近代科學(xué)研究從鹿茸中檢測(cè)出40余種不同成份：其中有26種微量元素，含有30％以上無(wú)機(jī)物。有19種以上氨基酸，蛋白質(zhì)占鹿茸干重50％以上，并且含有豐富的磷脂、脂肪。特別是從鹿茸中提取獲得多肽等生物活性物質(zhì)，對(duì)鹿茸的價(jià)值從模糊感性認(rèn)識(shí)上升到理性認(rèn)知。鹿茸多肽能從生命源頭上作用于遺傳物質(zhì)，干涉生命的全過(guò)程，控制遺傳翻譯密碼、增加蛋白質(zhì)核酸合成，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)與再生，提高人體免疫力控制癌細(xì)胞。

二、

背景技術(shù)：

1.鹿茸組織學(xué)與鹿茸生長(zhǎng)點(diǎn)

鹿茸是鹿后天生長(zhǎng)的雄性器官。由神經(jīng)血管結(jié)締組織、皮膚軟骨等多種細(xì)胞構(gòu)成，受紫外線(xiàn)光信號(hào)控制，內(nèi)分泌系統(tǒng)支配生長(zhǎng)鹿茸(鹿角)，每年一次周期性脫落。雄鹿在出生次年春從頭蓋上部骨膜隆起，突出形成兩個(gè)柱狀幼角。分布在不同地域的馬鹿、梅花鹿等都依各地光照、溫差時(shí)間不同，按規(guī)律生長(zhǎng)不同形態(tài)鹿茸。它們內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本一致?？萍既藛T高云從事鹿病研究，走遍全國(guó)養(yǎng)鹿場(chǎng)，觀察過(guò)鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程、鹿茸形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及鹿病和生茸的關(guān)系。鹿茸生長(zhǎng)快速，每日能增加長(zhǎng)度2公分，構(gòu)成鹿茸的各類(lèi)細(xì)胞快速?gòu)?fù)制，細(xì)胞數(shù)增多是哺乳動(dòng)物中生長(zhǎng)最快的細(xì)胞，超過(guò)癌細(xì)胞。

當(dāng)鹿體內(nèi)生理?xiàng)l件成熟，頭頂干細(xì)胞開(kāi)始萌動(dòng)，以不超三個(gè)月時(shí)間，完成鹿茸生長(zhǎng)。之后茸體骨化，生理活性物質(zhì)消失，形成鹿角干叉，只能作為熬制鹿角膠材料。通過(guò)研究我們能在鹿茸活性物質(zhì)最多時(shí)期、含量最多部位、鹿茸干細(xì)胞分化生長(zhǎng)形成生長(zhǎng)點(diǎn)，在最佳部位採(cǎi)取培養(yǎng)原代細(xì)胞組織材料。通過(guò)發(fā)現(xiàn)鹿茸組織生理學(xué)特點(diǎn)，從鹿茸角尖最佳生長(zhǎng)點(diǎn)取材，作為培養(yǎng)鹿茸細(xì)胞的原始材料，是本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)之一。

2.鹿茸組織生理學(xué)。

鹿茸是鹿角骨化前期軟骨組織器官，茸體外部具有皮膚茸毛。茸體內(nèi)部以其組織結(jié)構(gòu)不同，分為上、中、下三段。上段是皮膚及密質(zhì)的皮下質(zhì)，下連球體狀生茸組織，富含鹿茸干細(xì)胞。與之連接的是由其分化形成的含活性物質(zhì)最多的鹿茸前體細(xì)胞層，組成鹿茸生產(chǎn)點(diǎn)，俗稱(chēng)“臘片部位”。鹿茸中段細(xì)胞分化長(zhǎng)成軟骨組織，下段開(kāi)始鈣化形成骨組織。當(dāng)梅花鹿形成4個(gè)分支，馬鹿形成5個(gè)分叉時(shí)停止生長(zhǎng)。鹿角由下向上石灰化形成堅(jiān)硬骨質(zhì)，脫皮成為格斗武器，進(jìn)入配種期次年春季自行脫落。

鹿角從生長(zhǎng)至脫落，是生物體由生長(zhǎng)到消亡、反之也是由消亡到生長(zhǎng)全過(guò)程的演釋。我們觀察發(fā)現(xiàn)，這種生命科學(xué)的奇妙現(xiàn)象是鹿茸活性多肽干涉控制的結(jié)果。

3.鹿茸活性物質(zhì)

鹿茸是活性物質(zhì)的天然生物存儲(chǔ)庫(kù)，角尖生長(zhǎng)點(diǎn)存在多肽同時(shí)存在多胺、多醣等。鹿茸多肽等特殊活性物質(zhì)其功能首先是作用其鹿茸自身，其突出特點(diǎn)是能夠使鹿茸干細(xì)胞快速分化成鹿茸的各類(lèi)型細(xì)胞， 鹿茸(鹿角)在后天分化周期性生長(zhǎng)脫落、脫落生長(zhǎng)，是生物界唯一特有的現(xiàn)象。這完全是由鹿茸多肽所具有的功能所致。現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)多肽是由A-氨基酸以肽鏈連接在一起的化合物，多肽是由10-100個(gè)氨基酸分子脫水縮合物組成。分子量低于10000Da，由2-10個(gè)氨基酸組成的可稱(chēng)為小分子肽，能透過(guò)半透膜。活性多肽有多種活性因子，控制人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)，提高各器官功能，復(fù)制再生人體細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)生命過(guò)程中，會(huì)由于許多原因造成人體多肽的損害和流失，以及合成肽的能力降低，而相應(yīng)發(fā)生各類(lèi)疾病。研究者發(fā)現(xiàn)人的不同年齡段分泌產(chǎn)生肽的能力不同。25歲之前為充足分泌期，分泌均衡。30-50歲進(jìn)入分泌失衡期，不足者將發(fā)病。50歲以上人群進(jìn)入分泌匱乏期，活性肽嚴(yán)重不足，開(kāi)始衰老和發(fā)生相應(yīng)疾病。60歲以上分泌終止，器官功能衰竭和細(xì)胞功能退化至喪失，需要及時(shí)補(bǔ)充多肽。鑒于多肽的價(jià)值和重大需求，當(dāng)代許多學(xué)者尋求高效多肽和大量分離提取多肽已形成研究熱點(diǎn)。

首先從大豆、芝麻等植物中提取到小分子肽，同時(shí)認(rèn)識(shí)到可從動(dòng)物臟器中提取多肽(如胸腺肽)，但因瘋牛病等耐高溫病毒存在感染風(fēng)險(xiǎn)而禁用。人工合成的多肽往往沒(méi)有活性，沒(méi)有活性的多肽就沒(méi)有多肽的功能。

4.提取鹿茸多肽

近些年人們十分關(guān)注以鹿茸為原料提取鹿茸多肽。1970年前后展開(kāi)大量試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以多種方法從鹿茸中提取到不同分子量的肽，證實(shí)了鹿茸多肽的強(qiáng)大功能。同時(shí)，也證實(shí)了以鹿茸為原料提取多肽產(chǎn)率低、成本高，做不到規(guī)?；a(chǎn)。我們證實(shí)其是因?yàn)槁谷滋崛《?肽的有效部位十分短小。另外，基因重組鹿茸多肽產(chǎn)率也僅有66mg/L。

5.鹿茸生產(chǎn)和藥用。

我國(guó)漢代之前發(fā)現(xiàn)鹿茸保健醫(yī)療功效。由于野生動(dòng)物生存環(huán)境遭到破壞，逐漸形成由野生變家養(yǎng)。1949年10月新中國(guó)成立后，形成了鹿的養(yǎng)殖業(yè)，向國(guó)外出口鹿茸，換取外匯。當(dāng)時(shí)東北三省、華北、西北青海、新疆等全國(guó)養(yǎng)殖梅花鹿。馬鹿近百萬(wàn)只。高云研治鹿病走遍全國(guó)各地，到處可見(jiàn)養(yǎng)鹿破壞山林，外銷(xiāo)鹿茸換取外匯，以破壞生態(tài)環(huán)境為代價(jià)得不償失。隨之構(gòu)想以生物技術(shù)培養(yǎng)鹿茸細(xì)胞，創(chuàng)建生產(chǎn)鹿茸物質(zhì)新途徑。

6.鹿茸生長(zhǎng)機(jī)制

高云建立了我國(guó)第一個(gè)野生動(dòng)物疾病研究室。行使職務(wù)深入全國(guó)鹿場(chǎng)，研究鹿的生理病理，探討生茸機(jī)制。觀察發(fā)現(xiàn)鹿睪丸損傷切除后，使性激素分泌功能受阻，鹿茸進(jìn)入病態(tài)生長(zhǎng)，茸體細(xì)小，最終停止生長(zhǎng)形成中性體態(tài)。在研究“鉤端螺旋體病”病源分布組織切片時(shí)，從鹿茸中觀察到根部至中部由軟骨組織構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)角尖皮下部軟組織緊密連接一個(gè)球狀微有彈性的軟組織，這個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)可稱(chēng)“角帽”是鹿茸生長(zhǎng)的起點(diǎn)。向下是生長(zhǎng)有序的鹿茸前體細(xì)胞層。鹿茸組織切片染色在根部檢查有鈣質(zhì)沉著。中部呈軟骨組織結(jié)構(gòu)，上部呈現(xiàn)特殊組織結(jié)構(gòu)，找到和確定了生茸組織的確切位置，這一發(fā)現(xiàn)確定了採(cǎi)取原始材料最佳部位，為建立細(xì)胞系(株)和種子細(xì)胞庫(kù)，為高效提取鹿茸多肽打下技術(shù)基礎(chǔ)。

7.鹿茸生長(zhǎng)點(diǎn)。

鹿茸有三處生長(zhǎng)點(diǎn)。鹿茸角尖部可以定位為第一生長(zhǎng)點(diǎn)，是重要 取材部位，它是原始生長(zhǎng)點(diǎn)形成的后天產(chǎn)物。其起點(diǎn)源于胚胎時(shí)期形成的頭頂骨膜儲(chǔ)備的鹿茸干細(xì)胞。光照作用于腦垂體后葉，睪丸雄性激素增加，骨膜中干細(xì)胞萌發(fā)生長(zhǎng)鹿茸。鹿茸第二生長(zhǎng)點(diǎn)是切除鹿茸之后及鹿茸生理脫落點(diǎn)，原處骨膜能再生鹿茸。第三生長(zhǎng)點(diǎn)是鹿茸茸表骨膜中存在的干細(xì)胞，當(dāng)茸體受到外力損傷時(shí)，可無(wú)序生長(zhǎng)鹿茸分支形成“怪角”。

我們確定從鹿茸主干、支干以及無(wú)序生長(zhǎng)的“怪角”生長(zhǎng)點(diǎn)取材均可培養(yǎng)成為原代單層細(xì)胞，其它部位取材尚不能成功培養(yǎng)。這是本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)之一。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

將原代細(xì)胞培養(yǎng)成為傳代細(xì)胞系才能進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。在生長(zhǎng)液中加入10-20％鹿血清，提高細(xì)胞活力適應(yīng)外部環(huán)境有序生長(zhǎng)，成為傳代細(xì)胞系(株)。此項(xiàng)創(chuàng)新對(duì)培養(yǎng)各種細(xì)胞系攻克傳代難點(diǎn)，提供技術(shù)支持。

選高產(chǎn)梅花鹿茸在生長(zhǎng)鼎盛期鋸下，必需在30分鐘內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室。滅菌紗布包好，以電烙燙烙表皮，無(wú)菌消毒，距角尖3公分切開(kāi)于角帽組織下端取材置入短頸瓶，剪碎加生長(zhǎng)液培養(yǎng)，置入培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)，使組織塊均勻分布，減少觀察次數(shù)不可搖動(dòng)，輕置輕放。一周之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

生長(zhǎng)液配方：改良MEM液、鹿血清20％、PH調(diào)至7.2。

鹿血清採(cǎi)取法：在6-7月采血，快速分離血清，促細(xì)胞生長(zhǎng)作用效果最佳，優(yōu)于常用的小牛血清、胎牛血清。發(fā)現(xiàn)鹿血清應(yīng)用價(jià)值是本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)之一。

使用鹿血清強(qiáng)力生長(zhǎng)液和良好操作連續(xù)傳代至50代形成細(xì)胞系(株)，將每代細(xì)胞凍存。

從不同的種群中優(yōu)選個(gè)體取材，建立10個(gè)以上細(xì)胞系(株)，豐富和增加種細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)量，這是本發(fā)明技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)之一。

根據(jù)達(dá)到產(chǎn)量和成本要求，可選用轉(zhuǎn)瓶以旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)技術(shù)或選擇細(xì)胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)均可規(guī)模化工業(yè)化生產(chǎn)鹿茸細(xì)胞。

四、具體實(shí)施方式

1.轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

首先建立2000平方米、5人操作生物藥品生產(chǎn)車(chē)間。要求滅菌消毒、空氣濾過(guò)、溫度濕度自動(dòng)控制。配置3立升轉(zhuǎn)瓶、5×7轉(zhuǎn)瓶機(jī)100臺(tái)。設(shè)立連續(xù)順向生產(chǎn)的工藝步驟：生產(chǎn)準(zhǔn)備室-器械洗滌消毒室-消化傳代試驗(yàn)室-恒溫培養(yǎng)室-收藏儲(chǔ)備室-品質(zhì)檢測(cè)包裝室。年產(chǎn)量：約700公斤以上鹿茸細(xì)胞活性多肽干粉。

2.細(xì)胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)

建立1000平方米、五人操作生物藥品生產(chǎn)車(chē)間，要求滅菌消毒、空氣濾過(guò)、溫度濕度自動(dòng)控制。配置40立升細(xì)胞反應(yīng)罐10臺(tái)。設(shè)立連續(xù)順向生產(chǎn)的工藝步驟：生產(chǎn)準(zhǔn)備室——器械洗滌消毒室——復(fù)蘇試驗(yàn)室——恒溫培養(yǎng)室-收藏儲(chǔ)備室——品質(zhì)檢測(cè)包裝室。年產(chǎn)量：約2000公斤以上鹿茸細(xì)胞活性多肽干粉。

以此規(guī)范作為一個(gè)生產(chǎn)單位。早期創(chuàng)造的鹿茸原始單層細(xì)胞培養(yǎng)成功，獲得國(guó)家專(zhuān)利第2523號(hào)。細(xì)胞反應(yīng)罐培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成功獲得了國(guó)家專(zhuān)利第CN200710064481.2號(hào)。在兩項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利的技術(shù)基礎(chǔ)上，在不斷完善和提高過(guò)程中，創(chuàng)立了生物技術(shù)工業(yè)化生 產(chǎn)鹿茸細(xì)胞多肽新工藝。

3.鹿茸細(xì)胞多肽提取方法

首先將鹿茸細(xì)胞懸浮液稱(chēng)量置入離心罐，1500RPM離心10分鐘，置入低溫冰箱快速凍融。裂解細(xì)胞壁釋放活性物質(zhì)。加入稀釋液(1∶1)，以半透膜方法提取多肽。將提取物用真空凍干機(jī)凍干成粉狀，簡(jiǎn)稱(chēng)“三步提取法”，稱(chēng)量分裝，保存于-80℃低溫冰箱。鹿茸細(xì)胞多肽產(chǎn)率占鹿茸細(xì)胞總量達(dá)48.5％以上。

4.鹿茸多肽分子質(zhì)量測(cè)定

采用SDS-PAGE電泳法。

常規(guī)方法(略)

鹿茸細(xì)胞系(株)不同，鹿茸多肽分子量為：3.2-7.6kDa。

5.鹿茸細(xì)胞藥理藥化測(cè)定與鑒定

以生物技術(shù)培養(yǎng)的鹿茸細(xì)胞與鹿茸藥理藥化對(duì)比實(shí)驗(yàn)，是由著名學(xué)者王本祥博士等立題研究完成的。證實(shí)兩者藥理作用相同，藥化成分含量相同或相似，受到政府主管部門(mén)和專(zhuān)家學(xué)者重視，由農(nóng)業(yè)部科技司主持技術(shù)鑒定。經(jīng)國(guó)家藥理學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)王振鋼教授、衛(wèi)生部藥物研究所所長(zhǎng)張均田教授等六位著名藥理專(zhuān)家評(píng)審?fù)ㄟ^(guò)鑒定，鹿茸細(xì)胞作為保健品可用于食品飲料、酒類(lèi)等，并建議鹿茸細(xì)胞參照鹿茸入藥，可申請(qǐng)國(guó)家新藥。

實(shí)驗(yàn)例一：取材

從健康高產(chǎn)的種鹿群中優(yōu)選4-7歲長(zhǎng)白山梅花鹿(或馬鹿)在鹿茸生長(zhǎng)到梅花鹿二杠(或馬鹿三叉)時(shí)鋸茸，立即(30分鐘之內(nèi))送入實(shí)驗(yàn)室。滅菌在鹿茸角尖下3-5公分處切開(kāi)，角帽取材5-10克， 剪碎加生長(zhǎng)液，篩除較大組織塊，分瓶培養(yǎng)(每瓶10毫升)，搖勻置入二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃靜止培養(yǎng)三日，開(kāi)始鏡檢觀察。7-10日后換液，待組織塊生長(zhǎng)細(xì)胞達(dá)要求時(shí)，進(jìn)行胰酶消化，分瓶培養(yǎng)，獲得原代細(xì)胞。

實(shí)施例二：生長(zhǎng)液配方：常規(guī)改良MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10-20％鹿血清。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)和形成細(xì)胞系(株)是生物技術(shù)生產(chǎn)鹿茸細(xì)胞的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。當(dāng)傳代數(shù)次時(shí)，往往停止生長(zhǎng)不能延續(xù)培養(yǎng)而終止。使用胎牛血清促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，難以度過(guò)難點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)鹿血清的應(yīng)用價(jià)值，這是本項(xiàng)發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)之一。鹿血占體重16分之一，可分離出3立升血清，最好從頸動(dòng)脈插管放血。保證無(wú)菌狀態(tài)冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例三：創(chuàng)建鹿茸細(xì)胞系(株)和建立細(xì)胞庫(kù)。將傳代鹿茸細(xì)胞保存活力，性能不變達(dá)到50代以上創(chuàng)建細(xì)胞系(株)。從5代起均可為細(xì)胞生產(chǎn)提供種細(xì)胞，提取多肽。

由于鹿種不同、部位個(gè)體不同形成的鹿茸細(xì)胞系(株)有所差異，可從中選用。必須大量和多樣化保留鹿茸細(xì)胞系(株)，建立細(xì)胞庫(kù)，加以科學(xué)管理，科學(xué)利用自然資源。

實(shí)施例四：大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)技術(shù)

將鹿茸細(xì)胞利用轉(zhuǎn)瓶施轉(zhuǎn)培養(yǎng)或細(xì)胞反應(yīng)罐懸浮培養(yǎng)，首次作為工業(yè)化生產(chǎn)鹿茸細(xì)胞，獲得100-600萬(wàn)個(gè)/ml。

實(shí)施例五：提取鹿茸細(xì)胞多肽

將鹿茸細(xì)胞懸液1500RPM，10分鐘離心沉淀，超低溫冷凍破碎細(xì)胞壁，釋放多肽等活性物質(zhì)。利用半透膜方法分離多肽，將所得置于 真空凍干機(jī)，制成多肽干粉，稱(chēng)重分裝，保存在-20℃。多肽提取量占細(xì)胞總量48.5％，此法簡(jiǎn)稱(chēng)為“三步提取法”，提取效果好，保存多肽活性無(wú)藥物殘留，成本低。

實(shí)施例六、分子質(zhì)量測(cè)定

采用SDS-PAGE電泳法測(cè)定。常規(guī)方法(略)。鹿茸細(xì)胞系(株)不同，鹿茸多肽分子量在3.2-7.6kDa。

實(shí)施例七：鹿茸細(xì)胞功能。王本祥博士檢測(cè)鹿茸細(xì)胞藥理藥化作用實(shí)驗(yàn)，明顯觀察到，小白鼠經(jīng)口服鹿茸細(xì)胞使肝臟核酸增多，肝細(xì)胞數(shù)量增多。系統(tǒng)研究報(bào)告發(fā)表于王本祥博士著作中。

五、附農(nóng)業(yè)部科技司科技成果鑒定書(shū) 。