本發(fā)明屬于植物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白及核酸和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鹽漬是造成農(nóng)作物減產(chǎn)、耕作面積減少的主要原因之一。因此，提高作物的耐鹽能力，將對我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟可持續(xù)性發(fā)展做出積極貢獻。而解決這個問題重要方法就是通過生物技術(shù)培育出優(yōu)良的耐鹽新品種，其中不可或缺的是利用植物的耐鹽基因資源。植物在應(yīng)對逆境脅迫時,從時間、空間上構(gòu)成了嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)，基因表達的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及蛋白質(zhì)水平等調(diào)控手段構(gòu)成了協(xié)調(diào)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。這些基因并非孤立地在鹽脅迫應(yīng)答中起作用,而是通過信號網(wǎng)絡(luò)的整合作用,協(xié)調(diào)一致地發(fā)揮作用,使植物在鹽漬脅迫下,保持細胞和整個植物體內(nèi)的離子平衡；保持細胞與環(huán)境及細胞間的水分和滲透平衡；維護蛋白質(zhì)、核酸生物大分子的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；保持生理代謝、能量代謝平衡。研究表明，植物的耐鹽性是一個受多基因控制的數(shù)量性狀，十分復(fù)雜。植物通過植株整體生理、代謝的調(diào)節(jié)、基因表達等的調(diào)控抵御不利的鹽漬環(huán)境。有報道稱，當(dāng)一些鈉/氫陽離子轉(zhuǎn)運體、轉(zhuǎn)錄因子、滲透物質(zhì)合成物等的基因被轉(zhuǎn)入植物，并過量表達后，這些轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力都有了不同程度的提高。說明相關(guān)基因在植物耐鹽性方面起著關(guān)鍵的作用。為此，有必要研究與植物耐鹽密切相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物，以期望提高植物的耐鹽能力。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白及核酸和應(yīng)用。本發(fā)明的基因能夠用于改良植物，提高其耐鹽能力。第一方面，本發(fā)明涉及一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白，所述蛋白包含如下氨基酸序列中的一種或多種：如SEQIDNO.3所示的結(jié)構(gòu)域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，以及如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。優(yōu)選地，所述蛋白包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。優(yōu)選地，所述蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼前述GmSLT蛋白的核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸序列如SEQIDNO:1所示。第三方面，本發(fā)明還涉及一種前述核酸序列在增強植物耐鹽能力中的應(yīng)用。第四方面，本發(fā)明涉及一種含有前述核酸序列的重組表達載體。第五方面，本發(fā)明涉及一種含有前述核酸序列的轉(zhuǎn)基因細胞系。第五方面，本發(fā)明涉及一種含有前述核酸序列的重組菌株。第七方面，本發(fā)明還涉及一種提高植物耐鹽能力的方法，包括如下步驟：將權(quán)前述的核酸序列導(dǎo)入植物中，培育，獲得耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物、雙子葉植物、或裸子植物。優(yōu)選地，所述植物為農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物。優(yōu)選地，所述植物為大豆、水稻、擬南芥、小麥、玉米、棉花、油菜、高粱、或馬鈴薯。第八方面，本發(fā)明還涉及一種培育耐鹽植物的方法，其特征在于，包括如下步驟：將前述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物與目標(biāo)植物雜交，進而獲得耐鹽植物以及雜交后代。第九方面，本發(fā)明還涉及一種提高植物耐鹽能力結(jié)構(gòu)域序列，，所述結(jié)構(gòu)域序列為如SEQIDNO.3所示的結(jié)構(gòu)域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，或者如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明通過生物信息學(xué)及基因時空表達分析，獲得了一種耐鹽基因，命名為GmSLT；將該基因轉(zhuǎn)化酵母，可以明顯提高酵母的耐鹽能力；轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻，也能夠增強相應(yīng)植物的耐鹽性；本發(fā)明的基因能夠用于改良植物，提高其耐鹽能力。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1：GmSLT功能結(jié)構(gòu)域示意圖；圖2：GmSLT表達對酵母W303-1a耐鹽性點滴試驗；圖3：在鹽脅迫條件下過表達GmSLT具有酵母基因與野生型酵母對比；圖4：GmSLT基因關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域在耐鹽中的作用；圖5：轉(zhuǎn)GmSLT水稻To代幼苗GmSLT基因檢測；其中WT為親本，NTC1、NTC2為空白對照，P1，P2為陽性對照；圖6：部分轉(zhuǎn)GmSLT基因水稻植株GmSLT基因的表達檢測；圖7：轉(zhuǎn)GmSLT基因水稻的1#株系T1代幼苗耐鹽試驗結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明實施例中，所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明實施例中所用的材料、試劑、耗材等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明對于適用于本發(fā)明的植物沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉(zhuǎn)化操作，如各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是(不限于):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于)：水稻、擬南芥、小麥、玉米、大豆、棉花、馬鈴薯、油菜等。實施例1、大豆候選基因的克隆通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測得到一些大豆耐鹽候選基因。大豆合豐39幼苗(參考文獻--司振峰，夏大亮，王寶峰，柏合蔭，師轉(zhuǎn)哲，2001。大豆品種-合豐39號。《中國農(nóng)技推廣》,2001(4):33-33)經(jīng)150mM氯化鈉溶液處理后，利用實時熒光定量PCR對這些候選基因進行時空表達模式分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后有多個候選基因變化明顯。其中，GmSLT是上述方法預(yù)測獲得一個大豆耐鹽基因，并進行了大豆幼苗根葉基因時空表達模式分析，在150mM鹽脅迫后表達上調(diào)明顯，推測為大豆耐鹽相關(guān)的基因，并對該基因進行了克隆；根據(jù)預(yù)測基因GmSLT的序列，利用軟件PrimerPremier5設(shè)計一對引物，利用高保真酶KOD擴增。擴增模板是獲得大豆的cDNA(利用鹽脅迫后的大豆幼苗根葉提取RNA再反轉(zhuǎn)錄為cDNA)。1、引物設(shè)計如下:GmSLT-F5’-TCTAGAATGGGCGATACTT-3(SEQIDNO.6)；GmSLT-R5’-GAGCTCTCAAGTCAACATAAGAT-3(SEQIDNO.7)；反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：2、PCR產(chǎn)物純化回收，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海捷瑞)。3、純化產(chǎn)物加A反應(yīng)50μl反應(yīng)體系：72℃連接30min；4、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備1)接種大腸桿菌DH5α，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜(約16小時)；2)取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2-3小時(250-300rpm),至OD600為0.4-0.6；3)將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4)吸取1ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5)4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6)棄去上清，加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7)4℃下3000g冷凍離心5分鐘；8)棄去上清，加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?)細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑(15％-40％甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆?－70℃)。5、連接反應(yīng)使用TaKaRapMD18-Tsimplevector，參照說明書操作。目的片段和載體控制摩爾比約為6：1，加樣混勻。加等體積的solutionI5μl，輕混勻，稍離心，16℃連接數(shù)小時。6、轉(zhuǎn)化取連接反應(yīng)液5μl熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。1)將感受態(tài)細胞從-70℃取出，冰中融化，然后加入5μl連接反應(yīng)液，輕混勻，放于冰中30min；2)42℃水浴中熱擊45秒，迅速放入冰中2min；3)加入890μlLB液體培養(yǎng)基，180rpm，搖床中培養(yǎng)1小時；4)取下層100μl菌液，涂布于LB(Amp/X-gal/IPTG)平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。7、菌落PCR鑒定用牙簽挑取一點白色單菌落，放入100μl無菌水中攪勻，然后用1μl菌液作為模板進行菌落PCR。25μl反應(yīng)體系如下，反應(yīng)條件同本例(1)：8、大腸桿菌質(zhì)粒提取1)挑取單菌落接種于3-5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖培過夜。2)取1-3ml菌液于干凈離心管中，12000r/min離心5min，棄盡上清，收集菌體。3)向沉淀加入200μl預(yù)冷的SolutionI溶液，振蕩混勻，懸浮菌體。4)加入200μlSolutionII，迅速且柔和顛倒離心管數(shù)下混勻(不超過5min)。5)加入200μl預(yù)冷的SolutionIII溶液，顛倒離心管數(shù)下輕混勻，冰上放置5min。6)12000r/min，離心10min。7)小心吸取上清液轉(zhuǎn)入另一個干凈的離心管中，加入400μl(或等體積)Tris飽和酚：氯仿(1∶1)溶液，反復(fù)輕振蕩，混勻，12000r/min離心5min。8)吸取上清液至另一個離心管中(避免吸附蛋白)，加入400μl氯仿，反復(fù)振蕩混勻，12000r/min離心5min。9)小心吸取上清液至另一個離心管中，加入預(yù)冷的2倍體積無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液，混勻后，-20℃放置10min。10)然后，12000r/min離心5-10min，棄盡上清。加入70％乙醇0.5ml洗滌2次，真空干燥或風(fēng)干，沉淀用50μlTE+RNase(20μg/ml)溶解，然后-20℃保存。9、質(zhì)粒酶切鑒定用NEB限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI,20μl體系37℃酶切數(shù)小時。10、測序與分析將菌落PCR和酶切鑒定為陽性的菌落，用單菌落LB+Amp小養(yǎng)過夜，取少量菌液送公司測序，使用通用引物測序，得到序列如SEQIDNO:1所示；將測序結(jié)果與申請人前期預(yù)測的GmSLT序列進行比較，并利用DNAMAN、NCBI、softberry和Phytozome等生物信息學(xué)工具進行分析。實施例2、酵母耐鹽試驗設(shè)計引物擴增耐鹽基因ORF的全長，使其帶有雙酶切位點可以和酵母載體pRUL129相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒。KOD擴增后，連接到pMD-18T，轉(zhuǎn)化DH5α，抽質(zhì)粒雙酶切過夜，膠回收純化后，連接到經(jīng)同樣酶酶切的pRUL129載體。利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法或者電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1A，28℃培養(yǎng)3天，可以見到白色的酵母菌落。挑取單菌落，小養(yǎng)后進行測序驗證正確。1、電轉(zhuǎn)化法釀酒酵母W303-1A感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化本步驟的實施可參考文獻--秦玉靜金建玲鮑曉明高東,1999。影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件。山東大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol.34No.2。1)將轉(zhuǎn)化用酵母菌株的單菌落接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)至飽和；2)轉(zhuǎn)化前一天晚上，在裝有500mlYPD培養(yǎng)基的2L無菌燒瓶中接種適量的過夜培養(yǎng)液，于30℃劇烈振搖，直到細胞密度達1×108(OD600約為1.3-1.5，1：10稀釋約為0.3-0.35)；3)于4℃，4000g離心5min收獲培養(yǎng)細胞，細胞用80ml無菌水重懸。為了增加細胞對電擊的感受性，繼續(xù)步驟4。如果不需要可接步驟6；4)加入10ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入10ml1M乙酸鋰，旋轉(zhuǎn)搖勻，于30℃，85rpm搖動45min；5)加入2.5ml1mol/LDTT,并同時旋轉(zhuǎn)搖動，于30℃85rpm搖動15min；6)將酵母菌懸液洗滌3次，每次以4000-6000g于4℃離心沉淀細胞，依次重懸細胞所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最終菌液體積應(yīng)為1.3-1.5ml，此時菌密度為1×1010。7)電轉(zhuǎn)化前，在無菌冰冷的微量離心管中加入40μl酵母菌細胞和小于等于100ng待轉(zhuǎn)化的DNA(體積小于5μl)，混勻。轉(zhuǎn)移至冰冷的電轉(zhuǎn)槽中，接下來按照Bio-Rad電穿孔儀的說明操作。8)脈沖后往電擊槽中加入1ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，輕輕吹吸混勻；9)梯度涂布在山梨醇選擇培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)3-6天，直到平板上出現(xiàn)菌落。2、釀酒酵母W303-1A總DNA和質(zhì)粒的提取1)取培養(yǎng)30h的酵母菌液1-2ml，12000rpm,1min離心；2)用STE洗滌2次；3)用100μlTE緩沖液重懸，加入50μl玻璃珠(sigama公司)，加入100μl酚氯仿，劇烈震蕩1h,；4)4℃，12000rpm離心10min；5)取上清，加等體積氯仿，抽提蛋白和酚；6)重復(fù)步驟5直至液面分界處沒有蛋白殘留；7)取上清，加入兩倍體積冰無水乙醇，-20℃靜置20min,12000rpm離心10min；8)棄上清，70％乙醇洗滌一次，自然干燥；9)溶于50-100μlTE中，加入RNaseA(終濃度為20μg/ml),37℃反應(yīng)30min后保存于-20℃；10)PCR檢測，因為裂解效率低，質(zhì)粒含量不高，建議模板量為1～2μl/25μl反應(yīng)體系。3、過表達GmSLT基因?qū)湍耕}脅迫下生長能力影響實驗采用點滴試驗(Yeastdroptestassay)與生長曲線法檢測GmSLT基因?qū)湍耕}脅迫下生長能力的影響(可參考文獻--陳宏運，葉燕銳，朱怡，鄭穗平，林影，2008。酵母耐性評價方法的比較。食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(12):51-57)。點滴法為將相同濃度的野生型與轉(zhuǎn)化GmSLT的酵母點種于添加0,300mM，500mMNaCl的酵母基本培養(yǎng)基上，28度培養(yǎng)2-3天，觀察酵母生長情況，拍照記錄。生長曲線法為：將酵母接種至基本培養(yǎng)基，28℃過夜培養(yǎng)，調(diào)整OD600到0.5，以1ml培養(yǎng)基懸浮接入100ml新的豐富培養(yǎng)基液體YPD(含300mMNaCl)，使初始OD600為0.005，28℃,150rpm，培養(yǎng)3d，間隔6小時檢測一次OD值。由附圖2中可以看到，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度達到在300mM時，W303-1A以及轉(zhuǎn)化pRUL129空質(zhì)粒的W303-1A生長均減慢，但過表達GmSLT的W303-1A酵母在培養(yǎng)基中NaCl濃度達到在500mM時，仍能生長。從附圖3中可以看到，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度達到在300mM時，從30小時開始，過表達GmSLT的W303-1A酵母生長速度顯著高于W303-1A以及轉(zhuǎn)化pRUL129空質(zhì)粒的W303-1A。到第72h時，帶有GmSLT轉(zhuǎn)基因的酵母OD600已達到8.85，而帶有空質(zhì)粒的對照僅達到4.05，野生型W303-1A為3.02。上述實驗證明，過表達GmSLT基因，可顯著提高酵母對鹽脅迫適應(yīng)能力。證明GmSLT基因功能與耐鹽密切相關(guān)。4、GmSLT各結(jié)構(gòu)域與耐鹽功能相關(guān)性1)Over-LappingPCR：為驗證GmSLT各結(jié)構(gòu)域功能，采用Over-LappingPCR的方法，分別進行了ABS、TM、TM303、TH178以及ZBS結(jié)構(gòu)域的缺失，詳見圖1。根據(jù)此方法分別設(shè)計引物P2，P3以及共用引物P1，P4，分別進行2輪各20-cycle的PCR。所設(shè)計的引物序列是：GmSLTΔABS-P25‘-CTCATGCAA-CCAAGCACCCCAAATG-3‘(SEQIDNO.8)GmSLTΔABS-P35‘-GGGGTGCTTGG-TTGCATGAGAAATCTAAG-3‘(SEQIDNO.9)GmSLTΔTM-P25‘-GATTTCTCATG-TTGGTGCACTTCCTTCCAG-3‘(SEQIDNO.10)GmSLTΔTM-P35‘-GTGCACCAA-CATGAGAAATCTAAGACC-3‘(SEQIDNO.11)GmSLTM303-F5‘-GGATCCATTGATCTATCTCCTGT-3‘(SEQIDNO.12)GmSLTM303-R5‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.13)GmSLTH178F-F5‘-ACATGAACGGGCTCTCTCGCCAAGG-3‘(SEQIDNO.14)GmSLTH178F-R5‘-CCTTGGCGAGAGAGCCCGTTCATGT-3‘(SEQIDNO.15)GmSLTΔZBS-P25‘-TCTCGGCACT-CCCGTTCATGTAACTCCTC-3‘(SEQIDNO.16)GmSLTΔZBS-P35‘-CATGAACGGG-AGTGCCGAGAAGGGTTTTG-3‘(SEQIDNO.17)P15‘-GGATCC-ATGGGCGATACTTCTC-3‘(SEQIDNO.18)P45‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.19)2)構(gòu)建酵母轉(zhuǎn)化載體重組pRUL129經(jīng)測序驗證的帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的突變基因與帶有同樣酶切位點的酵母載體pRUL129相連，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母，在含1M山梨醇的選擇平板上28℃培養(yǎng)3天。挑取單菌落做PCR驗證，證明四種突變基因均已轉(zhuǎn)入了酵母。3)GmSLT結(jié)構(gòu)域與耐鹽功能試驗用點滴實驗(Yeastdroptestassay)的方法對多種轉(zhuǎn)化酵母進行耐鹽試驗。結(jié)果見圖4。從圖4中可以觀察到，當(dāng)培養(yǎng)基中的NaCl濃度達到300mM、500mM時，過表達完整GmSLT基因或缺失ZBS的酵母生長明顯比其他酵母。該實驗結(jié)果表明，在各結(jié)構(gòu)域中，ABS，TM等結(jié)構(gòu)域一旦缺失，GmSLT基因功能幾乎完全喪失，及這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕mSLT的耐鹽功能是必不可少的。相對而言，ZBS結(jié)構(gòu)缺失后，對GmSLT基因功能功能影響較小。實施例3、轉(zhuǎn)GmSLT水稻耐鹽試驗1、植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建以經(jīng)改造的雙元載體pCAMBIA1301(參考文獻陳宏運，葉燕銳，朱怡，鄭穗平，林影，2008。酵母耐性評價方法的比較。食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(12):51-57)作為植物表達載體(多克隆位點前增加有35S啟動子)，參見實施例2，將基因GmSLT利用BamHⅠ和SalⅠ兩個酶切位點從載體pMD-18TSimpleVector上雙酶切下來，回收純化，然后克隆到pCAMBIA1301的多克隆位點BamHⅠ和SalⅠ之間，稱為35S：：GmSLT。2、農(nóng)桿菌準(zhǔn)備1)將35S：：GmSLT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBR4404(參考文獻--何迎春，高必達,2002。含煙草幾丁質(zhì)酶基因的質(zhì)粒pBG1121的構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)化《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版》,2002,28(2):93-96)，然后進行菌落PCR鑒定驗證正確，并將陽性菌落加保護劑凍存于-70℃。2)轉(zhuǎn)化前從-70℃冰箱中取出保種的農(nóng)桿菌，接種于含相應(yīng)抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d。3)挑取農(nóng)桿菌單菌落接入3mL無菌YEP液體培養(yǎng)基中(含25mg/L利福平+25mg/L鏈霉素+50mg/L卡那霉素)，28℃、200rpm培養(yǎng)約20h。4)再將所得到的菌液接入200mL含同樣抗生素YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm再培養(yǎng)約20h，待農(nóng)桿菌的濃度達到OD600＝0.5左右。5)4℃、3000rpm離心15min，棄上清，用轉(zhuǎn)化液重新懸浮，待用。3、轉(zhuǎn)GmSLT基因水稻的獲得(參考文獻：張雪梅，袁濤，徐秀珍，王智杰，李春陽等，2000。植物表達質(zhì)粒pBin438-IFN-γ的構(gòu)建及向農(nóng)桿菌LBA4404的高效轉(zhuǎn)化?！端拇ù髮W(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》,2000(s1)；易自力，曹守云，王力，儲成才，李祥等，2001。提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究，遺傳學(xué)報,2001,28(4):352-358)。有多種方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻，本例以粳稻日本晴作為材料，通過成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，然后用含有GmSLT基因的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織，最后分化得到轉(zhuǎn)基因植株。具體步驟如下：1)誘導(dǎo)愈傷及繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：4mg/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：2.8g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝膠：3g/L(PH5.8)繼代培養(yǎng)基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝膠：3g/L(PH5.8)將水稻成熟種子，去殼后用次氯酸鈉溶液消毒，再用滅菌去離子水洗滌多次，之后放到無菌濾紙上吸干，將種子平放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃黑暗下培養(yǎng)一個月左右；當(dāng)胚性愈傷組織生長出來后，選擇球型愈傷組織，置于繼代培養(yǎng)基上，28℃黑暗下繼代培養(yǎng)1周左右。2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)，共培養(yǎng)基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；肌醇：0.1g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；葡萄糖：10g/L；植物凝膠：3g/L；滅菌后加AS:150μM(PH5.2)；參見實施例3將載體35S：：GmSLT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并檢驗得到陽性菌落。再將陽性農(nóng)桿菌用含抗生素的YEP平板活化培養(yǎng)28℃，2d，然后在平板上刮下菌，重新懸浮于含有適量AAM培養(yǎng)液中，在28℃，搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)2個小時，調(diào)整菌液OD600值約0.15。緊接著，將繼代后的愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，約25min。之后，用無菌濾紙吸干菌液，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有一張無菌濾紙的共培養(yǎng)基上，暗20℃共培養(yǎng)3d。3)選擇及分化培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；Phytagel：3g/L，滅菌后加頭孢霉素：500mg/L；加潮霉素50mg/L(PH5.8)預(yù)分化培養(yǎng)基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；NAA：1mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝膠：3g/L，滅菌后加頭孢霉素：250mg/L；ABA：5mg/L；6-BA：2.5mg/L；加潮霉素50mg/L；(PH5.8)分化培養(yǎng)基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；NAA：0.5mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；6-BA：4mg/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝膠：4.6g/L。(PH＝5.8)共培養(yǎng)后，將愈傷移到三角瓶中，加入無菌水洗滌愈傷組織3次，然后用添加了0.5g/L頭孢霉素的無菌水洗滌多次至澄清，倒掉后再加(含0.5g/L頭孢霉素)無菌水，放在搖床上搖2個小時，28℃，150轉(zhuǎn)，(若發(fā)現(xiàn)液體渾濁，應(yīng)再用0.5g/L頭孢霉素?zé)o菌水洗滌至澄清，)之后將愈傷移至無菌濾紙上，吸干多余水分，超凈臺吹1小時左右，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上(可挑選較大的愈傷組織分散在培養(yǎng)基上)，暗28℃培養(yǎng)兩周。再挑取從原愈傷組織上生長出來的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上，暗28℃預(yù)分化培養(yǎng)1周。然后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，28℃分化培養(yǎng)：先在黑暗下培養(yǎng)3d，然后在持續(xù)光照下，光周期16h晝/8h夜，培養(yǎng)兩周以上，這樣愈傷組織會分化出幼苗。將分化出的幼苗轉(zhuǎn)移到含MS培養(yǎng)基的三角瓶培養(yǎng)長大為植株(根系發(fā)達)，最后移栽到營養(yǎng)土培養(yǎng)。4)水稻陽性植株的鑒定a、轉(zhuǎn)GmSLT水稻To代幼苗普通PCR檢測利用SDS簡易提取法，剪去少量水稻葉片，液氮磨碎，提取DNA。然后以此為模板，用GmSLT檢測引物擴增，進行PCR擴增，并用原始親本水稻(WT)作對照，結(jié)果請參見附圖5。引物如下：GmSTL-d-F：5’-CTTCACATGAGGAACTGG-3’(SEQIDNO.20)GmSTL-d-R：5’-CTCAGTCTCATAGCCTTG-3’(SEQIDNO.21)從電泳圖(圖5)中可以看到，無論以轉(zhuǎn)化GmSTL的水稻苗基因組DNA還是cDNA為模板，均可擴增出與以含GmSTL基因的質(zhì)粒作為正對照進行PCR擴增完全相同的片段，證明轉(zhuǎn)基因苗中成功導(dǎo)入了GmSTL基因。5)轉(zhuǎn)GmSLT水稻To代部分株系基因表達量分析(RealtimePCR)a)幼苗總RNA提取使用北京康為世紀(jì)公司的植物RNA提取試劑盒，操作參考說明書。相關(guān)用品的處理：用0.1％的DEPC溶液浸泡藍色磨棒過夜，然后121℃滅菌30分鐘，倒去DEPC溶液，80℃烘干備用。并用DEPC水加無水乙醇配制75％乙醇。b)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。葉片中提取總RNA，RNA洗脫體積50μl，檢驗RNA純度和完整度后，進行反轉(zhuǎn)錄。再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照說明書合成cDNA。接著，利用制備的cDNA作為模板進行RT-PCR檢測，同上普通檢測所用的引物進行陽性植株檢測，并用原始親本水稻(WT)作對照。選用檢測為陽性的水稻植株制備cDNA模板，再根據(jù)有關(guān)原則，分別設(shè)計了ricetub和GmSLT的實時熒光定量PCR引物，如下：Ricetub-F：5’-GGCAAGATGAGCACCAAGGA-3’(SEQIDNO.22)Ricetub-R：5’-AAGCCACCGCAATACACCAC-3’(SEQIDNO.23)GmSLT-F5’-AGAATCACCACCCATCCA-3’(SEQIDNO.24)GmSLT-R5’-GTGCCAAGACCAACATCC-3’；(SEQIDNO.25)實時熒光定量pcr反應(yīng)體系(SYBRGreen染色法)，20μl體系，具體成分如下：輕輕混勻后短暫離心反應(yīng)條件：程序最后采用熔解曲線(meltingcurve)反應(yīng)，分析PCR產(chǎn)物的特異性。實時熒光定量PCR每個樣平行三次重復(fù)，以水稻看家基因tub作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT方法計算目標(biāo)基因相對表達量。從附圖6中可看到，野生型親本苗中未檢測到GmSLT的表達，而轉(zhuǎn)基因苗1、3、4號中均檢測到了GmSLT的表達，其中1號苗的表達量最高。4、轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽試驗材料：水稻日本晴野生型WT幼苗和轉(zhuǎn)GmSLT水稻To代1#株系幼苗；處理方法：分別澆灌NaCl濃度1M和1.50M的MS+NaCl溶液，每盆澆30ml一次，9d后統(tǒng)計水稻耐鹽情況。由下表及圖7中可以觀察到，采用1M的Nacl分別處理親本日本晴與轉(zhuǎn)GmSLT的1#小苗9天后，野生型日本晴已出現(xiàn)明顯的枯萎現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)GmSLT基因的小苗并未出現(xiàn)明顯的鹽害癥狀。當(dāng)采用1.5M的NaCl處理9天后，野生型日本晴已基本枯死，而轉(zhuǎn)GmSLT基因的小苗雖有葉片枯萎現(xiàn)象，但小苗仍存活。由此可以得出結(jié)論，過表達GmSLT基因可以顯著提高水稻的耐鹽特性。轉(zhuǎn)GmSLT基因的水稻苗鹽脅迫處理結(jié)果鹽濃度植株處理后植株表現(xiàn)1MWT水稻葉片枯萎較重1M轉(zhuǎn)GmSLT水稻葉片枯萎輕微1.5MWT水稻部分植株枯死，部分植株枯萎嚴(yán)重1.5M轉(zhuǎn)GmSLT水稻植株存活，葉片枯萎綜上所述，本發(fā)明通過生物信息學(xué)及基因時空表達分析，獲得了一種耐鹽基因，命名為GmSLT；將該基因轉(zhuǎn)化酵母、水稻等多種生物，均可顯著提高相關(guān)生物的耐鹽性能。本發(fā)明的基因能夠用于改良工業(yè)菌株,如:酵母,以及作物，如：水稻等，可顯著提高其耐鹽能力。具有降低酵母等工業(yè)生產(chǎn)菌株培養(yǎng)要求，減少生產(chǎn)成本，提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量以及擴展作物種植區(qū)域、提高產(chǎn)量等應(yīng)用前景與價值。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3