本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘋果調(diào)控生長素運(yùn)輸及根系發(fā)育基因MdPIN1的克隆及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生長素是一種重要的植物激素，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，包括植物器官發(fā)生(Benkováet al.,2003；Bohn-Courseau,2010),重力響應(yīng)和及頂端優(yōu)勢(Kepinski and Leyser,2005)以及組織分化(Reinhardt,2003)。細(xì)胞間單項(xiàng)極性運(yùn)輸是生長素特有的運(yùn)輸方式，即生長素只能從植物體形態(tài)學(xué)的上端向下端運(yùn)輸，且與重力作用無關(guān)(Liu et al.,1993；Lupini et al.,2014)。生長素極性運(yùn)輸存在于植物的莖，根和葉中，影響生長素不對稱分布和植株形態(tài)(Friml,2003)。生長素的極性運(yùn)輸由定位于質(zhì)膜上的生長素運(yùn)輸載體負(fù)責(zé)(Kepinski and Leyser,2005；Mravec et al.,2009)。

生長素運(yùn)輸載體，包括生長素輸入載體(AUX1)和生長素輸出載體(PINs)，它們通過調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸和分布影響植物生長發(fā)育的各個(gè)方面( ek and Friml,2009；Haga and Sakai,2012)。在擬南芥中，有八個(gè)PIN基因(PIN1-PIN8)，PIN1首先被鑒定與生長素運(yùn)輸相關(guān)(Kramer et al.,2004)。AtPIN1基因編碼622個(gè)氨基酸殘基，包含8-12個(gè)對于生長素轉(zhuǎn)運(yùn)活性至關(guān)重要的跨膜區(qū)域。以前的研究已經(jīng)表明AtPIN1參與側(cè)根器官形成( et al.,2014),向光性反應(yīng)(Blakeslee et al.,2004),形態(tài)發(fā)生和生長素運(yùn)輸(Heisler et al.,2010)。AtPIN1的功能可以被生長素運(yùn)輸抑制劑影響(Geldner et al.,2001)，進(jìn)一步說明了AtPIN1在生長素極性運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。最近，水稻PIN1基因，OsPIN1被鑒定參與生長素依賴的不定根生成和分蘗(Xu et al.,2005)。

蘋果是世界上重要的水果作物，對果樹生長素極性運(yùn)輸進(jìn)行研究有助于實(shí)現(xiàn)植株形態(tài)結(jié)構(gòu)和根系發(fā)育調(diào)節(jié)，最終提高果樹產(chǎn)量。在本研究中，我們通過同源克隆的方式鑒定了MdPIN1基因，結(jié)果顯示，在擬南芥中異位表達(dá)MdPIN1促進(jìn)了植株根系發(fā)育和生長素運(yùn)輸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從蘋果中鑒定并分離的一新型調(diào)控根系生長素運(yùn)輸以及根系發(fā)育的生長素輸出載體基因MdPIN1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MdPIN1影響根系生長素運(yùn)輸，MdPIN1超量表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出主根長度受到抑制，側(cè)根數(shù)目增多的表型；提示該基因在植物生長素運(yùn)輸和根系發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

首先，本發(fā)明公開了一種分離的蘋果生長素運(yùn)輸載體基因MdPIN1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進(jìn)一步的，所述生長素運(yùn)輸載體基因MdPIN1來自嘎啦蘋果。

本發(fā)明第二方面公開了前述蘋果生長素運(yùn)輸載體基因MdPIN1編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)獲得了蘋果生長素運(yùn)輸相關(guān)基因MdPIN1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

MdPIN1基因序列如下：

ATGATTACATTATCCGACTTCTACCACGTCATGACGGCGGTGGTGCCGCTCTACGTGGCCATGATCTTGGCCTACGGCTCCGTGAAGTGGTGGAAGATCTTCACCCCCGACCAGTGCTCCGGCATCAACCGCTTCGTCGCCCTCTTTGCCGTCCCCCTCCTCTCCTTCCACTTCATCTCCACCAACGACCCTTACAACATGAACACCCGCTTCATTGCCGCCGACACCCTCCAGAAGCTGATCGTCCTCGCCGTCCTCGGCGTCTGGACCAAAGTCAGCAAAAGGGGCTGCCTGGAATGGACGATCACTCTCTTCTCCGTCTCCACTCTGCCCAACACTCTGGTCATGGGAATCCCATTGCTCAAGGGAATGTACGGCGATTTTTCCGGGAGTTTGATGGTGCAGATCGTCGTCCTCCAGTGCATTATCTGGTACACTTTGATGCTTTTCATGTTCGAATACCGAGGAGCAAGACTCCTCATCTCGGAGCAGTTTCCCGACACTGCGGGATCCATTGTCTCCATCCACGTCGACTCCGATATTATGTCGCTCGACGGAAGACAGCCCCTCGAGACTGAAGCGGAGATCAAGGAGGACGGCAAACTCCACGTCACTGTCAGAAAATCAAACGCTTCGCGCTCGGATATTTTATCGCGGCGATCTCAGGGGCTGTCGTCCACCACCCCGCGGCCGTCGAATCTCACTAATGCGGAGATTTACTCCCTGCAGTCTTCGAGAAATCCGACGCCGAGAGGGTCAAGTTTCAACCACACGGACTTCTACTCCATGATGGCTGCCGGAAGGAACTCGAATTTCGGAGCTAACGATGTTTATGGGATGTCTGCGTCCAGAGGGCCGACTCCACGGCCATCAAATTTCGAGGAAGACGGTGGCGGCGGCGCTGTCAGCTCCGCTACTGGAAATAAGCCACGGTTTTACCACGGCGGACAGAATAATGCAGTGGCGCATTACCCGGCCCCAAACCCAGGGATGTTTTCTCCGACGGCGTCCAGAACCGTCACCGCTAATGCTAATAGCAATGCCATGAATGCAAAGAGAGCTAATGGGCAAGCTCAGAAAACAGAGGACACCAATGGCGGGAAGGATCTTCATATGTTTGTTTGGAGCTCAAGTGCTTCTCCTGTTTCAGATGTGTTTGGAAGCAATGAATACGGTGGTGCTGCCCATGATCACAAAGAAGTAAAATTGGCTGTGTCTCCAGGAAAAGTGGAGGGGAGGAGAGAGAATCAGGAAGAGTATTTGGAGAGAGAAGATTTCAGATTTGGAAACAGAGATCAGATGAACATGAACAATGAGGCTGAGAAAGGAGGGGATGGGATTGGAAAAGCCAAAGTGATGCCTCCAACAAGTGTGATGACAAGGCTAATTCTCATCATGGTTTGGAGAAAACTCATTAGAAACCCAAACACTTACTCCAGCTTGATCGGCCTCACTTGGTCTCTAGTCTCATTCAGGTGGCACGTTCAAATGCCAGCCATTGTAGCGAAGTCCATCGCCATACTATCTGATGCAGGACTTGGCATGGCCATGTTCAGCCTCGGTTTGTTTATGGCTTTGCAGCCAAAGATCATAGCTTGTGGAAACTCCGTTGCAGCTTTTGCCATGGCTGTGAGATTCCTTACAGGTCCAGCTGTCATGGCAGCTGCTTCCATTGCTGTTGGCTTAAGAGGCACTCTCTTACATGTTGCCATTGTACAGGCAGCCCTACCCCAAGGAATTGTTCCCTTTGTCTTTGCCAAGGAATACAATGTACACCCTGATATTCTCAGCACGGGGGTTATATTTGGAATGTTGATTGCGTTGCCCATAACGCTTGTTTACTACATTTTGTTGGGGCTATGA(SEQ ID NO:1)

MdPIN1基因編碼的氨基酸序列如下：

MITLSDFYHVMTAVVPLYVAMILAYGSVKWWKIFTPDQCSGINRFVALFAVPLLSFHFISTNDPYNMNTRFIAADTLQKLIVLAVLGVWTKVSKRGCLEWTITLFSVSTLPNTLVMGIPLLKGMYGDFSGSLMVQIVVLQCIIWYTLMLFMFEYRGARLLISEQFPDTAGSIVSIHVDSDIMSLDGRQPLETEAEIKEDGKLHVTVRKSNASRSDILSRRSQGLSSTTPRPSNLTNAEIYSLQSSRNPTPRGSSFNHTDFYSMMAAGRNSNFGANDVYGMSASRGPTPRPSNFEEDGGGGAVSSATGNKPRFYHGGQNNAVAHYPAPNPGMFSPTASRTVTANANSNAMNAKRANGQAQKTEDTNGGKDLHMFVWSSSASPVSDVFGSNEYGGAAHDHKEVKLAVSPGKVEGRRENQEEYLEREDFRFGNRDQMNMNNEAEKGGDGIGKAKVMPPTSVMTRLILIMVWRKLIRNPNTYSSLIGLTWSLVSFRWHVQMPAIVAKSIAILSDAGLGMAMFSLGLFMALQPKIIACGNSVAAFAMAVRFLTGPAVMAAASIAVGLRGTLLHVAIVQAALPQGIVPFVFAKEYNVHPDILSTGVIFGMLIALPITLVYYILLGL(SEQ ID NO:2)

從嘎啦蘋果組培苗中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)國際基因庫中已發(fā)布的擬南芥中PIN1的保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物，進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)。將合適大小的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，并進(jìn)行測序分析確認(rèn)，最后得到cDNA全長序列。

該基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1863bp。由此推得，該基因編碼620個(gè)氨基酸，基因序列號為MDP0000138035，位于第6號染色體，包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。將其氨基酸序列在國際基因庫中檢索，發(fā)現(xiàn)與已公布的擬南芥相關(guān)基因AtPIN1有較高的同源性，所以我們將該基因命名為MdPIN1。

本發(fā)明第三方面公開了前述蘋果生長素運(yùn)輸載體基因MdPIN1在調(diào)節(jié)植株生長素運(yùn)輸和/或根系發(fā)育中的用途。

進(jìn)一步的，所述蘋果MdPIN1基因在根系發(fā)育中的用途，為提高主根長度并抑制側(cè)根數(shù)目。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蘋果MdPIN1基因影響根系生長素運(yùn)輸，但對根系生長素合成沒有顯著影響。

本發(fā)明第四方面公開了一種核酸構(gòu)建體，包含處于強(qiáng)啟動子控制下的前述蘋果生長素運(yùn)輸載體基因MdPIN1。

進(jìn)一步的，所述強(qiáng)啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子。

利用強(qiáng)啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子)驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將MdPIN1基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。MdPIN1影響根系生長素運(yùn)輸，MdPIN1超量表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出主根長度受到抑制，側(cè)根數(shù)目增多的表型，說明MdPIN1基因在植株生長素運(yùn)輸和根系發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于，發(fā)明人首次在蘋果中分離出一個(gè)新型的調(diào)節(jié)植株生長素運(yùn)輸和根系發(fā)育的生長素運(yùn)輸載體基因。

附圖說明

圖1載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

(A:蘋果MdPIN1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳MdPIN1:MdPIN1基因擴(kuò)增產(chǎn)物，Mark:分子量標(biāo)記DM2000；B：35S:MdPIN1結(jié)構(gòu)示意圖；C：RT-PCR分析MdPIN1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥L1，L2,L3株系中的表達(dá)水平)；

圖2 MdPIN1對植株生長素運(yùn)輸?shù)挠绊?/p>

(A-B：根系向地性實(shí)驗(yàn)，C-D：植株向光性實(shí)驗(yàn))；

圖3 MdPIN1對植株生長素合成沒有顯著影響

(A：DR5-GUS染色觀察生長素積累情況B：定量PCR檢測野生性擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥及生長素合成基因YUC1，YUC2，YUC4，YUC6，TAA1表達(dá)量)；

圖4 MdPIN1調(diào)節(jié)根系發(fā)育

(A：生長10天的野生型擬南芥(Col-0)和轉(zhuǎn)基因擬南芥(L1，L2，L3)根系系統(tǒng)觀察；B-C：轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，主根長度明顯受到抑制，側(cè)根數(shù)目顯著增多，Bars＝1cm)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過分子克隆技術(shù)研究了蘋果生長素運(yùn)輸相關(guān)基因MdPIN1在調(diào)節(jié)根系發(fā)育，影響生長素運(yùn)輸中的應(yīng)用。利用35S強(qiáng)啟動子驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將MdPIN1基因在擬南芥中異位表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥；MdPIN1在擬南芥中超量表達(dá)影響植株根系生長素運(yùn)輸，但是對生長素合成沒有顯著影響。進(jìn)一步表型觀察發(fā)現(xiàn)，MdPIN1在擬南芥中超量表達(dá)可以顯著抑制主根伸長，并促進(jìn)側(cè)根數(shù)目增多。

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 嘎啦蘋果MdPIN1基因的克隆

1.嘎啦蘋果組培葉片RNA提取

通過CTAB法提取嘎啦蘋果組培葉片的總RNA，包括以下步驟：

1)取1.5g經(jīng)200mM NaCl鹽處理24小時(shí)的嘎啦蘋果組培苗，放入預(yù)冷的研缽，加液氮磨碎，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管中；

2)迅速加入10ml預(yù)熱到65℃的提取緩沖液(CTAB 20％w/v，Tris-HCl 0.1mol/l，EDTA 25mol/l，NaCl 2mol/l，巰基乙醇2％w/v，PVP 2％w/v，無RNA酶的雙蒸水定容，其中PVP和巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)，輕輕混勻，65℃水浴中0.5小時(shí)；

3)加入與上步離心管液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩0.5小時(shí)，4℃、12,000rpm離心20分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中；

4)加入1/3上清液體積的10mol/L預(yù)冷LiCl，-20℃放置3小時(shí)，12,000rpm離心30分鐘，棄上清液；

5)加入500μl SSTE緩沖液(NaCl 1mol/l，SDS 0.5％w/v，EDTA 10mol/l，無RNA酶的雙蒸水定容)充分懸浮沉淀后，平均分裝到2支1.5ml離心管中；

6)分別加入與懸浮液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；

7)分別加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；

8)加入2.5倍上清液體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置1-2小時(shí)；

9)于4℃、12,000rpm離心20分鐘，70％乙醇洗2次；

10)于4℃、14,000rpm離心10分鐘，超凈臺上風(fēng)干沉淀；加入20μl DEPC水溶解RNA。

11)置-80℃儲藏備用，或立即進(jìn)行以下反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

2.將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA

總RNA的反轉(zhuǎn)錄使用市售的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，獲得反轉(zhuǎn)錄cDNA。

3.MdPIN1全長DNA序列的擴(kuò)增

設(shè)計(jì)兼并引物(MdPIN1-F/MdPIN1-R)，以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

MdPIN1-F：5’-CCACTCAATCTCTCTGCCAAT-3’(SEQ ID NO:3)；

MdPIN1-R：5’-GACTGGTGAGAGGGAGAGTT-3’(SEQ ID NO:4)。

PCR擴(kuò)增體系：純化的cDNA產(chǎn)物25μl，5×TdT緩沖液10μl，0.1％BSA5μl，10mM dCTP 2.5μl，TdT 15U，雙蒸水定容至50μl。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5分鐘；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10分鐘。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，回收PCR產(chǎn)物并將其連接到pMD-18T載體上，獲得pMD18-T-MdPIN1質(zhì)粒。測序(北京六合華大基因科技股份有限公司)結(jié)果顯示，MdPIN1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。測序正確的單克隆，堿法提取pMD18-T-MdPIN1的質(zhì)粒DNA，-20℃保存，用于后續(xù)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(附圖1A)

4.蘋果MdPIN1生物信息學(xué)分析

通過GDR數(shù)據(jù)庫(http://www.rosaceae.org/)分析MdPIN1基因的染色體位置和基因組結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，MdPIN1定位于蘋果基因組的第6號染色體上，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。

MdPIN1基因編碼區(qū)含有1863bp的核苷酸，利用DNASTAR相關(guān)軟件進(jìn)行序列分析，蘋果MdPIN1基因編碼620個(gè)氨基酸。通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的數(shù)據(jù)庫和expasy網(wǎng)站(http://www.expasy.org/)的分析軟件，對MdPIN1蛋白預(yù)測序列的功能結(jié)構(gòu)域和保守域進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MdPIN1預(yù)測蛋白在9-615aa含有6個(gè)連續(xù)的跨膜結(jié)構(gòu)域，這對于MdPIN1蛋白的膜定位至關(guān)重要。

實(shí)施例2 MdPIN1基因載體的構(gòu)建

為進(jìn)一步研究MdPIN1基因的功能，將包含有MdPIN1基因編碼區(qū)在內(nèi)的共1863bp片段正確插入表達(dá)載體pCAMBIA 1300上(附圖1B)。

1.利用DNAMAN軟件，根據(jù)分離出的MdPIN1基因的核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物EMdPIN1-F和EMdPIN1-R(SEQ ID NO:18-19)，以實(shí)例1保存的pMD18-T-MdPIN1的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增帶有EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)的MdPIN1序列。

EMdPIN1-F：5’-CTGCAGCCACTCAATCTCTCTGCCAAT-3’(SEQ ID NO:5)，劃橫線部分為PstⅠ酶切位點(diǎn)；

EMdPIN1-R：5’-GGATCCGACTGGTGAGAGGGAGAGTT-3’(SEQ ID NO:6)，劃橫線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序同實(shí)施例1，僅將引物和模板進(jìn)行替換。

2.PCR反應(yīng)結(jié)束后，1.0％瓊脂糖凝膠電泳、PCR產(chǎn)物回收、載體連接、轉(zhuǎn)化、測序。堿法提取其質(zhì)粒DNA，用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切，鑒定正確后用于后面的實(shí)驗(yàn)。

3.用PstⅠ和BamHⅠ兩個(gè)內(nèi)切酶，同時(shí)雙酶切前一步驟所得質(zhì)粒DNA與pCAMBIA 1300質(zhì)粒，回收MdPIN1的片段和pCAMBIA 1300載體片段，用T4連接酶將二者連接起來。篩選陽性克隆進(jìn)行測序，從中選擇正確的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1。

4.用構(gòu)建好的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LB4404感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行PCR鑒定，挑取陽性菌落進(jìn)行測序。測序正確的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1單克隆用于后面擬南芥的轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例3 獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥

將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水。播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(直接鋪于表面)，光培養(yǎng)(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)，至小苗長出。移栽到基質(zhì)培養(yǎng)到開花。

挑取農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于10mL YEP液體培養(yǎng)基(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8(約48h)；取其中l(wèi)mL菌液加入20mL YEP液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8(約5h)。離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)懸浮稀釋20倍，備用；

將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·L^-1潮霉素抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過連續(xù)3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進(jìn)行表型分析。

利用篩選培養(yǎng)基(含100mg/L潮霉素)篩選抗潮霉素陽性的候選轉(zhuǎn)基因株系，共獲得3個(gè)35S:MdPIN1陽性株系(L1、L2、L3)；為進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因株系，在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，每株系各取0.1g左右的組培苗，提取相應(yīng)的RNA，反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行半定量PCR檢測，以確定這些株系中MdPIN1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MdPIN1基因在L1、L2及L3中過量表達(dá)(附圖1C)。

實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系表型

作為生長素輸出載體，PIN1基因調(diào)控生長素運(yùn)輸。為了研究MdPIN1對生長素運(yùn)輸?shù)挠绊?，我們?shí)施根系向地性實(shí)驗(yàn)和向光性實(shí)驗(yàn)。

1.根系向地性實(shí)驗(yàn)

取野生型(Col-0)和轉(zhuǎn)基因擬南芥豎直培養(yǎng)生長6天的幼苗暗處傾斜135°培養(yǎng)，分別在生長8h,18h,28h時(shí)拍照觀察，并計(jì)算主根彎曲度數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，35S::MdPIN1轉(zhuǎn)基因擬南芥彎曲度數(shù)更大(附圖2A-B)，暗示轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素運(yùn)輸可能受到影響。

2.向光性實(shí)驗(yàn)

取野生型(Col-0)和轉(zhuǎn)基因擬南芥暗處生長5天的幼苗在單側(cè)光照下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)植株下胚軸彎曲角度。結(jié)果顯示，野生型擬南芥相比，35S::MdPIN1轉(zhuǎn)基因擬南芥下胚軸彎曲度數(shù)更大(附圖2C-D)。以上結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素運(yùn)輸可能受到影響。

實(shí)施例5 MdPIN1對生長素合成沒有顯著影響

DR5作為生長素的Mark基因，可以用來種子雜交。選擇生長狀態(tài)良好的DR5-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張憲省教授提供)以及MdPIN1轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行雜交。雜交成功后，收集果莢，PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過連續(xù)3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進(jìn)行表型分析。

GUS染色液染色觀察根系中生長素積累情況。結(jié)果顯示，在DR5-GUS/MdPIN1雜交植株中，主根根尖與側(cè)根原基部位GUS染色沒有顯著差異，說明超量表達(dá)MdMIEL1基因可能不影響生長素積累(附圖3A)。

定量PCR檢測野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素合成基因(AtYUC1，AtYUC2，AtYUC4，AtYUC6，AtTAA1)表達(dá)量(檢測方法參考Mashiguchi K,Tanaka K,Sakai T,et al.The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(45):18512-18517.)。結(jié)果顯示，擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素合成基因沒有顯著差異，暗示MdPIN1基因可能不影響生長素的合成(附圖3B)。

實(shí)例6 MdPIN1調(diào)控根系發(fā)育

為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因植株的功能，將擬南芥播種在豎直的MS培養(yǎng)基上，觀察擬南芥根系發(fā)育表型。

(1)種子處理。將獲得的擬南芥種子(Col-0，L1，L2，L3)，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水。播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上。4℃層積處理4天后至光下培養(yǎng)(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。

(2)選擇萌發(fā)后4天左右、根系發(fā)育一致的野生型擬南芥(Col-0)和轉(zhuǎn)基因擬南芥(L1，L2，L3)，轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。繼續(xù)培養(yǎng)6天后，觀察擬南芥根系表型并拍照。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，超量表達(dá)MdPIN1的轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度明顯受到抑制，側(cè)根數(shù)目顯著增多。(附圖4A-C)

綜上所述，MdPIN1基因不僅影響生長素運(yùn)輸，對根系發(fā)育也有顯著影響。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。