本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一種以硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥為原料固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的方法。

背景技術：

硫酸軟骨素在軟骨組織中是以蛋白多糖形式存在，蛋白多糖中硫酸軟骨素多糖鏈與核心蛋白通過共價鍵連接(糖肽鍵)，而蛋白多糖的聚集體則通過次級鍵(氫鍵和鹽鍵)形成?？梢姀膭游镘浌墙M織中提取硫酸軟骨素必須要采取合適有效方法破壞多糖鏈與蛋白的共價結(jié)合，使多糖鏈與蛋白有效分離，多糖類硫酸軟骨素才能高效提取。目前國內(nèi)生產(chǎn)廠家常采用蛋白酶解蛋白+等電點沉淀蛋白的方法來進行蛋白解離。該步生產(chǎn)工藝會產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)沉淀，屬于硫酸軟骨素生產(chǎn)廢棄物，稱為廢骨泥。廢骨泥營養(yǎng)成分豐富，適宜微生物繁殖，常規(guī)室溫放置2～3天即可發(fā)生腐敗，產(chǎn)生惡臭氣味，并產(chǎn)生大量廢液，造成極大環(huán)境污染，是工業(yè)生產(chǎn)急需解決的問題。

枯草芽孢桿菌，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2045號《飼料添加劑品種目錄(2013)》已批準其可作為有益微生物(益生素)添加到飼料中使用?？莶菅挎邨U菌種類很多，可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，降解雞、豬飼料中一部分不能被完全消化吸收的纖維素、蛋白質(zhì)，提高飼料利用率，增加養(yǎng)殖動物生長速度，還可避免這些不能被養(yǎng)殖動物利用的蛋白質(zhì)排出體外，被微生物分解產(chǎn)生有毒有害的氨氣；同時枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對動物致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，可有效降低動物疾病發(fā)生率?，F(xiàn)階段，隨著人們健康安全意識的增強，枯草芽孢桿菌作為綠色、安全、高效的益生菌飼料添加劑，需求量逐年增加。

綜上所述，一方面工業(yè)廢骨泥含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分，現(xiàn)實中面臨如何充分利用廢骨泥資源的問題；另一方面枯草芽孢桿菌需求量逐年增加，如果將兩者有機結(jié)合起來，研究出易于操作、組成簡單、便捷生產(chǎn)、成本低廉的廢骨泥發(fā)酵生成枯草芽孢桿菌技術將有著重要的現(xiàn)實意義：既解決廢棄物廢骨泥環(huán)境污染，實現(xiàn)廢物利用，又可以開辟一條更便捷、更低廉的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的道路。而目前利用廢骨泥發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種以硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥為原料固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的方法，利用本方法能有效利用低成本下腳料廢骨泥生產(chǎn)高附加值枯草芽孢桿菌，達到變廢為寶目的。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是：一種以硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥為原料固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的方法，以利用動物軟骨提取硫酸軟骨素工藝所產(chǎn)生的工業(yè)廢骨泥為基質(zhì)，混合麩皮、水作為培養(yǎng)基，高溫滅菌后接入枯草芽孢桿菌進行固體發(fā)酵，發(fā)酵物經(jīng)干燥粉碎制得枯草芽孢桿菌。

所述廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比為3～10∶10～30∶20～80；

所述接入枯草芽孢桿菌接菌數(shù)量為5×10⁵～5×10⁶個/g培養(yǎng)基；

所述固體發(fā)酵條件為溫度35～37℃，發(fā)酵48～72h；

優(yōu)選地，所用廢骨泥、麩皮、水質(zhì)量比為3∶15∶30。

優(yōu)選地，所用枯草芽孢桿菌接菌數(shù)量為1×10⁶個/g培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所用固體發(fā)酵條件為35～37℃條件下固體發(fā)酵60h。

目前常用軟骨素生產(chǎn)工藝為動物軟骨經(jīng)過清洗粉碎，加酶水解并結(jié)合等電點沉淀分離除蛋白，濾清液采用乙醇提取獲得。分離除蛋白生產(chǎn)工藝會產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)沉淀，屬于硫酸軟骨素生產(chǎn)廢棄物，稱為廢骨泥。廢骨泥營養(yǎng)成分豐富，適宜微生物繁殖，常規(guī)室溫放置2～3天即可發(fā)生腐敗，產(chǎn)生惡臭氣味，并產(chǎn)生大量廢液，造成極大環(huán)境污染，是工業(yè)生產(chǎn)急需解決的問題。本發(fā)明人經(jīng)過實踐研究發(fā)現(xiàn)該廢骨泥由于含有較多的多肽、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)成分可以用于發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明人用凱氏定氮法測定了該廢骨泥中含氮量，并測定酸度和主要無機鹽類，分別為：總氮≥12.1％、氨基氮≥2.3％，、氯化鈉≤0.64％、骨渣≤3.5％、脂肪類≤1.3％、pH 6.5～7.0，結(jié)果顯示硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥可為飼用枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)提供氮源和無機鹽等營養(yǎng)元素，在此基礎上本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)僅需要添加麩皮作為碳源即可滿足枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)需要，而無需對硫酸軟骨素生產(chǎn)廢骨泥進行任何預處理，且適用于所有枯草芽孢桿菌菌株。

本發(fā)明首次將硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥應用于發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌，開辟了硫酸軟骨素生產(chǎn)工業(yè)廢骨泥的新的用途。

此外，本發(fā)明還提供一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含所述的枯草芽孢桿菌粉體制劑。

本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明解決了硫酸軟骨素產(chǎn)生的工業(yè)廢骨泥污染問題。初步統(tǒng)計每年全國硫酸軟骨素產(chǎn)生含氮工業(yè)廢水高達幾十萬噸，如此大量的廢物，造成環(huán)境的極大污染。本發(fā)明開辟了該廢骨泥的全新用途，將其用于發(fā)酵生產(chǎn)飼用枯草芽孢桿菌，變廢為寶，不再產(chǎn)生任何廢物或廢水，綠色環(huán)保。不僅為企業(yè)減輕負擔，而且還可以增加企業(yè)經(jīng)濟收益。

(2)本發(fā)明工藝簡單，易操作。本發(fā)明所用廢骨泥無需經(jīng)過預處理，直接添加麩皮即可滿足枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)需要。整個工藝流程簡單，且工藝控制條件溫和、設備要求較低、投資少、便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)應用。

(3)本發(fā)明方法成本低廉，可大幅降低枯草芽孢桿菌價格。利用動物軟骨提取硫酸軟骨素過程中產(chǎn)生的大量工業(yè)廢棄物，其中含有較多的蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分，以前都是作為廢物排放，無經(jīng)濟價值。而添加的麩皮是小麥加工面粉后得到的副產(chǎn)品，，經(jīng)濟價值也不高，便宜易得。且原料無需經(jīng)過任何處理，整體生產(chǎn)成本更為低廉。因為目前，枯草芽孢桿菌活菌制劑生產(chǎn)過程中一般用的培養(yǎng)基原料有：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、淀粉、葡萄糖、尿素及其他無機鹽，顯然本發(fā)明方法發(fā)酵成本低廉的多。顯然本發(fā)明方法可以大幅降低枯草芽孢桿菌價格。

(4)所得枯草芽孢桿菌菌粉有效活菌高。發(fā)酵后不用再添加固形物直接干燥蒸發(fā)粉碎后即可得菌粉。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量達到6～18×10¹⁰個/g?？捎糜趧游镲暳霞拔⑸锞剩龠M綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益和社會效應。

附圖說明

圖1為不同培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

圖2為不同接菌量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體試驗方法和附圖對本發(fā)明的技術方案及其所產(chǎn)生的技術效果進行進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領域常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例所用的廢骨泥為以動物軟骨提取硫酸軟骨素工藝所產(chǎn)生的廢液廢渣常規(guī)過濾后的得到的。

實施例1：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比3∶20∶60配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按5×10⁵個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵48h，發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵48h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞6.0×10¹⁰個/g。

實施例2：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比8∶30∶80配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按1×10⁶個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵60h。發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵60h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞1.0×10¹¹個/g。

實施例3：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比3∶10∶20配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按5×10⁶個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵72h。發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵72h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞8×10¹⁰個/g。

實施例4：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比10∶25∶60配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按5×10⁵個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵66h。發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵66h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞9×10¹⁰個/g。

實施例5：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比3∶15∶30配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按1×10⁶個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵60h.發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵60h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞1.8×10¹¹個/g。

對照例6：按照廢骨泥、麩皮、水的質(zhì)量比0∶15∶30配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基100kg，攪拌均勻后，120℃高溫滅菌20min，按1×10⁶個/g培養(yǎng)基接入枯草芽孢桿菌，35～37℃固體發(fā)酵48h，發(fā)酵過程分兩階段：1-8h采用靜止培養(yǎng)，8h后通過無菌風控制溫度35～37℃，每間隔6h開啟攪拌20rpm時間10min。發(fā)酵48h后，收集發(fā)酵產(chǎn)物。50～60℃干燥至含水率低于8％時，粉碎過80目篩制得飼用枯草芽孢桿菌。按照GB/T 26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》方法檢測枯草芽孢桿菌數(shù)量＞5×10⁸個/g。

通過實施例1-5與對照例6進行比較結(jié)果顯示：僅用麩皮、水發(fā)酵枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌數(shù)達到5×10⁸個/g，添加廢骨泥后，枯草芽孢桿菌數(shù)提高到6～18×10¹⁰個/g，提高了120～360倍。

實驗例1.單因素實驗法考察麩皮廢骨泥比例、料水比、培養(yǎng)時間、接菌量等因素對發(fā)酵產(chǎn)枯草芽孢桿菌的影響

(1)麩皮、廢骨泥作為枯草芽孢桿菌碳氮源，碳氮比對枯草芽孢桿菌生長至關重要，影響菌體產(chǎn)量與質(zhì)量。依照本發(fā)明提供方法，采用單因素實驗設計，將廢骨泥：麩皮比例分別設置為2:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:10、1:15，進行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，實驗結(jié)果見表1。

表1不同廢骨泥：麩皮比例發(fā)酵獲得的枯草芽孢桿菌數(shù)

從表1可以看出，廢骨泥：麩皮＝1:1～1：10時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)可達10¹⁰數(shù)量級以上，尤其廢骨泥：麩皮＝1:5時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達到最高，1.8×10¹¹，因此廢骨泥：麩皮＝1:5時本發(fā)明方法培養(yǎng)芽孢桿菌最佳配比。

(2)固態(tài)發(fā)酵最大特點就是無游離水，底物含水量的變化對微生物生長代謝能力會產(chǎn)生重要影響。依照本發(fā)明提供方法，采用單因素實驗設計，將料水比例分別設置為2:1、1.5:1、1:1、3:5、1:2、1:4、1:6，進行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，實驗結(jié)果見表2

表2不同料水比例對枯草芽孢桿菌菌數(shù)影響

從表2可以看出，料水＝3:5時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達到最高，1.3×10¹¹，因此料水比＝3:5時本發(fā)明方法培養(yǎng)芽孢桿菌最佳配比。

(3)微生物培養(yǎng)中，發(fā)酵時間是一個重要指標，時間長達影響菌體生長，也與生產(chǎn)成本、生產(chǎn)能耗直接相關。依照本發(fā)明提供方法，采用單因素實驗設計，將培養(yǎng)時間分別設置為12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h，進行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，實驗結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，培養(yǎng)時間60h，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達到最高，因此本發(fā)明方法培養(yǎng)芽孢桿菌最適宜培養(yǎng)時間為60h。

(4)初始接菌量多少與發(fā)酵周期相關，依照本發(fā)明提供方法，采用單因素實驗設計，將接菌量分別設置為1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶個/g培養(yǎng)基，進行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，實驗結(jié)果見圖2

從圖2可以看出，接菌量1×10⁶個/g培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達到最高，為本發(fā)明方法培養(yǎng)芽孢桿菌最適宜接菌量。