本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS基因的載體構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

生長(zhǎng)素是植物體重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子，參與植物根和莖的生長(zhǎng)和發(fā)育、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發(fā)育，維持頂端優(yōu)勢(shì)，胚胎中軸的建立，植物的向地和向光反應(yīng)以及刺激花器官生長(zhǎng)等生長(zhǎng)和發(fā)育諸多過(guò)程，在植物整個(gè)生命周期過(guò)程中發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)有的研究表明，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程涉及了2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子：一類(lèi)是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factors, ARF)家族，另一類(lèi)是Aux/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族。作為一類(lèi)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，ARF能夠特異地與生長(zhǎng)素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxREs）TGTCNC結(jié)合，激活或抑制基因的表達(dá)。ARF4基因是ARF基因家族中的一員。關(guān)于ARF4基因的研究主要集中在一些模式植物上，擬南芥中ARF4受TAS3產(chǎn)生的ta-siRNA負(fù)調(diào)控，即擬南芥中miR390指導(dǎo)TAS3的生物合成，而TAS3通過(guò)產(chǎn)生的ta-siRNA負(fù)調(diào)控靶基因ARF4來(lái)影響植株發(fā)育時(shí)限、側(cè)根發(fā)育等。因此，在草莓中對(duì)ARF4基因進(jìn)行研究將有助于人們深入理解ARF基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)等過(guò)程中的綜合作用。植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生命周期是不同的基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)的結(jié)果?；虻谋磉_(dá)調(diào)控受多種內(nèi)外因子的影響。根據(jù)基因調(diào)控在同一事件中發(fā)生的先后次序，又可將其分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控等。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用。植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于結(jié)構(gòu)基因的5' 端上游。一個(gè)典型的啟動(dòng)子包含CAAT-box和TAAT-box，它們分別是依賴(lài)DNA和RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游幾十個(gè)堿基處。在核心啟動(dòng)子上游通常會(huì)有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動(dòng)子上即可啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，因此啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是啟動(dòng)子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的實(shí)質(zhì)。因此，對(duì)植物啟動(dòng)子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程中提高或改進(jìn)外源目的基因的表達(dá)。GUS報(bào)告基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因。該基因產(chǎn)物為β-葡萄糖苷酸酶，屬水解酶類(lèi)，相當(dāng)穩(wěn)定而不易降解。根據(jù)GUS基因檢測(cè)所用的底物不同，可以選擇三種檢測(cè)方法：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法，其中最為常用的是組織化學(xué)法。組織化學(xué)法檢測(cè)以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞發(fā)生了GUS基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出GUS，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍(lán)染料，它使具GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出GUS活性。因此將啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因構(gòu)建為融合載體并導(dǎo)入植物體中，通過(guò)檢測(cè)GUS活性就可以反映出啟動(dòng)子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。因此，要研究ARF4基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，首先要獲得ARF4基因啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體，從而才能深層次了解 ARF4基因啟動(dòng)子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，為全面揭示ARF4基因功能奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS基因的載體構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括草莓ARF4基因啟動(dòng)子的DNA序列如序列表中‘艷麗’草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列，其特征是，草莓ARF4基因啟動(dòng)子的克隆方法如下：以草莓幼嫩葉片為材料，利用CTAB法提取DNA，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ARF4基因啟動(dòng)子：

上游引物PRO-ARF4-F：5'- AACTGCAGTACGGCTTCAAGGTTAAG-3'；

下游引物PRO-ARF4-R：5'- GCTCTAGA TCTCTCTCTCTCTGCT-3'；

以上述提取的DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到pGM-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定，得到序列如序列表中‘艷麗’草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列所示，命名為pGM-ARF4-Pro。

所用的草莓品種為‘艷麗’草莓。

含草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，方法如下：

提取草莓葉片中的DNA；

以DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異引物，PCR擴(kuò)增得到上游和下游分別引入Pst I酶和Xba I酶切位點(diǎn)的ARF4基因啟動(dòng)子；

其中，所述的特定引物是：

上游引物PRO-ARF4-F：5'- AACTGCAGTACGGCTTCAAGGTTAAG-3'；

下游引物PRO-ARF4-R：5'- GCTCTAGA TCTCTCTCTCTCTGCT-3'；

將帶有酶切位點(diǎn)的ARF4基因啟動(dòng)子,連接到克隆載體pGM-T上,轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞, 得到重組質(zhì)粒pGM-ARF4-Pro，提取陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-ARF4-Pro；

用限制性?xún)?nèi)切酶Pst I酶和Xba I酶分別對(duì)提取的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGM-ARF4-Pro和表達(dá)載體pRI201-AN-GUS進(jìn)行雙酶切，將得到的ARF4基因啟動(dòng)子片段替換pRI201-AN-GUS中的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro。

本發(fā)明的有益效果：

1. 本發(fā)明構(gòu)建的草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ARF4基因啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)新種質(zhì)，為該啟動(dòng)子的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

2. ARF4基因啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)ARF4基因的表達(dá)，利用轉(zhuǎn)基因和GUS組織染色技術(shù)，有助于揭示ARF4 基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因強(qiáng)弱，從而間接了解驅(qū)動(dòng)ARF4基因的表達(dá)強(qiáng)弱；同時(shí)采用不同處理，如不同種類(lèi)激素處理等，可以明確影響ARF4 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的各種因素，從而為通過(guò)調(diào)控啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)提供理論依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為植物表達(dá)載體pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro構(gòu)建方法示意圖

圖2為以草莓葉片DNA為模板的ARF4基因啟動(dòng)子克隆后的電泳圖；

其中，M：100 bp Marker；1：清水對(duì)照；2，4，5，6：ARF4基因啟動(dòng)子

圖3為以陽(yáng)性pGM-ARF4-Pro重組質(zhì)粒為模板的ARF4基因啟動(dòng)子克隆后的電泳圖；

其中，M：100 bp Marker；1-10：ARF4基因啟動(dòng)子

圖4為用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）軟件對(duì)克隆的‘艷麗’草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列中的核心作用元件進(jìn)行分析的結(jié)果

圖5為以陽(yáng)性pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro重組質(zhì)粒為模板克隆ARF4啟動(dòng)子的電泳圖；

其中，M：100bp Marker；泳道1、2、3、4、6、7、8、10為擴(kuò)增所得的目的片段

圖6為陽(yáng)性pRI-201-GUS-ARF4-Pro重組質(zhì)粒雙酶切的電泳圖；

其中M：100 bp marker；泳道1：pRI-201-GUS；泳道2：pRI-201-GUS-ARF4-Pro

圖7為構(gòu)建ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因植物表達(dá)載體后擴(kuò)增AFR4基因啟動(dòng)子的電泳圖；

其中M：100 bp marker；泳道1、2：AFR4基因啟動(dòng)子

圖8為構(gòu)建ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因植物表達(dá)載體后擴(kuò)增GUS基因片段的電泳圖；

其中M：100 bp marker；泳道1、2、3、4：GUS基因片段。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明

實(shí)施例1：草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列的克隆

植物材料為‘艷麗’草莓。

1. 草莓DNA的提取

將草莓幼嫩葉片（0.05~0.1 g）在液氮中研碎，迅速移入1.5 ml離心管中。

加入600 μL 預(yù)熱的2% CTAB提取緩沖液（預(yù)熱前加入0.4% β-巰基乙醇）于65°C保溫20~30 min，期間顛倒幾次。

加入600 μL 氯仿/異戊醇（24:1），輕輕顛倒若干次，10 000 r/min離心10 min。

把上清液（約500 μL）移入新的1.5 ml離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒若干次，10 000 r/min離心10 min。

取上清液（約300 μL）加入新的1.5 mL離心管，加入二倍體積冰冷的無(wú)水乙醇，顛倒混勻。

挑出沉淀，放到含350 μL TE緩沖液的1.5 mL離心管中，當(dāng)大部分沉淀溶解后，10000 r/min離心10 min。

將上清（約300 μL）加入新的1.5 mL離心管，加入1μL RNase，輕輕混勻后在37°C水浴1 h。

冷卻至室溫，加入1/3體積的3 M NaAc,混勻后再加入二倍體積冰冷的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，–20°C放置1 h，10 000 r/min離心10 min。

棄上清，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次。

在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干DNA。加入100μL TE溶解DNA，于冰箱中保存。

2. 利用Primer Primers 5.0軟件分析設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增ARF4基因啟動(dòng)子

上游引物PRO-ARF4-F：5'-AACTGCAGTACGGCTTCAAGGTTAAG-3'；

下游引物PRO-ARF4-R：5'- GCTCTAGA TCTCTCTCTCTCTGCT-3'；

以提取的草莓葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；

PCR反應(yīng)體系為：取1 μL DNA加入PreMix Taq (Ex Taq version 2.0 plus dye) 10 μL,正反向引物各0.5 μL，最后用水補(bǔ)足到20 μL；

PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 1.5 min,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存；

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖如圖2所示，從圖2可見(jiàn)一條目的條帶，大小為1567 bp。

實(shí)施例2：重組載體pGM-ARF4-Pro的構(gòu)建

植物材料為‘艷麗’草莓。

1. DNA的提取

方法同實(shí)施例1的步驟1。

2. PCR擴(kuò)增ARF4基因啟動(dòng)子并與pGM-T連接

上游引物PRO-ARF4-F：5'- AACTGCAGTACGGCTTCAAGGTTAAG-3'；

下游引物PRO-ARF4-R：5'- GCTCTAGA TCTCTCTCTCTCTGCT-3'；

以提取的葉片DNA為模板，通過(guò)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在目的基因上游和下游分別引入Pst I和XbaI 酶切位點(diǎn)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

回收后，將回收的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按天根公司產(chǎn)品pGM-T試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

連接反應(yīng)體系為：取7 μL回收的PCR產(chǎn)物，1 μL T₄ DNA連接酶， 10×T₄ DNA連接酶Buffer 1μL，pGM-T載體1μL；

連接反應(yīng)程序：16℃連接16 h；

然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在表面涂有24 μg·mL^-1異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和40 μg·mL^-1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的含Amp(60 μg·mL^-1)的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h。挑取單個(gè)白色克隆，分別涂布于新的含有Amp(60 μg·mL^-1) 的LB培養(yǎng)基平板上(二轉(zhuǎn))，37℃培養(yǎng)12-16 h，之后進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，如圖3所示。將驗(yàn)證正確的菌株培養(yǎng)后，送北京華大公司測(cè)序，得到序列如序列表中‘艷麗’草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列所示，用DNAMAN軟件將測(cè)序序列與二倍體森麗草莓ARF4基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，正確后分析ARF4基因啟動(dòng)子序列的核心作用元件，如圖4所示，序列分析正確后證明重組載體pGM-ARF4-Pro構(gòu)建成功。

實(shí)施例3：草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建

1.使用天根公司離心柱型質(zhì)粒小提中量試劑盒（TIANprep Midi Plasmid Kit）分別提取pGM-ARF4和pRI201-AN-GUS載體的質(zhì)粒DNA，具體操作如下：

1）柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL，1 2000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

2）取15 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，1 2000 r/min離心1 min，盡量吸除上清；

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500 μL溶液P1（使用前加入RNaseA），使用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；

4）向離心管中加入500 μL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體充分裂解。此時(shí)菌液變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒(méi)有變清亮，可能是由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量；

5）向離心管中加入700 μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。1 2000 r/min離心10 min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清；

6）將上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中，其容量為750~800 μL），注意盡量不要吸出沉淀。1 2000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中；

7）向吸附柱CP4中加入500 μL去蛋白液PD，1 2000 r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4 重新放回收集管中；

8）向吸附柱CP4中加入700 μL漂洗液PW（先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），1 2000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中；

9）向吸附柱CP4中加入500 μL漂洗液PW，1 2000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液；

10）吸附柱CP4放入收集管中，1 2000 r/min離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CP4開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

11）將吸附柱CP4置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2~5 min，1 2000 r/min離心2 min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中；

12）將洗脫緩沖液重復(fù)加到吸附柱CP4中以增加質(zhì)粒的回收效率。

2. 取上述帶有酶切位點(diǎn)的pRI201-AN-GUS質(zhì)粒 (TaKaRa，Japan)和ARF4啟動(dòng)子質(zhì)粒pGM-ARF4-Pro，均用Pst I和Xba I進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系(20 μL)：pGM-ARF4-Pro/pRI201-AN-GUS 16 μL，10×M Buffer 2 μL，Pst I和Xba I各1 μL；37℃酶切，4 h；

用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收pRI201-AN-GUS較大片段和ARF4啟動(dòng)子的pGM-ARF4-Pro較小片段。用T4 DNA連接酶(NEB)連接兩個(gè)回收產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(10 μL):10×Ligase Buffer l μL，pRI201-AN-GUS大片段1 μL, ARF4啟動(dòng)子的pGM-ARF4-Pro較小片段7 μL,T4 DNA連接酶1 μL；16℃連接，16 h。

然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含 Kan (50 μg·mL^-1)的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h。挑取單個(gè)白色克隆,分別涂布于新的含有Kan (50 μg·mL^-1) 的LB培養(yǎng)基平板上(二轉(zhuǎn)),37℃培養(yǎng)12-16 h。利用上游引物PRO-ARF4-F和下游引物PRO-ARF4-R，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，如圖5所示，證明草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro構(gòu)建成功。

3. 提取pRI201-AN-GUS-ARF4-pro的質(zhì)粒DNA

方法同實(shí)施例3的步驟1。

對(duì)提取的質(zhì)粒用Pst I和Xba I雙酶切，雙酶切體系(20 μL)：pRI201-AN-GUS-ARF4-pro的質(zhì)粒DNA 16 μL，10×H Buffer 2 μL，Nde I和Sal I各1 μL；37℃酶切，4 h；瓊脂糖凝膠電泳如圖6所示，兩條譜帶，說(shuō)明雙酶切反應(yīng)成功，進(jìn)一步證明草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro構(gòu)建成功。同時(shí)分別以重組質(zhì)粒pRI201-AN-GUS-ARF4-pro為模板擴(kuò)增ARF4基因啟動(dòng)子（如圖7所示）和GUS報(bào)告基因（如圖8所示），均能獲得目的片段，再次證明草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pRI201-AN-GUS-ARF4-Pro構(gòu)建成功。

序列表

<110>沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種草莓ARF4啟動(dòng)子融合GUS基因的載體構(gòu)建方法

<160>1

<210>1

<211>1567

<212>DNA

<213>‘艷麗’草莓ARF4基因啟動(dòng)子

<400>1

tacggcttca aggttaagtt aaatagttaa gtaaaagaca atatggatgc catataatac 60

ctactgagtc ttaaagattt ggttgcataa taattgatac taattgctat ggctttttag 120

ccaaattgct accatagctt ttaccttgat gtcaatttgt taccctaact tttaattcag 180

ccaatttgtt atcctaaatt ttcataatta gccaatttgc taccctaaat attatttctg 240

ccgatttact accttatgtt atgaaaatta gccaatttgt tacatttttg tcattttata 300

atttagtcat tttttcatcc aaacatgaat taattctgaa aattgaagct taaagttgat 360

caatattgaa atttcgataa ataaattggt taatcttgaa actttaaagt agcaaatttg 420

atggaagggt agcaaattgg cttaaataaa acctagggta gcaaattggc taatttagaa 480

aaattaagat aacaaattgg ctgaaatgaa agttagggta ataaattgac accaaaacgt 540

aaaaactagg gtaacaaatt aacaattatg ccaatagata tcagagatag gttgatggtg 600

acacatcatc taaggtggag tcaagtgaat gttgaaggtg gaggagtggg tgagagaaga 660

cagtcttgat tgaataagtt ttgtagttgt gcaagctaga ataaaaagaa aaagaaaatc 720

ttgatcaaat gtggatcgag tatgggattg atatatgact tgagggatga tggttataga 780

gaaaggttgt atctggccat gataaaaatt gttatgtgtg tcttgaccaa aaaaattaaa 840

agaaaaagtt tttataagtg gatgactagt tctgatgaca cgagcatttt gtgacaaatt 900

tattcgtaaa aaacagaact aatgttctaa ataaaatcgt tagattctgc atgctaattg 960

agttattcaa gtgtgaaatg tgagtcttaa catgtttaga gcataattta ttttcttttc 1020

agaacttgat tcttcttttt tatgccgtat tgtcgatgca ttcctagctc ctaaccccac 1080

ttctattatt catactccat aggcaagtta aagggtggct cataggttag gtagagttct 1140

gtttcttacc ataatgtgat acaaacttgg tttaaatctg ttcctgaaaa tagatgaaaa 1200

gaaaaacgaa tattgctctt actgtcttgc ctttcttagc tcttgttgtg ttgaatgaaa 1260

ccccccttct gtggagggaa accggttgag atgacagttt tctttaataa cttcataaat 1320

actcagtcgg gaagaagaag atgacaattt tccattttat tgaaattttt tctttgaaga 1380

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