本發(fā)明涉及一種抗除草劑抗蟲融合基因、編碼蛋白及應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：雜草和病蟲害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響產(chǎn)量的最重要的生物因素。如何降低雜草和病蟲害的防治成本、提高防治效率、減少防治過程中給環(huán)境造成污染是農(nóng)業(yè)科學(xué)研究最關(guān)鍵的問題。雜草時伴隨著人類的生產(chǎn)活動而產(chǎn)生的，它們的存在是長期適應(yīng)氣候、土壤、作物、耕作制度及社會因素與栽培作物競爭的結(jié)果。人類從開始從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)就在防治雜草，但是當(dāng)時的雜草防治僅僅是一種極為粗放的初級勞動。隨著科學(xué)的發(fā)展，特別是近代生命科學(xué)的發(fā)展進步，人類可以通過基因工程的方法賦予農(nóng)作物耐受各種除草劑的特性，通過噴施除草劑就可以很好的防治雜草，把人類從初級勞動中解放出來，極大的提高效率。目前，國際上使用最廣泛以及國內(nèi)研究最多的是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物，其次是抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物，最近陶氏益農(nóng)公司研發(fā)了抗2,4-D作物，孟山都公司研發(fā)了抗麥草畏作物。能賦予農(nóng)作物草甘膦抗性的基因很多，包括突變的對磷酸烯醇式丙酮酸具有高親和性，而對草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,etal.1995,CropScience,35(5):1451-1461)、aroA(ComaiL,SenLC,StalkerDM.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中國專利：200910098129.X)、G10(中國專利：201110009329.0)；草甘膦解毒基因，包括可以把草甘膦轉(zhuǎn)化為氨甲基磷酸的草甘膦氧化還原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosatetolerantplants)和可以把草甘膦轉(zhuǎn)化為N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因(glyphosateN-Acetylation,GAT)(CastleLA；SiehlDL；GortonR；PattenPA；ChenYH；BertainS；ChoHJ；DuckN；WongJ；LiuD；LassnerMW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,etal.2004,WO2002036782A3；2002,WO2002036782A2；GreenJM,HazelCB,RaymondFD,etal.2008,PestManagementScience,64(4):332-9.)。抗草銨膦的基因包括bar(ThompsonCJ；MovvaNR；TizardR；CrameriR；DaviesJE；LauwereysM；BottermanJ.1987,EmboJournal,6(9),2519-23；White,J.,Chang,S.Y.P.,Bibb,M.J.,&Bibb,M.J.1990,NucleicAcidsResearch,18(4),1062-1062.)，pat(Wohlleben,W.,Arnold,W.,Broer,I.,Hillemann,D.,Strauch,E.,&Pühler,A.1988,gene70:25-37.Gene,70(1),25-37)。抗麥草畏的基因DMO(J.Biol.Chem.2005；美國專利：7022896)?？?,4-D基因TfdA(LyonB.R.,LlewellynD.J.,HuppatzJ.L.,DennisE.S.,andPeacockW.J.,1989,PlantMol.Biol.,13(5):533-540)害蟲給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失，目前害蟲防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但是農(nóng)藥的使用加重了生產(chǎn)成本，并且農(nóng)藥殘留對人體健康帶來嚴(yán)重危害。因此，利用基因工程方法防治害蟲具有重大經(jīng)濟、環(huán)境和社會價值。獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的關(guān)鍵技術(shù)是克隆優(yōu)良殺蟲蛋白質(zhì)。殺蟲蛋白質(zhì)有很多，使用得最為廣泛的是蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)在產(chǎn)胞期間可以分泌一種伴胞晶體蛋白(ICP)，如Cry1Ab，Cry1C等，這些蛋白對鱗翅目鞘翅目等昆蟲(比如小菜蛾)有很強的殺傷作用(Schnepf,E.,Crickmore,N.,Van,R.J.,Lereclus,D.,Baum,J.,&Feitelson,J.,etal.1998,62(3),775-806.)，目前已被深入研究和廣泛使用，玉米、大豆、土豆、棉花等轉(zhuǎn)Bt基因作物已得到大規(guī)模商業(yè)化種植。蘇云金芽胞桿菌在營養(yǎng)生長期間,還會分泌一種與ICPs無氨基酸序列同源性、殺蟲機理完全不同的蛋白,即營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetativeinsecticidalproteins,VIPs)，如Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D、Vip3H，對一些對ICPs不敏感的害蟲也有殺蟲活性,并且不會發(fā)生交叉抗性(Estruch,J.J.,Warren,G.W.,Mullins,M.A.,Nye,G.J.,Craig,J.A.,&Koziel,M.G.1996,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,93(11),5389-94.)。第一代轉(zhuǎn)基因作物大多只具有抗蟲或者抗除草劑的單一性狀，而第二代轉(zhuǎn)基因作物正在向同時抗蟲抗除草劑等復(fù)合性狀發(fā)展。獲得具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物有多種方法，比如通過對具有單一性狀的轉(zhuǎn)基因作物的雜交；通過將多個基因表達框構(gòu)建在同一個表達框里面；通過共轉(zhuǎn)化，將多個含有單基因的農(nóng)桿菌混在一起，進行混合轉(zhuǎn)化，篩選出多個基因同時整合了兩個或多個質(zhì)粒T-DNA的轉(zhuǎn)基因植株。但是上述方法在實際操作和應(yīng)用中都還存在一些問題。因此，獲得更為簡單高效的獲得具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物的方法是當(dāng)下需要切實解決的問題。(三)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種基因，這種基因具有抗除草劑和抗蟲復(fù)合性狀，可以用來生產(chǎn)抗除草劑抗蟲植物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種抗除草劑抗蟲融合基因，所述的基因包括編碼抗除草劑蛋白的核苷酸序列和編碼抗蟲蛋白核苷酸序列；且上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內(nèi)；抗除草劑蛋白和抗蟲蛋白可以為全長或者截斷后的活性多肽片段，具體所述融合基因由抗除草劑蛋白編碼基因和抗蟲蛋白編碼基因構(gòu)成；所述抗除草劑蛋白編碼基因為下列之一：抗草甘膦基因CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,etal.1995,CropScience,35(5):1451-1461)、抗草甘膦基因aroA(ComaiL,SenLC,StalkerDM.1983,Science,221(4608)：370-371)、抗草甘膦基因G7(中國專利：200910098129.X)、抗草甘膦基因G10(中國專利：201110009329.0)、抗草甘膦基因GOX(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosatetolerantplants)、抗草甘膦基因GAT(CastleLA；SiehlDL；GortonR；PattenPA；ChenYH；BertainS；ChoHJ；DuckN；WongJ；LiuD；LassnerMW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,etal.2004,WO2002036782A3；2002,WO2002036782A2；GreenJM,HazelCB,RaymondFD,etal.2008,PestManagementScience,64(4):332-9.)、抗草銨膦基因bar(ThompsonCJ；MovvaNR；TizardR；CrameriR；DaviesJE；LauwereysM；BottermanJ.1987,EmboJournal,6(9),2519-23；White,J.,Chang,S.Y.P.,Bibb,M.J.,&Bibb,M.J.1990,NucleicAcidsResearch,18(4),1062-1062.)、抗草銨膦基因pat(Wohlleben,W.,Arnold,W.,Broer,I.,Hillemann,D.,Strauch,E.,&Pühler,A.1988,gene70:25-37.Gene,70(1),25-37)、抗麥草畏基因DMO(J.Biol.Chem.2005；美國專利：7022896)或抗2,4-D基因TfdA(LyonB.R.,LlewellynD.J.,HuppatzJ.L.,DennisE.S.,andPeacockW.J.,1989,PlantMol.Biol.,13(5):533-540)；所述抗蟲蛋白編碼基因為下列之一：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2、Cry3、Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D或Vip3H。進一步，優(yōu)選所述融合基因由抗除草劑蛋白編碼基因Bar和抗蟲蛋白編碼基因Vip3A構(gòu)成，所述融合基因的核苷酸序列為SEQIDNO.1所示。進一步，優(yōu)選所述融合基因由抗除草劑蛋白編碼基因GAT和抗蟲蛋白編碼基因Cry1Ab構(gòu)成，所述融合基因的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示。本發(fā)明還提供一種所述抗除草劑抗蟲融合基因編碼蛋白，當(dāng)抗除草劑基因為bar，所述的抗蟲基因為Vip3A時，所述編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.3所示，當(dāng)抗除草劑基因為GAT，所述的抗蟲基因為Cry1Ab時，所述編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.4所示。此外，本發(fā)明還提供一種所述抗除草劑抗蟲融合基因編碼蛋白在制備抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，所述作物包括單子葉作物和雙子葉作物，更優(yōu)選所述作物為玉米、水稻、大豆、小麥和油菜中的一種。本發(fā)明設(shè)計的用抗除草劑蛋白和抗蟲融合成的人工蛋白質(zhì)分子，與現(xiàn)有的抗除草劑蛋白或者抗蟲蛋白相比具有如下優(yōu)點：同時具備抗除草劑和抗蟲的特性；在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物時，植株中抗除草劑蛋白質(zhì)分子和抗蟲蛋白質(zhì)分子一樣多。本發(fā)明提供的抗除草劑抗蟲融合蛋白可以應(yīng)用于單子葉植物和雙子葉植物的抗蟲抗除草劑方面，主要應(yīng)用于抗除草劑抗蟲玉米、水稻、大豆、小麥和油菜。(四)附圖說明圖1：抗除草劑抗蟲融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。融合蛋白中的抗蟲蛋白質(zhì)多肽和抗除草劑蛋白質(zhì)多肽可以分別在N端和C端或者分別在C端和N端。圖2：融合蛋白表達載體T-DNA的結(jié)構(gòu)示意圖。pUBI為玉米泛素啟動子，融合蛋白為抗蟲抗除草劑融合蛋白基因，p35S為花椰菜花葉病毒35S啟動子，G10EPSPS為抗草甘膦基因。(五)具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：本發(fā)明以下實施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology和J.Sambrook等編寫ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文獻均有詳細的說明。實施例1抗除草劑抗蟲融合蛋白表達載體的構(gòu)建抗草銨膦基因bar和抗蟲基因Vip3A融合構(gòu)成的融合基因被命名為bar-Vip3A基因，編碼的蛋白質(zhì)多肽序列如SEQIDNO：3所示?？共莞熟⒒騁at和抗蟲基因Cry1Ab融合構(gòu)成的融合基因被命名為Gat-Cry1Ab基因，編碼的蛋白質(zhì)多肽序列如SEQIDNO：4所示。bar-Vip3A(SEQIDNO：1)基因和Gat-Cry1Ab(SEQIDNO：2)基因都是通過人工合成獲得，且都在5’端設(shè)置了BamHI酶切位點，都在3’端添加了人工合成的終止子，且設(shè)置了KpnI酶切位點。pUBI為玉米泛素蛋白啟動子，通過PCR獲得。設(shè)計PCR引物pUBI-F(5’GAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCC)和pUBI-R(5’GGGTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAAC)，以商業(yè)玉米品種鄭單958的基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得pUBI。PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分鐘，重復(fù)32個循環(huán)；然后72℃10分鐘。將獲得的大約2.0Kb的PCR產(chǎn)物克隆到T-載體pMD19中。然后，用HindIII和BamHI雙酶切得到pUBI，并且DNA序列測定表明核苷酸序列正確(SEQIDNO：5)。G10EPSPS為抗草甘膦基因(中國專利：201110009329.0)。通過人工合成G10EPSPS基因(SEQIDNO：6)。合成的基因5’端連接有玉米乙酰乳酸合成酶AHAS葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽且設(shè)置有XhoI酶切位點，3’端連接有終止子且設(shè)置有XhoI酶切位點。農(nóng)桿菌T-DNA載體的構(gòu)建：雙元載體pCambia1300-p35S-G10由載體pCambia1300修改而來，簡單的說就是把pCambia1300載體中的抗潮霉素基因置換為抗草甘膦基因G10EPSPS。具體把pCambia1300載體經(jīng)過XhoI酶切以后，去磷酸化處理，然后與經(jīng)過XhoI酶切后的獲得的人工合成的含有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽和終止子的G10EPSPS基因片段進行兩端連接，轉(zhuǎn)化，獲得的載體即為pCambia1300-p35S-G10。為了獲得bar-Vip3A基因表達載體，用HindIII和KpnI對之前構(gòu)建好的pCambia1300-p35S-G10進行雙酶切，回收獲得載體；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI啟動子的質(zhì)粒，獲得pUBI片段；用BamHI和KpnI對含有人工合成的bar-Vip3A基因及其終止子的質(zhì)粒，回收得到bar-Vip3A片段。然后，把上述酶切后的載體和兩個片段進行三段連接，獲得終載體。獲得的T-DNA結(jié)構(gòu)為：“啟動子-融合基因-終止子-啟動子-G10EPSPS-終止子”。這個載體命名為：pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174(圖2)。為了獲得Gat-Cry1Ab基因表達載體，用HindIII和KpnI對之前構(gòu)建好的pCambia1300-p35S-G10進行雙酶切，回收獲得載體；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI啟動子的質(zhì)粒，獲得pUBI片段；用BamHI和KpnI對含有人工合成的Gat-Cry1Ab基因及其終止子的質(zhì)粒，回收得到Gat-Cry1Ab片段。然后，把上述酶切后的載體和兩個片段進行三段連接，獲得終載體。獲得的T-DNA結(jié)構(gòu)為：“啟動子-融合基因-終止子-啟動子-G10EPSPS-終止子”。這個載體命名為：pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174(圖2)。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把上述2個T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實施例2、水稻的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌，龔祖塤(1998)生命科學(xué)10：125-131；劉凡等(2003)分子植物育種1：108-115)。選取成熟飽滿的“秀水-134”種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。分別取實施例1中構(gòu)建的載體pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174的農(nóng)桿菌劃板。挑單菌落接種，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入OD為0.6左右的農(nóng)桿菌菌液中(農(nóng)桿菌菌液的制備：將農(nóng)桿菌接種至培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD為0.6左右；培養(yǎng)基組成：3g/LK2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/LNH4Cl、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.15g/LKCl、0.01g/LCaCl2、0.0025g/LFeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶劑為水，pH＝5.8)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2mg/L2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培養(yǎng)2-3天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃篩選培養(yǎng)兩個月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/LABA+1mg/LNAA+5mg/L6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上，28℃培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基上，每天14小時光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，選擇產(chǎn)量高、種子大或者生物量高等能夠提高水稻產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因株系，培育新品種。分別獲得含上述轉(zhuǎn)化載體和只含有篩選標(biāo)記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株。實施例3、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以抗除草劑將實施例2方法制備的轉(zhuǎn)基因水稻植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因水稻植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“秀水-134”的抗除草劑性能進行比較分析。我們獲得的86個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BV)進行不同濃度草銨膦抗性測定，抗性效果如表1所示：表1*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)655230*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積1:50稀釋。我們獲得的60個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表2所示：表2*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)605858*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。實施例4、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以殺蟲將實施例2方法制備的轉(zhuǎn)基因水稻植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因水稻植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“秀水-134”的殺蟲性能進行比較分析。我們獲得的86個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BV)進行抗蟲性測定，抗性效果如表3所示：表3*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率粘蟲61100％甜菜夜蛾61100％*注：表一為對播種后30天的水稻葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。我們獲得的60個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表4所示：表4*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率玉米螟45100％棉鈴蟲45100％*注：表一為對播種后30天的水稻葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。實施例5、玉米的轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)比較成熟。參考文獻如:VladimirSidorov&DavidDuncan(inM.PaulScott(ed.),MethodsinMolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；YujiIshida,YukohHiei&ToshihikoKomari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformationofmaize.NatureProtocols2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小為1.0-1.5mm)。將實施例1中制備的含有T-DNA載體pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174的農(nóng)桿菌與未成熟胚在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培養(yǎng)2-3天(22℃)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+5mg/LAgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培養(yǎng)10-14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基(與愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮含草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/Lkinetin+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培養(yǎng)10-14天，每皿一個株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10-14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全。分別獲得含轉(zhuǎn)化載體pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174的轉(zhuǎn)基因玉米植株。實施例6、融合蛋白轉(zhuǎn)基因玉米可以抗除草劑將實施例5制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株的T0代植株移栽到溫室中，用商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)的花粉進行授粉，收獲T0代種子。然后將這些品系與商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)進行回交轉(zhuǎn)育，獲得Z58近等位基因系。再對這些近等位基因系的除草劑抗性進行比較分析。我們獲得的52個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為ZmBV)進行不同濃度草銨膦抗性測定，抗性效果如表5所示：表5*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)423219*注：表一為對3葉1心期的玉米植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照(清水)的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:50稀釋。我們獲得的55個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為ZmGC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表6所示：表6*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)555555*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。實施例7、融合蛋白轉(zhuǎn)基因玉米可以殺蟲將實施例5制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因玉米植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“Z58”的殺蟲性能進行比較分析。我們獲得的52個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為ZmBV)進行抗蟲性測定，抗性效果如表7所示：表7*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率粘蟲39100％甜菜夜蛾39100％*注：表一為對玉米葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。我們獲得的55個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為ZmGC)進行抗蟲性測定，抗性效果如表8所示：表8*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率玉米螟42100％棉鈴蟲42100％*注：表一為對玉米葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。實施例8.大豆轉(zhuǎn)化這里使用的獲得轉(zhuǎn)基因大豆的步驟來自于已有的技術(shù)(Dengetal.,1998,PlantPhysiologyCommunications34:381-387；Maetal.,2008,ScientiaAgriculturaSinica41:661-668；Zhouetal.,2001,JournalofNortheastAgriculturalUniversity32:313-319)。選取健康、飽滿、成熟的大豆，用80％乙醇消毒2分鐘，再用無菌水清洗，然后放置在充滿氯氣(由50mlNaClO與2ml濃HCl反應(yīng)生成)的干燥器中滅菌4-6個小時。滅菌后的“天隆1號”大豆在超凈工作臺里被播撒到B5培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)5天，同時光密度在90-150μmol光子/m2·s水平。當(dāng)子葉變綠并頂破種皮，無菌的豆芽就會長出。去掉了下胚軸的豆芽在長度上被切成五五開，使得兩片外植體都具有子葉和上胚軸。在子葉和上胚軸的節(jié)點處切外植體大約7-8處，即可用作被侵染的目標(biāo)組織。分別含有載體pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A-p35S-1174和pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab-p35S-1174的單克隆農(nóng)桿菌被分開培養(yǎng)待用。準(zhǔn)備好的外植體浸沒在農(nóng)桿菌懸浮液中共培養(yǎng)30分鐘左右。然后，將侵染的組織上多余的細胞懸浮液用吸水紙吸收干凈，再轉(zhuǎn)移到1/10B5共培養(yǎng)培養(yǎng)基里，25℃暗培養(yǎng)3-5天。共培養(yǎng)的植物組織用B5液體培養(yǎng)基清洗，以除去多余的農(nóng)桿菌，然后放置到B5固體培養(yǎng)基中25℃下培養(yǎng)5天，待其發(fā)芽。誘導(dǎo)發(fā)生的胚芽組織轉(zhuǎn)移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5篩選培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)4周，期間每兩周更換一次培養(yǎng)基。篩選出來的胚芽組織再轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)，待其長成小苗。隨后，將轉(zhuǎn)基因植株苗轉(zhuǎn)移到1/2B5培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)。最后，長成的小植株經(jīng)清洗去除瓊脂后栽種在溫室中。實施例9、融合蛋白轉(zhuǎn)基因大豆可以抗除草劑將實施例8方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“天隆1號”的抗除草劑性能進行比較分析。我們獲得的41個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A-p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BV)進行不同濃度草銨膦抗性測定，抗性效果如表9所示：表9*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)312518*注：表一為對播種后20天的大豆植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:50稀釋。我們獲得的36個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表10所示：表10*：1x2x3x抗性轉(zhuǎn)化事件個數(shù)362821*注：表一為對播種后20天的大豆植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。實施例10、融合蛋白轉(zhuǎn)基因大豆可以殺蟲將實施例8方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“天隆1號”的殺蟲性能進行比較分析。我們獲得的41個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-Vip3A–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BV)進行抗蟲性測定，抗性效果如表11所示：表11*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率粘蟲29100％甜菜夜蛾29100％*注：表一為對播種后30天的大豆葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。我們獲得的36個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-Gat-Cry1Ab–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行抗蟲性測定，抗性效果如表12所示：表12*：害蟲有效轉(zhuǎn)化事件個數(shù)殺蟲率玉米螟22100％棉鈴蟲22100％*注：表一為對播種后30天的大豆葉片進行不同害蟲的殺蟲效果檢測。每個實驗都至少設(shè)置3個重復(fù)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3