～120min，通過離心分離，取得上清液I；
(4)將上清液I冷卻到-15～-25℃有沉淀物II析出，過濾，得到沉淀物II；
(5)將步驟(4)得到的沉淀物II用無水乙醚反復(fù)洗滌兩次以上，經(jīng)過濾、真空干燥，得到神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。
在某一實施方案，所述的微波真空干燥的真空度控制0.05～0.07Mpa、溫度控制在40～55℃。
在本發(fā)明提供的神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法中，在無水乙醇溶劑處理之前，首先對新鮮的豬腦進(jìn)行微波真空處理。微波是一種波長為1.0mm～1.0m的電磁波，產(chǎn)生高頻電磁場，在這種電磁場作用下，豬腦中的極性水分子從原來的隨機(jī)分布狀態(tài)轉(zhuǎn)向依照電場的極性排列取向，在電磁場作用下形成分子的運動和相互摩擦從而產(chǎn)生能量使得介質(zhì)溫度不斷提高，使其迅速加熱、干燥。通過在微波真空干燥過程真空度、加熱溫度的控制，使得豬腦的加熱速度快，干燥效率高，熱傳導(dǎo)均勻，干燥質(zhì)量高。且非常有利于后續(xù)的粉碎，粉碎得到的干豬腦粉粒度分布比較窄。
在本發(fā)明中，經(jīng)過微波真空干燥的豬腦的水份控制在wt 5％以下，通過微波真空干燥處理，豬腦會產(chǎn)生一定的膨化效果。一方面便于粉碎，另一方面，具有膨化效果的豬腦粉與溶劑混合之后，豬腦粉更有利于與溶劑充分接觸，更有效的將非目標(biāo)物質(zhì)去除。
在步驟(1)中，干豬腦粉碎成的豬腦粉的粒度控制在80～150nm。
在某些實施方案中，在步驟(2)中，無水乙醇的用量為豬腦粉重量的5～10倍。
在某些實施方式中，在步驟(2)中，攪拌轉(zhuǎn)速為300-500轉(zhuǎn)/min。
在本發(fā)明中，在步驟(1)中嚴(yán)格的控制了豬腦的水份，采用無水乙醇更有效的將豬腦粉中的其他脂類物質(zhì)去除，但是，神經(jīng)節(jié)苷脂的各類物質(zhì)幾乎沒有流失。在本發(fā)明中，更優(yōu)選，無水乙醇的用量為豬腦粉重量的6～8倍。
在某些實施方案中，在步驟(3)中，pH5.0～5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷三者的體積比為(4～6.5)：(0.7～1.5)：(3～5.5)。
在某些實施方案中，在步驟(3)中，混合溶劑的用量為沉淀物重量的4～8倍。
在本發(fā)明中，經(jīng)過無水乙醇處理的沉淀物I與緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷組成的混合溶劑，更有效的將神經(jīng)節(jié)苷脂提取出來。且在pH5.0～5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、以及混合溶劑中，其他的神經(jīng)節(jié)苷脂部分轉(zhuǎn)化為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)。也是最終的神經(jīng)節(jié)苷總脂中單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂含量比較高的一個重要原因。
在某些實施方案中，在步驟(3)中，上清液I冷卻的速率控制在5～10℃/h。
在某些實施方案中，在步驟(3)中，上清液I冷卻到-15～-25℃之后，在保持溫度-15～-25℃的狀態(tài)2～3小時。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述制備方法制備得到的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物，在神經(jīng)節(jié)苷脂提取物中，GM1的含量高于15wt％以上。
綜上所述，本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物的其制備方法具有如下優(yōu)點：
本發(fā)明的制備方法相對簡單，在制備過程大幅度的減少了有害溶劑的使用，且制備得到的提取物中神經(jīng)節(jié)苷脂純度高，GM1的含量高。因此，本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物無論是作為提取單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的原料或者直接服用，都是有益的。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂制備方法進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，但是不限制于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。在本發(fā)明中，術(shù)語“一實施方案”、“某些實施方案”、“另一實施方案”等表示的特征均可以與其他“一實施方案”、“某些實施方案”、“另一實施方案”的特征進(jìn)行組合。
在本發(fā)明中，采用文獻(xiàn)Svennerholm.L.Methods in Engymology(VI)453.1963對實施例和試驗例產(chǎn)品進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂含量的測定。
實施例1
(1)取新鮮的豬腦，撕掉腦膜及表面血管，用水清洗，清洗后的豬腦進(jìn)行微波真空干燥處理，微波真空干燥的真空度控制在0.05～0.06Mpa，溫度控制在45～50℃,功率為2Kw，得到水份含量為3.5wt％的干豬腦，將干豬腦粉碎成豬腦粉，豬腦粉的平均粒度為80～150nm；
(2)取1kg豬腦粉，在得到的豬腦粉中加入5.6L的無水乙醇，在溫度38～43℃條件攪拌3.5小時，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/min，之后經(jīng)過過濾，得到沉淀物I；
(3)在沉淀物I中加入pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷混合溶劑，混合溶劑的用量為沉淀物重量的6倍，其中，緩沖溶液、異丙醇 以及二氯甲烷三者的體積比為6.5：1.2：5.5，在室溫條件下攪拌100min，通過離心分離，取得上清液I；
(4)將上清液I以速率為5℃/h冷卻到-20℃，在-20℃保持2小時，有沉淀物II析出，過濾，得到沉淀物II；
(5)得到的沉淀物II在室溫條件下用無水乙醚反復(fù)洗滌三次，每次無水乙醚的加入量為沉淀物II重量的3倍，經(jīng)過濾、真空干燥，得到神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。經(jīng)HPLC氨基柱法對神經(jīng)節(jié)苷脂提取物進(jìn)行測定，神經(jīng)節(jié)苷總脂的含量為96.7％，其中，GM1的含量為26.5％。
實施例2
(1)取新鮮的豬腦，撕掉腦膜及表面血管，用水清洗，清洗后的豬腦進(jìn)行微波真空干燥處理，微波真空干燥的真空度控制在0.07～0.08Mpa，溫度控制在45～50℃，功率為2Kw，得到水份含量為2.9wt％的干豬腦，將干豬腦粉碎成豬腦粉，豬腦粉的平均粒度為80～150nm；
(2)取1kg豬腦粉，在得到的豬腦粉中加入6.2L的無水乙醇，在溫度45～50℃條件攪拌3.5小時，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/min，之后經(jīng)過過濾，得到沉淀物I；
(3)在沉淀物I中加入pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷混合溶劑，混合溶劑的用量為沉淀物重量的6倍，其中，緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷三者的體積比為4.5：0.8：3.0，在室溫條件下攪拌100min，通過離心分離，取得上清液I；
(4)將上清液I以速率為10℃/h冷卻到-20℃，在-20℃保持3小時，有沉淀物II析出，過濾，得到沉淀物II；
(5)得到的沉淀物II在室溫條件下用無水乙醚反復(fù)洗滌三次，每次無水乙醚的加入量為沉淀物II重量的3倍，經(jīng)過濾、真空干燥，得到神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。經(jīng)HPLC氨基柱法對神經(jīng)節(jié)苷脂提取物進(jìn)行測定，神經(jīng)節(jié)苷總脂的含量為95.3％，其中，GM1的含量為35.4％。
實施例3
(1)取新鮮的豬腦，撕掉腦膜及表面血管，用水清洗，清洗后的豬腦進(jìn)行微波真空干燥處理，微波真空干燥的真空度控制在0.05～0.06Mpa，溫度控制在 40～45℃，得到水份含量為4.0wt％的干豬腦，將干豬腦粉碎成豬腦粉，豬腦粉的平均粒度為80～150nm；
(2)取1kg豬腦粉，在得到的豬腦粉中加入7.5L的無水乙醇，在溫度35～40℃條件攪拌4.5小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/min，之后經(jīng)過過濾，得到沉淀物I；
(3)在沉淀物I中加入pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷混合溶劑，混合溶劑的用量為沉淀物重量的5倍，其中，緩沖溶液、異丙醇以及二氯甲烷三者的體積比為5.5：1.0：3.5，在室溫條件下攪拌60min，通過離心分離，取得上清液I；
(4)將上清液I以速率為8℃/h冷卻到-15℃，在-15℃保持3小時，有沉淀物II析出，過濾，得到沉淀物II；
(5)得到的沉淀物II在室溫條件下用無水乙醚反復(fù)洗滌三次，每次無水乙醚的加入量為沉淀物II重量的3倍，經(jīng)過濾、真空干燥，得到神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。經(jīng)HPLC氨基柱法對神經(jīng)節(jié)苷脂提取物進(jìn)行測定，神經(jīng)節(jié)苷總脂的含量為94.9％，其中，GM1的含量為27.2％。
對比例1
該對比例參考實施例1的工藝流程以及工藝參數(shù)，不同的，在該對比例中新鮮的豬腦不進(jìn)行實施例1的步驟(1)，即不進(jìn)行微波真空干燥以及粉碎。取而代之的方式是，新鮮的豬腦用去離子水淋洗后用粉碎機(jī)攪成漿狀，加入預(yù)冷至4℃的丙酮200ml萃取，過濾，得到的濾餅進(jìn)行實施例1其他的步驟。得到神經(jīng)節(jié)苷脂。經(jīng)HPLC氨基柱法對神經(jīng)節(jié)苷脂提取物進(jìn)行測定，神經(jīng)節(jié)苷總脂的含量為82.4％，其中，GM1的含量為10.2％。
對比例2
該對比例參考實施例1的工藝流程以及工藝參數(shù)，不同的，在該對比例中對新鮮的豬腦實施例1的步驟(3)中采用的緩沖溶液不用，在本對比例中，緩沖溶液采pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液。得到神經(jīng)節(jié)苷脂。經(jīng)HPLC氨基柱法對神經(jīng)節(jié)苷脂提取物進(jìn)行測定，神經(jīng)節(jié)苷總脂的含量為89.4％，其中，GM1的含量為7.5％。