本發(fā)明涉及一株能夠降解甲基叔丁基醚的新菌株——Piscinibacter sp.MQ-18及其應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

甲基叔丁基醚(MTBE)作為一種很重要的石油化工產(chǎn)品，在20世紀(jì)80年代初成為一種汽油添加劑被廣泛使用。高水溶的性質(zhì)使它在地下儲(chǔ)油罐泄漏之后便會(huì)很快的滲透到地下水中，并向四周擴(kuò)散。同時(shí)因?yàn)镸TBE和其他化合物具有共溶的性質(zhì)，會(huì)使汽油里面的其它化合物在水中的溶解度提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，造成嚴(yán)重的化學(xué)污染。這樣的情況下，MTBE在汽油中的使用雖然會(huì)減少了空氣中污染物的排放，但是會(huì)對(duì)土壤和地下水產(chǎn)生巨大的危害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，直接注射MTBE會(huì)產(chǎn)生癌癥的癥狀。雖然還沒發(fā)現(xiàn)明確的MTBE會(huì)對(duì)人類產(chǎn)生癌癥癥狀的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但是美國的國家環(huán)保局(USEPA)已經(jīng)在評(píng)估它潛在的危害，而且要將其列入可能致癌物和環(huán)境優(yōu)先污染物的名單當(dāng)中。

目前，針對(duì)該污染物的處理方法有物理吸附法、曝氣吹除法、超聲波法、強(qiáng)化雙氧水法和輻射分解法等，但多用于MTBE廢水的處理。近年來，生物法被證明在醚類化合物的凈化中具有良好的應(yīng)用前景。生物凈化技術(shù)是利用微生物代謝活動(dòng)，將污染物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞代謝的能源、細(xì)胞組成物質(zhì)及無害化的小分子物質(zhì)(如H₂O、CO₂等)，相較于其它方法具有高效、低耗，反應(yīng)條件溫和、二次污染小等優(yōu)點(diǎn)。

利用生物技術(shù)降解MTBE的關(guān)鍵之一便是獲得MTBE高效降解菌。目前，國外學(xué)者已在這方面做了大量研究，國內(nèi)對(duì)該方面的研究尚處于發(fā)展階段。由于MTBE的碳鏈較短，抑制了微生物對(duì)碳的利用，使其生物降解速率較一般有機(jī)物緩慢，目前已分離得到的MTBE降解菌細(xì)胞得率都比較低，此外，已分離得到的菌株降解效率也有待提高。劉涉江等用混合微生物降解MTBE，發(fā)現(xiàn)以MTBE為碳源的微生物生長極其緩慢，使得MTBE降解性能較差，且不能礦化為二氧化碳(劉涉江等.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,26(2):563-567.)；張杏青等發(fā)現(xiàn)的菌株Comamonas testosterone A1能夠耐受50mg/L的MTBE，但需要經(jīng)過7d才能降解完全(張杏青等.環(huán)境科學(xué),2009,30(6):1785-1790.)；Hatizinger等發(fā)現(xiàn)的菌株Hydrogenophaga flava ENV735能以MTBE為唯一的碳源和能源緩慢生長，對(duì)MTBE的降解速率為46nmol/(min·mg_protein)，但是加入少量酵母浸出液可極大促進(jìn)其生長并加速對(duì)MTBE的降解(Hatizinger等.Appiled and Environmental Microbiology,2001,67(12):5601-5607)；Hanson等發(fā)現(xiàn)的菌株Methylibium petroleiphilum PM1在MTBE初始濃度分別為5、50、500mg/L時(shí)，PM1的降解速率與濃度成線性關(guān)系，分別為0.07、1.17和3.56mg·L^-1·h^-1(Hanson等.Appiled and Environmental Microbiology,1999,65(11):4788-4796)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有MTBE生物降解效率低、微生物世代時(shí)間長的不足，提供了一株能高效降解MTBE的菌株及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株可降解MTBE高效降解菌——水庫桿菌(Piscinibacter sp.)MQ-18，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2016年6月13日，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2016327，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。

本發(fā)明所提供的MTBE降解菌CCTCC NO：M 2016327來源于浙江某制藥廠污水處理池的活性污泥，經(jīng)人工馴化、富集、分離所得到。所述Piscinibacter sp.MQ-18的菌落特征如下：透射電鏡觀察，菌體呈桿狀，大小(0.5–0.75)μm×(1.9–2.7)μm，有鞭毛，無芽孢；在固體R₂A培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淡黃色，凸起，邊緣平整，形態(tài)飽滿，光滑濕潤，菌苔沿劃線生長。硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，吲哚試驗(yàn)為陰性、不能同化檸檬酸、癸酸、己二酸、蘋果酸、苯乙酸、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸鹽，但能利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖和甘露醇，同時(shí)能夠水解明膠、七葉靈，含有酯酶(C4)，不含脲酶、革蘭氏染色為陰性。

本發(fā)明涉及所述的Piscinibacter sp.MQ-18在微生物降解甲基叔丁基醚(MTBE)中的應(yīng)用。具體的，所述的應(yīng)用為：將Piscinibacter sp.MQ-18接種至含MTBE的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度25～37℃，pH 4.0～10.0的條件下(優(yōu)選25～30℃，pH 6.0～7.0)進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MTBE的降解。

進(jìn)一步，所述MTBE在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中初始濃度為15～300mg/L；所述Piscinibacter sp.MQ-18以種子培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體經(jīng)無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋獲得的菌懸液形式加入，所述菌懸液中濕菌體蛋白濃度為5-170mg/L，菌懸液體積接種量為1-5％；優(yōu)選濕菌體蛋白濃度為170mg/L，菌懸液體積接種量優(yōu)選為4％。

進(jìn)一步，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為：CaCl₂·2H₂O，0.03g/L；MgSO₄·H₂O，0.46g/L；(NH₄)₂SO₄，1.23g/L；KH₂PO₄，0.7g/L；K₂HPO₄，0.85g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O，0.001；微量元素母液1mL/L；溶劑為水，pH 7.0～7.5。所述的微量元素母液組成為：FeSO₄·7H₂O，1.0g/L；CuSO₄·5H₂O，0.02g/L；H₃BO₃，0.014g/L；MnSO₄·4H₂O，0.10g/L；ZnSO₄·7H₂O，0.10g/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g/L；CoCl₂·6H₂O，0.02g/L；溶劑為水。

進(jìn)一步，當(dāng)菌液用量較小時(shí)，所述的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液可通過斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和菌懸液制備三個(gè)步驟獲得；當(dāng)用量較大時(shí)，可通過斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵液培養(yǎng)和菌懸液制備四個(gè)步驟獲得，具體過程如下：

(1)斜面培養(yǎng)：將Piscinibacter sp.MQ-18接種于R₂A固體培養(yǎng)基，28～32℃培養(yǎng)72h，獲得斜面菌體；所述R₂A固體培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.50g/L，胰蛋白胨0.50g/L，干酪素0.50g/L，葡萄糖0.50g/L，可溶性淀粉0.50g/L，丙酮酸鈉0.30g/L，KH₂PO₄0.45g/L，MgSO₄0.05g/L，瓊脂15～18g/L，溶劑為水，pH 7.2。

(2)種子培養(yǎng)：從步驟(1)斜面上挑取一接種環(huán)菌落接種至種子培養(yǎng)基中，28～32℃培養(yǎng)56～72h，獲得種子液。所述的種子培養(yǎng)基為R₂A液體培養(yǎng)基，除無瓊脂外，其余組分與R₂A固體培養(yǎng)基相同。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)獲得的種子液以體積濃度5～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28～32℃，pH 6.0～8.0條件下培養(yǎng)56～72h，獲得發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.5g/L，CaCl₂ 0.023g/L，MgSO₄ 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，Na₂HPO₄ 4.5g/L，微量元素母液，1mL/L，溶劑為水，pH 7.0～7.5，微量元素母液組成同無機(jī)鹽培養(yǎng)基中微量元素母液。

(4)菌懸液制備：將種子液(或發(fā)酵液)在8000rpm離心10min，棄上清液，用已滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗菌體，然后在8000rpm離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌3次。將獲得的濕菌體用無菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸浮，獲得所需濃度的菌懸液。

本發(fā)明還提供一種Piscinibacter sp.MQ-18在微生物降解甲基叔丁基醚中的應(yīng)用，所述應(yīng)用是利用Piscinibacter sp.MQ-18通過生物滴濾塔降解甲基叔丁基醚廢氣，具體，所述應(yīng)用是以Piscinibacter sp.MQ-18經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體經(jīng)無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋獲得的菌懸液為營養(yǎng)液；所述營養(yǎng)液濕菌體含量為200mg/L，營養(yǎng)液的噴淋量為180ml/min，廢氣停留時(shí)間30～120s，MTBE濃度10～300mg/m³，去除率達(dá)70％～95％。優(yōu)選所述廢氣停留時(shí)間60s，甲基叔丁基醚濃度100mg/m³。

所述生物滴濾塔由設(shè)有廢氣進(jìn)口的塔底、設(shè)有生物填料層、取樣口和水浴保溫夾套的塔身、安裝有尾氣出口、氣體采樣口和營養(yǎng)液噴淋系統(tǒng)的塔頂、空氣泵、吹脫瓶、混合瓶組成，所述的塔身由兩個(gè)生物處理單元至下而上疊置安裝組成，相鄰層的生物處理單元之間布置水流通道以及供相鄰層氣連通的通氣口；所述的營養(yǎng)液噴淋系統(tǒng)由安裝在塔頂?shù)膰姙⑵?，設(shè)在生物滴塔外部的循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶、營養(yǎng)液輸入管、pH控制儀、蠕動(dòng)泵、堿液瓶連接組成；所述的pH控制儀分別與循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶和堿液瓶連接，pH控制儀還設(shè)有與循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶接通的pH計(jì)探頭；所述循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶通過蠕動(dòng)泵與噴灑器連通；所述空氣泵通過質(zhì)量流量計(jì)和轉(zhuǎn)子流量計(jì)分別與吹拖瓶和混合瓶連通，混合瓶中混勻廢氣通過轉(zhuǎn)子流量計(jì)與塔底廢氣進(jìn)口連通；所述生物填料層填料為拉西環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：在25～30℃，pH 6.0～7.0條件下，Piscinibacter sp.MQ-18在46h內(nèi)可將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中30mg/L的MTBE完全降解，對(duì)MTBE的最高降解濃度可達(dá)300mg/L。劉涉江等用混合微生物降解MTBE,發(fā)現(xiàn)以MTBE為碳源的微生物生長及其緩慢，使得MTBE降解性能較差，且不能礦化為二氧化碳(劉涉江等.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,26(2):563-567.)；張杏青等發(fā)現(xiàn)的菌株Comamonas testosterone A1能夠耐受50mg/L的MTBE,但需要經(jīng)過7d才能降解完全(張杏青等.環(huán)境科學(xué),2009,30(6):1785-1790.)；Hatizinger等發(fā)現(xiàn)的菌株Hydrogenophaga flava ENV735能以MTBE為唯一的碳源和能源緩慢生長，對(duì)MTBE的降解速率為46nmol/(min·mg_protein)，但是加入少量酵母浸出液可極大促進(jìn)其生長并加速降解(Hatizinger等.Appiled and Environmental Microbiology,2001,67(12):5601-5607)；Hanson等發(fā)現(xiàn)的菌株Methylibium petroleiphilum PM1在MTBE初始濃度分別為5、50、500mg/L時(shí)，PM1的降解速率與濃度成線性關(guān)系，分別為0.07、1.17和3.56mg·L^-1·h^-1(Hanson等.Appiled and Environmental Microbiology,1999,65(11):4788-4796)。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解速率為26nmol/(min·mg_protein)，具有降解速度快、耐受濃度大、擴(kuò)大培養(yǎng)后延滯期短、性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，將在MTBE污染的治理實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。

相關(guān)文獻(xiàn)有用Methylibium petroleiphilum PM1降解MTBE的報(bào)道，但本發(fā)明的菌株MQ-18顯然與Methylibium petroleiphilum PM1屬于不同種的細(xì)菌。生理生化分析顯示，菌株P(guān)M1能水解尿素，不能水解明膠、七葉靈、β-半乳糖甙、葡萄糖和阿拉伯糖，而菌株MQ-18則不能水解尿素，但是能夠水解明膠、七葉靈和葡萄糖，對(duì)阿拉伯糖也有微弱的水解作用，并含有β-半乳糖甙酶。在培養(yǎng)過程中無論是在R2A培養(yǎng)基還是在MM培養(yǎng)基，菌株MQ在液體中的形態(tài)都是呈顆粒狀的，而PM1能夠形成均一液體；且兩者的16s rDNA同源性只有96.75％，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌株之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，所以可以確定為不同種的菌株。

(四)附圖說明

圖1為Piscinibacter sp.MQ-18透射電鏡照片；

圖2為Piscinibacter sp.MQ-18的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；

圖3為溫度對(duì)MTBE降解的影響；

圖4為pH對(duì)MTBE降解的影響；

圖5為不同Piscinibacter sp.MQ-18菌體初始濃度對(duì)MTBE降解的影響；

圖6為不同MTBE初始濃度下Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE降解的影響；

圖7為不同MTBE初始濃度下，Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解速率的影響；

圖8為生物滴濾塔工藝流程圖，1.空氣泵，2.轉(zhuǎn)子流量計(jì)，3.質(zhì)量流量，4.吹脫瓶，5.混合瓶，6.循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶，7.堿液瓶，8.pH控制儀，9.蠕動(dòng)泵，10.填料取樣口，11水浴保溫夾套，12.氣體采樣口，13.尾氣排放口；

圖9為生物滴濾塔處理模擬MTBE廢氣的進(jìn)出口濃度及去除效率；

表1為菌株MQ-18與Methylibium petroleiphilum PM1、Piscinibacter aquaticus的生理生化性能差異對(duì)比。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例中所用無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為：CaCl₂·2H₂O 0.03g/L，MgSO₄·H₂O 0.46g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.23g/L，KH₂PO₄ 0.7g/L，K₂HPO₄ 0.85g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.001；微量元素母液1mL/L，溶劑為水，pH 7.0～7.5。所述的微量元素母液組成為：FeSO₄·7H₂O 1.0g/L，CuSO₄·5H₂O 0.02g/L，H₃BO₃ 0.014g/L，MnSO₄·4H₂O 0.10g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.02g/L，溶劑為水。

所用R₂A固體培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.50g/L，胰蛋白胨0.50g/L，干酪素0.50g/L，葡萄糖0.50g/L，可溶性淀粉0.50g/L，丙酮酸鈉0.30g/L，KH₂PO₄ 0.45g/L，MgSO₄ 0.05g/L，瓊脂15～18g/L，溶劑為水，pH 7.2。

所用R₂A液體培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.50g/L，胰蛋白胨0.50g/L，干酪素0.50g/L，葡萄糖0.50g/L，可溶性淀粉0.50g/L，丙酮酸鈉0.30g/L，KH₂PO₄ 0.45g/L，MgSO₄ 0.05g/L，溶劑為水，pH 7.2。

所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.5g/L，CaCl₂·2H₂O 0.03g/L，MgSO₄·H₂O 0.46g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.23g/L，KH₂PO₄ 0.7g/L，K₂HPO₄ 0.85g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.001，微量元素母液1mL/L，溶劑為水，pH 7.0～7.5。

實(shí)施例1：Piscinibacter sp.MQ-18的分離、純化及其鑒定

(1)Piscinibacter sp.MQ-18的分離及純化

現(xiàn)場(chǎng)采集浙江某制藥廠污水處理池的活性污泥，以MTBE為唯一碳源和能源，進(jìn)行馴化、富集。數(shù)月后，經(jīng)富集后的活性污泥，接種到含50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的300mL密封螺旋瓶中，以MTBE作為唯一碳源和能源，繼續(xù)培養(yǎng)、富集。

搖瓶中的混合菌液經(jīng)過5次傳代富集后，在R₂A固體培養(yǎng)基上稀釋涂布，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5天，依據(jù)菌體群落的差異性，挑取平板上長出的單菌落進(jìn)行劃線分離，得到8株純菌落。將篩選到的8株菌接種至以MTBE為唯一碳源和能源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，考察各菌株對(duì)MTBE的處理效果，最終獲得一株具有MTBE降解活性的菌株MQ-18。

(2)Piscinibacter sp.MQ-18的鑒定

菌株MQ-18細(xì)胞呈短桿狀，大小為(0.5–0.75)μm×(1.9–2.7)μm，有鞭毛，無芽孢；在固體R2A培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淡黃色，凸起，邊緣平整，形態(tài)飽滿，光滑濕潤，菌苔沿劃線生長，電鏡照片見圖1。

菌株MQ-18的生理生化特征為：硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，吲哚試驗(yàn)為陰性、不能同化檸檬酸、癸酸、己二酸、蘋果酸、苯乙酸、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸鹽，但能利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖和甘露醇，同時(shí)能夠水解明膠、七葉靈、含有酯酶(C4)、蛋白酶、革蘭氏染色為陰性。

斜面菌種委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及測(cè)序，獲得16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

ACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACGCGGGGCAACCTGGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCATCGGAACGTGCCCAGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCGGGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTATTGGAGCGGCCGATGTCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTCGGGGAAGAAACGGTCTGCGCTAATACCGCGGGCTAATGACGGTACCCGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGCTTTGCAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGCATCGCTAGAGTGCGGCAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGGCCTGCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGACGGCTTGCTGTTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCTGGAATCCTGCAGAGATGTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCAGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCATTAGTTGCTACGCAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGGTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCTCAGAAAACCGGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGG

據(jù)此建立系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，推測(cè)菌株MQ-18可能是Piscinibacter aquaticus。通過API 20NE、API ZYM指標(biāo)，結(jié)合菌株MQ-18的生理生化特征，發(fā)現(xiàn)其與Piscinibacter aquaticus存在一定差異，如表1所示，確定該菌株MQ-18為水庫桿菌(Piscinibacter sp.)，記為水庫桿菌(Piscinibacter sp.)MQ-18。

表1

實(shí)施例2：Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液的制備

當(dāng)菌液用量較小時(shí)，所述的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液可通過斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和菌懸液制備三個(gè)步驟獲得；當(dāng)用量較大時(shí)，可通過斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵液培養(yǎng)和菌懸液制備四個(gè)步驟獲得，具體過程如下：

(1)斜面培養(yǎng)：將Piscinibacter sp.MQ-18接種于R₂A固體培養(yǎng)基，28～32℃培養(yǎng)72h，獲得斜面菌體；

(2)種子培養(yǎng)：從步驟(1)斜面上挑取一接種環(huán)菌落接種至種子培養(yǎng)基中，28～32℃培養(yǎng)72h，獲得種子液；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)獲得的種子液以體積濃度5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28～32℃，pH 6.0～7.0條件下培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；

(4)菌懸液制備：將種子液(或發(fā)酵液)在8000rpm離心10min，棄上清液，用已滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗菌體，然后8000rpm離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌3次，將獲得的濕菌體用無菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋獲得所需濃度的菌懸液。

實(shí)施例3：Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE生物降解性能檢測(cè)

(1)溫度對(duì)Piscinibacter sp.MQ-18降解MTBE的影響

在不同溫度下實(shí)施Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在25～30℃具有較高的降解MTBE的能力，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：

在300mL的搖瓶中加入50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH值6.7，110℃滅菌40分鐘后，加入MTBE作唯一碳源，使MTBE的初始濃度為30mg/L，再加入2mL實(shí)施例2方法經(jīng)斜面和種子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液(濕菌體蛋白濃度為170mg/L)。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)溫度設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣和一個(gè)空白對(duì)照(不加MQ-18菌懸液)。將各個(gè)樣品分別放置在25℃、30℃、35℃、37℃的搖床中恒溫培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速為均160rpm)，分別在1h和46h取樣，檢測(cè)搖瓶中MTBE濃度和二氧化碳生成量。

結(jié)果如圖3所示，在溫度為20～30℃時(shí)該菌株生長狀況良好，MTBE的去除率均可達(dá)到80％以上；溫度高于35℃時(shí)菌株對(duì)MTBE的去除率急速下降，高溫嚴(yán)重影響MQ-18的活性。

(2)pH對(duì)Piscinibacter sp.MQ-18降解MTBE的影響

在不同pH下實(shí)施Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明MQ-18在pH6.0～7.0具有較高的降解MTBE的能力，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：

在300mL的搖瓶中加入50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，用1mol/L NaOH水溶液或1mol/LH₂SO₄水溶液將無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，110℃滅菌40分鐘滅菌后，加入MTBE作唯一碳源，使MTBE的初始濃度為30mg/L，再加入2mL實(shí)施例2方法經(jīng)斜面和種子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液(濕菌體蛋白濃度170mg/L)。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)pH設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣和一個(gè)空白對(duì)照(不加MQ-18菌懸液)。將各個(gè)樣品放置在30℃的搖床中恒溫培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速為均160rpm)。分別在0h和46h取樣，檢測(cè)搖瓶中的MTBE濃度和二氧化碳生成量。

結(jié)果如圖4所示，在pH為6.0、6.5、7.0時(shí)，Piscinibacter sp.MQ-18生長狀況良好，在46h內(nèi)對(duì)MTBE的去除率均達(dá)80％以上，對(duì)MTBE去除效率較高。而在pH為5、7.5和8條件下，經(jīng)46h的培養(yǎng)，MTBE的去除率均在30％-40％左右，說明pH會(huì)影響MQ-18對(duì)MTBE的去除效率；在pH為4或者大于9時(shí)，去除率低于5％，表明在過酸或過堿的條件下，Piscinibacter sp.MQ-18都難以生存。

(3)不同菌體濃度的Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解情況

在不同Piscinibacter sp.MQ-18菌體初始濃度下，實(shí)施Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MQ-18菌體濃度越高，對(duì)MTBE降解能力越強(qiáng)，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：

在300mL的搖瓶中加入50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH值6.7，110℃滅菌40分鐘后，中加入MTBE作唯一碳源，使MQ-18菌體的初始濃度分別為0.07、0.34、0.68、3.42、6.83mg/L，初始MTBE濃度為30mg/L。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)初始濃度設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣和一個(gè)空白對(duì)照(不加MQ-18菌懸液)。將各個(gè)樣品放置在30℃的搖床中恒溫培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速為均160rpm)，檢測(cè)MTBE濃度變化，繪制Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解曲線圖。

結(jié)果如圖5所示，初始菌體濃度越高，其降解MTBE的停滯期越短，且降解速率越快。當(dāng)初始菌體濃度為6.83mg/L時(shí)，經(jīng)過46h，MTBE基本降解完全，降解速率為0.65mg·L^-1·h^-1。

(4)Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)不同初始濃度的MTBE的降解情況

在不同MTBE初始濃度下，實(shí)施Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MQ-18對(duì)150mg/L的MTBE降解效果最好，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：

在300mL的搖瓶中加入50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH值6.7，110℃滅菌40分鐘后，中加入MTBE作唯一碳源，使MTBE的初始濃度分別為30、60、90、120、150、225、300mg/L。再分別加入2mL實(shí)施例2方法經(jīng)斜面和種子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液(濕菌體蛋白濃度170mg/L)。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)初始濃度設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣和一個(gè)空白對(duì)照(不加MQ-18菌懸液)。將各個(gè)樣品放置在30℃的搖床中恒溫培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速為均160rpm)，檢測(cè)MTBE濃度變化，繪制Piscinibacter sp.MQ-18對(duì)MTBE的降解曲線圖。

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)MTBE初始濃度在150mg/L以下時(shí)，沒有明顯的停滯期，MTBE降解較快；當(dāng)初始濃度高于150mg/L時(shí)，由于底物的抑制作用，出現(xiàn)了一個(gè)20h左右的停滯期。但是就菌株降解速率而言，如圖7所示，初始濕菌體濃蛋白度相同的MQ-18，隨著底物濃度的增大，對(duì)底物的平均降解速率也在提高。

實(shí)施例4：Piscinibacter sp.MQ-18凈化模擬MTBE廢氣

利用生物滴濾塔處理模擬MTBE廢氣，工藝流程如圖8所示。

圖8為生物滴濾塔工藝流程圖，1.空氣泵，2.轉(zhuǎn)子流量計(jì)，3.質(zhì)量流量計(jì)，4.吹脫瓶，5.混合瓶，6.循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶，7.堿液瓶，8.pH控制儀，9.蠕動(dòng)泵，10.取樣口，11水浴保溫夾套，12.氣體采樣口，13.尾氣出口。

所述生物滴濾塔由設(shè)有廢氣進(jìn)口的塔底、設(shè)有生物填料層、取樣口10和水浴保溫夾套11的塔身、安裝有尾氣出口13、氣體采樣口11和營養(yǎng)液噴淋系統(tǒng)的塔頂、空氣泵1、吹脫瓶4、混合瓶5組成，所述的塔身由若兩個(gè)生物處理單元至下而上疊置安裝組成，相鄰層的生物處理單元之間布置水流通道以及供相鄰層氣連通的通氣口；所述的營養(yǎng)液噴淋系統(tǒng)由安裝在塔頂?shù)膰姙⑵?，設(shè)在生物滴塔外部的循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶6、營養(yǎng)液輸入管、pH控制儀8、蠕動(dòng)泵9、堿液瓶7連接組成；所述的pH控制儀分別與循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶和堿液瓶連接，pH控制儀還設(shè)有與循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶接通的pH計(jì)探頭；所述循環(huán)營養(yǎng)液儲(chǔ)存瓶通過蠕動(dòng)泵與噴灑器連通；所述空氣泵通過質(zhì)量流量計(jì)3和轉(zhuǎn)子流量計(jì)2分別與吹拖瓶和混合瓶連通，混合瓶中混勻廢氣通過轉(zhuǎn)子流量計(jì)與塔底廢氣進(jìn)口連通；所述生物填料層填料為拉西環(huán)。

由空氣泵1鼓出的空氣分為兩路，一路經(jīng)質(zhì)量流量計(jì)3進(jìn)入裝有MTBE廢液的吹脫瓶4中，用于吹脫MTBE，吹脫出的MTBE氣體與另一路經(jīng)過轉(zhuǎn)子流量計(jì)2進(jìn)入混合瓶5的空氣混合均勻后，通過控制質(zhì)量流量計(jì)和轉(zhuǎn)子流量計(jì)模擬得到不同濃度的MTBE廢氣。氣體自下而上流經(jīng)填料塔，填料塔中填料為拉西環(huán)，循環(huán)營養(yǎng)液由蠕動(dòng)泵9提升至塔頂后向下噴淋，為填料上附著的微生物提供其所需營養(yǎng)元素，在填料取樣口10取樣測(cè)定生物量，在塔頂?shù)臍怏w采樣口12測(cè)定出氣濃度，處理后的廢氣經(jīng)尾氣排放口13流出，營養(yǎng)液(按照實(shí)施例2方法經(jīng)斜面、種子和發(fā)酵培養(yǎng)制備的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液(濕菌體蛋白200mg/L))噴淋后流入儲(chǔ)液瓶6，利用堿液瓶7通過pH控制儀8調(diào)節(jié)儲(chǔ)液瓶6內(nèi)液體pH值。裝置的操作溫度由其外部的夾套水浴控溫11，控溫器控制在30℃左右。營養(yǎng)液的噴淋量為180ml/min，每隔2d更換一次營養(yǎng)液，其pH采用0.5mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)以維持在6.8～7.2之間。將按照實(shí)施例2方法經(jīng)斜面、種子和發(fā)酵培養(yǎng)制備的Piscinibacter sp.MQ-18菌懸液(200mg/L)接種至生物滴濾塔中，接種量為2L。掛膜啟動(dòng)過程中停留時(shí)間為60s，初始MTBE進(jìn)氣濃度為100mg/m³。

如圖9所示，MTBE進(jìn)口濃度為100mg/m³，生物滴濾塔運(yùn)行20d后完成掛膜，此時(shí)MTBE的去除率為90％左右。