本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，特別是提供了一種金藻與光合細菌混合發(fā)酵的方法，具體是提供了一種球等鞭金藻與沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵的方法。
背景技術：
：球等鞭金藻屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目、等鞭藻科。具有細胞膜薄、沒有細胞壁、蛋白質含量高、易被魚蝦蟹貝類消化吸收的特點，在水產(chǎn)經(jīng)濟動物生產(chǎn)中被廣泛應用在眾多微藻中，金藻由于個體小、無細胞壁、細胞膜薄、易消化，油脂及多不飽和脂肪酸含量高等優(yōu)點，而成為一種研究價值極高的經(jīng)濟藻類。但是金藻對溫度、光照強度及營養(yǎng)因子等條件要求苛刻，且易受其他微藻及原生動物等各種微生物的污染。較難實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，因此，如何提高金藻的生長速率及培養(yǎng)密度成為目前值得研究的一個課題。王雪青等通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終能得到球等鞭金藻的量達2.989×106個/ml。沙氏外硫紅螺菌，專性自養(yǎng)菌，厭氧菌，相對地耐氧，在空氣中馴化可生長，單個細胞無色，細胞懸液的顏色最初呈顯黃色到橙棕色，后來為棕紅色到粉紅色。PH最適范圍：8-8.5，最適生長溫度30-35℃；沙氏外硫紅螺菌有較大的適應范圍，10-40℃、500-6000lux和PH7-9.5，鹽度為千分之三十五以下，均能適應生長，在微好氧黑暗狀態(tài)下也能生存，條件不適時，該菌的生長處于抑制狀態(tài)，一旦條件允許，又能繼續(xù)生長。光合電子供體：硫化物，硫、硫代硫酸鹽，分子氫、醋酸鹽、丁酸鹽、丙酸鹽、蘋果酸鹽、乳酸鹽。氮源：銨鹽、谷氨酸鹽、天門冬氨酸鹽。能進行同化型的硫酸鹽還原作用，具有較強的降解硫化氫，亞硝酸鹽的能力，具有較好的凈水效果。在水產(chǎn)動物苗種培育過程中，由于水質凈化與營養(yǎng)餌料的要求較多及對營養(yǎng)的平衡需要,經(jīng)常對不同動物或不同生長階段的相同動物同時投喂不同微藻與光合細菌，而生產(chǎn)上是分別以單一品種培養(yǎng)后再加以混合的投喂方式進行,這對維持不同微藻與光合細菌的單種培養(yǎng)及其最佳數(shù)量比例的提供是一個難題。解決該難題的有效方法之一是開發(fā)高效的共培養(yǎng)體系。然而，共培養(yǎng)并非單種培養(yǎng)下的簡單組合，其生長特性和生化成份與單種培養(yǎng)相比存在較大的差異。已有研究顯示，影響共培養(yǎng)生長的因子較多,如溫度、鹽度、光照、營養(yǎng)鹽以及接種密度等，盡管張金燕等在專利號CN101363005中已經(jīng)公開了一種微細藻類和光合細菌共培養(yǎng)的方法，但其主要公開的是一種小球藻和沼澤紅假單胞菌兩種淡水藻與菌的培養(yǎng)方法，雖然在球等鞭金藻或沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)方面都有報道，但是在如何利用球等鞭金藻與沙氏外硫紅螺菌的各自生理生態(tài)特點，實現(xiàn)二者在同一培養(yǎng)基及理化條件下都能夠快速生長并達到較高的生物量方面卻未見研究報道。而且沒有公開過海水藻與菌的混合培養(yǎng)方法，本發(fā)明公開的金藻與光合細菌混合發(fā)酵的方法在生產(chǎn)上可充分利用空間和資源，在應用上可實現(xiàn)菌藻優(yōu)勢互補，因此在規(guī)?；a(chǎn)藻菌方面具有非常重要的應用價值。而且現(xiàn)有的單一培養(yǎng)的微藻的液體保存時間短，無法做為商品藻進行出售，也是一個限制因素。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種金藻和光合細菌混合發(fā)酵的方法，具體的是提供一種能夠大大延長保質期，大大提高金藻菌體含量的一種金藻與沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻與紫硫光合細菌中的沙氏外硫紅螺菌菌種按以下步驟進行培養(yǎng)：⑴沙氏外硫紅螺菌半固體種子活化培養(yǎng)：將沙氏外硫紅螺菌種穿刺在半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基中，25-30℃，光照強度為：1000-6000lux，光照培養(yǎng)7-10天，待穿刺的菌線變紅并長出菌苔，即可為活化的沙氏外硫紅螺菌種；⑵沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)：將活化的菌種接種至沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基中，溫度25-30℃，光照強度為：1000-6000lux，光照厭氧培養(yǎng)7-10天，檢測種子的OD650≥1.2，活菌數(shù)≥6億cfu/ml即為種子培養(yǎng)液；⑶球等鞭金藻種子培養(yǎng)：將球等鞭金藻接種到2000mL三角燒瓶中的金藻培養(yǎng)基進行活化純培養(yǎng),光照為3000lx,溫度為27℃,不充氣培養(yǎng),每天搖動攪拌6次,培養(yǎng)4-9天，待球等鞭金藻的含量≥100萬個/ml，即為球等鞭金藻種子培養(yǎng)液；⑷發(fā)酵培養(yǎng)：將球等鞭金藻種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基以1：4-1：8的接種量接種，同時將沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1：10-1：15的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐中間歇通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-28℃，光照強度為：1000-6000lux，攪拌速度為80轉/分鐘，光暗比為12L：12D，即每天12小進光照，12小時黑暗培養(yǎng)，利用磷酸調PH，使PH不高于8.5，培養(yǎng)6-10天，待血球計數(shù)板檢測其沙氏外硫紅螺菌不低于30億cfu/ml，球等鞭金藻不低于4000萬個/ml，即可放罐，灌裝，包裝成品。其中，所述的半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基為:氯化銨0.8-2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5-1g/L，二水氯化鈣0.05-0.2g/L，氯化鎂0.1-0.5g/L，碳酸氫鈉1-3g/L,醋酸鈉2-5g/L，九水硫化鈉0.1-1g/L，瓊脂8-10g/L，氯化鈉20-30g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調PH至7.0-7.2,其中九水硫化鈉先配制成0.1g/mL單獨滅菌；其中，所述的沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化銨0.8-2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5-1g/L，二水氯化鈣0.05-0.2g/L，氯化鎂0.1-0.5g/L，醋酸鈉2-10g/L,碳酸氫鈉1-3g/L，氯化鈉20-30g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液體培養(yǎng)基為:硝酸鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.01g，微量元素1ml，復合維生素1ml,海水1L,121℃滅菌15分鐘；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸鈉0.1g，氯化銨0.8g/L，氯化鉀0.5g/L，EDTA二鈉0.5g/L，氯化鎂0.2g/L，醋酸鈉4g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈉2g/L，硅酸鈉0.01g/L，微量元素1ml，復合維生素1ml,用磷酸調PH至7.2-7.5。其中，所述的微量元素組成為：4.5g，硫酸亞鐵0.5g，濃硫酸0.05ml，硫酸鋅30mg，氯化錳0.2g，硼酸30mg，氯化鈷20mg，氯化銅10mg，氯化鎳2mg，鉬酸鈉3mg，檸檬酸鐵4g，蒸餾水1000毫升，PH3-4，121℃滅菌15分鐘；其中，所述的復合維生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸餾水1L，過濾除菌。本發(fā)明所培養(yǎng)的金藻和光合細菌都屬于光合微生物，雖然它們進行光合作用的代謝途徑和機理不同，但在共同培養(yǎng)條件下可以對培養(yǎng)基的高效利用產(chǎn)生協(xié)同作用。如光合細菌在好氧和厭氧不同條件下有多種代謝途徑，對有機物代謝的產(chǎn)物二氧化碳可以被金藻利用，同時金藻通過光合作用產(chǎn)生的氧氣可以有助于光合細菌通過好氧方式利用有機物。因此，金藻與光合細菌共同培養(yǎng)不僅能夠使培養(yǎng)基的成分得到充分利用，而且各自本身所具有的生理生態(tài)特點也可以使二者同時受益，促進共同生長。本發(fā)明的優(yōu)點在于：球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵時，在共同培養(yǎng)條件下能夠使球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌同時持續(xù)快速生長，且最終獲得較高的生物量，實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)出高細胞濃度的藻菌培養(yǎng)物，可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料和凈水劑等進行應用。單獨發(fā)酵的藻液在常溫下保存時由于藻體代謝旺盛，老化及雜菌增長等原因影響藻液的保存效果。由此，隨著保存時間的延長，藻體生理活動的延續(xù)，水體中營養(yǎng)的消耗，水體中積累的藻體代謝物必然增加，且藻體自身攜帶雜菌可能也不斷增長，消耗水體溶氧以及營養(yǎng)從而導致藻體活性降低。球等鞭金藻和沙氏外硫紅螺菌混合發(fā)酵后，可使混合菌藻液保存過程中增加藻液中溶氧，藻體代謝物得以適當分解，抑制了藻液中有害細菌的增長，減少有害物質的積累；其次減輕了藻體的自氧化，減緩老化，增強自身活性，提升了整體成活率。因此，明顯延長了球等鞭金藻的保存時間，可使用保存時間從2個月延長至4-6個月。具體實施方式實施例1一種金藻與光合細菌混合發(fā)酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻與紫硫光合細菌中的沙氏外硫紅螺菌菌種按以下步驟進行培養(yǎng)：⑴沙氏外硫紅螺菌半固體種子活化培養(yǎng)：將沙氏外硫紅螺菌種穿刺在半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基中，30℃，光照強度為：4000lux，光照培養(yǎng)8天，待穿刺的菌線變紅并長出菌苔，即可為活化的沙氏外硫紅螺菌種；⑵沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)：將活化的菌種接種至沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基中，溫度30℃，光照強度為：4000lux，光照厭氧培養(yǎng)8天，檢測種子的OD650為1.3，活菌數(shù)為6.5億cfu/ml即為種子培養(yǎng)液；⑶球等鞭金藻種子培養(yǎng)：將球等鞭金藻接種到2000mL三角燒瓶中的金藻培養(yǎng)基進行活化純培養(yǎng),光照為3000lx,溫度為27℃,不充氣培養(yǎng),每天搖動攪拌6次,培養(yǎng)8天，待球等鞭金藻的含量110萬個/ml，即為球等鞭金藻種子培養(yǎng)液；⑷發(fā)酵培養(yǎng)：將球等鞭金藻種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基以1：6的接種量接種，同時將沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1：12的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐中間歇通氣培養(yǎng)，每小時通氣5分鐘，每分鐘通氣量為液體培養(yǎng)基的0.2倍，培養(yǎng)溫度28℃，光照強度為：5000lux，攪拌速度為80轉/分鐘，光暗比為12L：12D，即每天12小進光照，12小時黑暗培養(yǎng)，利用磷酸調PH，使PH不高于8.5，培養(yǎng)9天，待血球計數(shù)板檢測其沙氏外硫紅螺菌為32億cfu/ml，球等鞭金藻為4100萬個/ml，即可放罐，灌裝，包裝成品；其中，所述的半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基為:氯化銨0.9g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，二水氯化鈣0.1/L，氯化鎂0.3g/L，碳酸氫鈉3g/L,醋酸鈉3g/L，九水硫化鈉0.2g/L，瓊脂9g/L，氯化鈉25g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調PH至7.0-7.2,其中九水硫化鈉先配制成0.1g/mL單獨滅菌；其中，所述的沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化銨1.0g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，二水氯化鈣0.1g/L，氯化鎂0.3g/L，醋酸鈉4g/L,碳酸氫鈉3g/L，氯化鈉25g/L,121℃滅菌15分鐘，用醋酸調PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液體培養(yǎng)基為:硝酸鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.01g，微量元素1ml，復合維生素1ml,海水1L,121℃滅菌15分鐘；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸鈉0.1g，氯化銨0.8g/L，氯化鉀0.5g/L，EDTA二鈉0.5g/L，氯化鎂0.2g/L，醋酸鈉4g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈉2g/L，硅酸鈉0.01g/L，微量元素1ml，復合維生素1ml,用磷酸調PH至7.2-7.5；其中，所述的微量元素組成為：4.5g，硫酸亞鐵0.5g，濃硫酸0.05ml，硫酸鋅30mg，氯化錳0.2g，硼酸30mg，氯化鈷20mg，氯化銅10mg，氯化鎳2mg，鉬酸鈉3mg，檸檬酸鐵4g，蒸餾水1000毫升，PH3-4，121℃滅菌15分鐘；其中，所述的復合維生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸餾水1L，過濾除菌。實施例2混合金藻與光合細菌發(fā)酵的有效期試驗試驗組：混合金藻與光合細菌發(fā)酵，初始金藻含量為4100萬個/ml，每隔一個月檢測其金藻的成活率；對照組：常規(guī)培養(yǎng)的金藻，初始金藻含量為320萬個/ml，每個月檢測其成活率。指標測定成活率測定：使用I-KI試劑對藻體進行染色，以確定存活細胞和死亡細胞，以1:1體積比將I-KI試劑添加至菌藻液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)存活細胞；活藻細胞除以初始藻細胞量即為成活率。試驗結果：如表1可以看出，混合發(fā)酵中的金藻半年后成活率還可以達到51.2%，而對照組只在常溫下存活90天存活率只有45.4%，另外，按金藻的凈含量即使保存了半年后，其存活藻含量也達到了2099萬個/ml，遠遠高于常規(guī)培養(yǎng)的藻含量（初始金藻含量為320萬個/ml）。表1金藻常溫保存成活率的變化。時間/成活率30天60天90天120天150天180天試驗組98.6%93.7%88.9%79.9%65.8%51.2%對照組82.4%66.4%45.4%21.8%10.4%4.1%實施例3混合發(fā)酵的金藻與光合細菌在海灣扇貝(Argopectonirradians)幼體及稚貝培育期水質凈化劑及輔助餌料育苗生產(chǎn)試驗2015年2月8日-3月20日，在湛江市覃斗鎮(zhèn)某海水育苗場80m3水體育苗池中，每天施用量為1L金藻與光合細菌混合發(fā)酵液；試驗結果：浮游幼體生長速度提高了38.4%，浮游期成活率提高60.3%，幼體提前40個小時出現(xiàn)眼點，稚貝變態(tài)平提高24.5%，產(chǎn)量提高195%，取得了顯著效果。當前第1頁1 2 3