本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測志賀氏菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

志賀氏菌屬(Shigella spp.)的細菌是一類革蘭氏陰性腸桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。志賀氏屬細菌可通過受到污染的水和食品進行傳播。人類對志賀菌屬細菌有很高的易感性，在幼兒可引起急性中毒性菌痢，病情較重，死亡率很高。因此，及時、準(zhǔn)確地對水或食品中的志賀氏菌進行檢測不僅為有效地預(yù)防治療和控制水或食源性傳染病提供依據(jù)，同時也是保障人民身體健康的必要手段。

傳統(tǒng)的志賀菌屬細菌檢測方法由于檢測周期較長，操作相對復(fù)雜，檢測效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測技術(shù)的發(fā)展，研究人員也開發(fā)出了PCR和實時熒光PCR等檢測手段，但是兩種方法都需要專門的檢測儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進行的實時實地檢測。為了確保食品安全，急需快速、簡單、準(zhǔn)確的方法來檢測食品中的志賀氏菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點。

引物設(shè)計是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測生物的公認的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說，用戶首先必須確保該靶基因為待測物種的特異序列。以發(fā)明專利ZL201010145716.2和ZL201310737377.0為例，它們分別針對文獻報道的志賀氏菌的特異基因——ipaH基因，采用LAMP技術(shù)進行志賀氏菌檢測。然而，所謂“公認的特異性基因”往往基于滯后的知識，并未基于不斷增長的微生物基因組數(shù)據(jù)進行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實際應(yīng)用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的引物通用性不能確保的問題。也就是說，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的志賀氏菌檢測序列實際上并非志賀氏菌所共有，即，有可能漏檢志賀氏菌的部分菌株。類似的問題也存在于通用性的確認，即，有可能將非志賀氏菌錯誤地認定為志賀氏菌。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的志賀氏菌檢測方法，同時滿足基層檢測部門對快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部開展實時實地檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具，設(shè)計用于特異性識別志賀氏菌的引物組，并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源(截至2013年8月5日數(shù)據(jù))進行志賀氏菌LAMP引物的設(shè)計，提供了一種快速恒溫擴增檢測志賀氏菌的方法、引物組及試劑盒。采用本發(fā)明的檢測方法檢測志賀氏菌，具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結(jié)果判定簡單，操作便捷，成本低的優(yōu)點。

本發(fā)明提出一種快速檢測志賀氏菌菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從待測樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下，進行恒溫擴增反應(yīng)；

(3)通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在志賀氏菌。

本發(fā)明恒溫檢測志賀氏菌菌株的方法，從待測樣品中提取基因組DNA，以其為模板，以志賀氏菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應(yīng)，然后，通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在志賀氏菌。其中，所述酶反應(yīng)體系包括但不限于DNA聚合酶反應(yīng)體系。

本發(fā)明中，所述志賀氏菌基因組特異性堿基序列為GI號為110804074的志賀氏菌的1921404～1921811bp位序列。

本發(fā)明中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組為所述基因組(GI號為110804074)的1921404～1921811bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。其中，所述志賀氏菌基因組特異性堿基序列是指僅為志賀氏菌基因組所特有的，而其它微生物基因組所不包含的堿基序列。

其中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異堿基序列的引物組包括但不限于引物組A，或選自與該引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組之任意一組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-AAGAGTGATTTCCTGGCCTG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCGGGTGTGATAAATGGGGCC-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACGTGAATATTCCGTTGCTGGC-3’(SEQ ID NO：4)。

本發(fā)明中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異堿基序列的引物組還可以包括與前述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組，該引物組包括但不限于以下引物組B：

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-TGATTTCCTGGCCTGGGTAA-3’(SEQ ID NO：6)(與引物B3_A5’-AAGAGTGATTTCCTGGCCTG-3’同源性為75％)

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCCGGGTGTGATAAATGGGGC-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACCTGCCAGGTGAATATTCCGT-3’(SEQ ID NO：8)。

本發(fā)明方法中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含但不限于一條環(huán)引物。優(yōu)選地，所述環(huán)引物是一條，為環(huán)引物L(fēng)B。所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’，B’之任意一組；或選自與所述引物組A’，B’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組之任意一組：

引物組A’：

上游外引物F3_A：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AAGAGTGATTTCCTGGCCTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCGGGTGTGATAAATGGGGCC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACGTGAATATTCCGTTGCTGGC-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_A：5’-GTGTGTCGGGTATGATGATGCCG-3’(SEQ ID NO：9)；

引物組B’：

上游外引物F3_B：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_B：5’-TGATTTCCTGGCCTGGGTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCCGGGTGTGATAAATGGGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：

5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACCTGCCAGGTGAATATTCCGT-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_B：5’-GTGTGTCGGGTATGATGATGCCG-3’(SEQ ID NO：10)。

本發(fā)明方法中，在一具體實施方案(含環(huán)引物)中，所述恒溫擴增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.4-1.0μmol/L的LB引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。在另一具體實施方案(不含環(huán)引物)中，所述恒溫擴增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。環(huán)引物有助于提高反應(yīng)效率。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明方法中，所述恒溫擴增反應(yīng)的反應(yīng)程序為①60～65℃孵育10～90min，優(yōu)選地為10～60min；②80℃終止反應(yīng)2～20min。本發(fā)明不限制通過其他適宜反應(yīng)程序來實現(xiàn)本發(fā)明檢測方法。

本發(fā)明方法中，檢測方法包括但不限于電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測等。所述電泳檢測，優(yōu)選為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。電泳檢測結(jié)果中，如電泳圖呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈志賀氏菌陽性，含有志賀氏菌；如電泳圖不呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈志賀氏菌陰性。所述濁度檢測，是用肉眼觀察或濁度儀檢測濁度，檢測管出現(xiàn)混濁，則待測樣品呈志賀氏菌陽性，含有志賀氏菌；如未見混濁，則待測樣品為志賀氏菌陰性。也可以經(jīng)離心后肉眼觀察反應(yīng)管底是否有沉淀，若反應(yīng)管底有沉淀，則待測樣品呈志賀氏菌陽性，含有志賀氏菌；如反應(yīng)管底沒有沉淀，則待測樣品呈志賀氏菌陰性。

所述顯色檢測，是在反應(yīng)管中加入顯色劑，包括但不限于鈣黃綠素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羥基萘酚藍(即HNB，120-150μM)。當(dāng)采用鈣黃綠素或SYBR Green I作為顯色劑時，如反應(yīng)后顏色為橙色，則待測樣品為志賀氏菌陰性；如反應(yīng)后顏色為綠色，則待測樣品為志賀氏菌陽性，含有志賀氏菌。當(dāng)采用羥基萘酚藍作為顯色劑時，如反應(yīng)后顏色為紫羅蘭色，則待測樣品為志賀氏菌陰性；如反應(yīng)后顏色為天藍色，則待測樣品為志賀氏菌陽性。所述顯色檢測，除了上述通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果外，也可以通過檢測儀器進行實時或終點檢測反應(yīng)結(jié)果，通過合理的設(shè)定陰性反應(yīng)的閾值，當(dāng)待測樣品反應(yīng)的結(jié)果低于或等于該閾值時，則待測樣品為志賀氏菌陰性；當(dāng)待測樣品反應(yīng)的結(jié)果大于該閾值時，則待測樣品為志賀氏菌陽性。所述檢測儀器包括但不限于熒光分光光度計、熒光定量PCR儀、恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和Genie II等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)等。

所述顯色檢測中，若采用鈣黃綠素或羥基萘酚藍作為顯色劑，可以在恒溫擴增反應(yīng)之前加入，也可以在恒溫擴增反應(yīng)完成之后加入，優(yōu)選地為恒溫擴增反應(yīng)之前加入，可以有效的減少反應(yīng)污染的可能性。若采用SYBR Green I作為顯色劑，則在恒溫擴增反應(yīng)完成之后加入。若采用鈣黃綠素作為顯色劑，則在酶反應(yīng)體系中加入50μM鈣黃綠素的同時，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本發(fā)明還提供了用于恒溫檢測志賀氏菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能擴增志賀氏菌基因組特異堿基序列的引物組，其包括但不限于，所述引物的序列為GI號為110804074的志賀氏菌基因組的1921404～1921811bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。

其中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下各引物組之任意一組，或選自與所述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的任一引物組。其中，所述引物組包括但不限于以下引物組A。所述與前述引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組包括但不限于以下引物組B。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AAGAGTGATTTCCTGGCCTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCGGGTGTGATAAATGGGGCC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：

5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACGTGAATATTCCGTTGCTGGC-3’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_B：5’-TGATTTCCTGGCCTGGGTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCCGGGTGTGATAAATGGGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：

5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACCTGCCAGGTGAATATTCCGT-3’。

本發(fā)明用于所述恒溫檢測志賀氏菌方法中的引物中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組還可以包含但不限于一條環(huán)引物；優(yōu)選地，所述環(huán)引物是一條，為LB。所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’，B’之任意一組；或選自與所述引物組A’，B’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組之任意一組：

引物組A’：

上游外引物F3_A：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AAGAGTGATTTCCTGGCCTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCGGGTGTGATAAATGGGGCC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：

5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACGTGAATATTCCGTTGCTGGC-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_A：5’-GTGTGTCGGGTATGATGATGCCG-3’；

引物組B’：

上游外引物F3_B：5’-AGTCAGTCTGGATATGGGCC-3’；

下游外引物B3_B：5’-TGATTTCCTGGCCTGGGTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-ACGCCCTGAGACAACAGAACCCGGGTGTGATAAATGGGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：

5’-GGATGCTGAGCACCCCTTCAAACCTGCCAGGTGAATATTCCGT-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_B：5’-GTGTGTCGGGTATGATGATGCCG-3’。

本發(fā)明還提供一種用于上述恒溫檢測志賀氏菌菌株方法中的試劑盒，其包括所述能擴增志賀氏菌基因組特異堿基序列的引物組。本發(fā)明試劑盒中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組，包括但不限于以基因組(GI號:110804074)的1921404～1921811bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分作為所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物組A。還包括但不限于以與前述引物序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為75％及以上的引物組作為引物；包括但不限于引物組B。

本發(fā)明試劑盒中，所述能擴增志賀氏菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含但不限于一條環(huán)引物；環(huán)引物作為可選組分。優(yōu)選地，所述環(huán)引物是一條，為LB。包含環(huán)引物L(fēng)B的引物組包括但不限于引物組A’、B’等。在具體實施方案中，本發(fā)明試劑盒中可以包含0.4-1.0μmol/L的LB環(huán)引物。在一具體實施方案中，引物組的序列分別為FIP、BIP、F3、B3、LB所示的引物、或與前述序列或其互補鏈序列單條引物同源性為75％及以上的引物。

本發(fā)明試劑盒中，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜堿中的一種或多種。在一具體實施方案中，本發(fā)明試劑盒酶反應(yīng)體系包含1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陽性對照模板。在一具體實施方案中，所述陽性對照模板包括但不限于志賀氏菌的全基因組DNA、部分基因組DNA，或包含志賀氏菌全基因組DNA或部分基因組DNA的載體。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陰性對照模板，所述陰性對照模板包括但不限于雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含顯色劑，顯色劑包括但不限于鈣黃綠素，SYBR Green I或羥基萘酚藍。當(dāng)顯色劑為鈣黃綠素時，試劑盒中還包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本發(fā)明試劑盒中，還包含雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含核酸抽提試劑。

本發(fā)明還提出了一種載體，所述載體包含選自引物組A、B、A’、B’之任意一組引物。該載體由于包含了具有志賀氏菌特異性的DNA序列，因此可應(yīng)用于微生物分類學(xué)、比較基因組學(xué)、進化等研究領(lǐng)域，以及微生物檢測等應(yīng)用領(lǐng)域。該載體可以是但不限于質(zhì)粒載體(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti質(zhì)粒等)、病毒載體(如λ噬菌體等)和人造染色體載體(如細菌人造染色體BAC、酵母人造染色體YAC等)。例如，包含引物組A之任意一條引物的載體pBR322-A、包含引物組B之任意一條引物的載體pBR322-B、包含引物組A’之任意一條引物的載體pBR322-A’、包含引物組B’之任意一條引物的載體pBR322-B’。包含引物組A之任意一條引物的載體λ噬菌體-A、包含引物組B之任意一條引物的載體λ噬菌體-B、包含引物組A’之任意一條引物的載體λ噬菌體-A’、包含引物組B’之任意一條引物的載體λ噬菌體-B’等。

本發(fā)明還提出了選自引物組A、B、A’、B’之任意一組的引物在恒溫檢測志賀氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述試劑盒在恒溫檢測志賀氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述載體在恒溫檢測志賀氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明為食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡單快速靈敏的檢測志賀氏菌的方法、引物/引物組、檢測試劑/試劑盒，對我國的食品安全具有較大意義。本發(fā)明有益效果包括：采用本發(fā)明志賀氏菌檢測方法具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短、結(jié)果判定簡單、操作便捷、成本低等優(yōu)點。與目前常用檢測方法相比，本發(fā)明采用的恒溫擴增法，可以在恒溫條件下進行，只需采用簡單的恒溫裝置，不需要PCR實驗中的昂貴儀器，不需要對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測等步驟，因而，非常適于廣泛應(yīng)用于社會各界包括基層食品安全檢測部門推廣使用，即使在分子生物學(xué)專業(yè)知識和技能基礎(chǔ)相對不足的環(huán)境下也可充分應(yīng)用?；诒绢I(lǐng)域常識可將上述各優(yōu)選條件進行任意組合，均屬本發(fā)明保護范圍。

附圖說明

圖1表明本發(fā)明實施例7志賀氏菌恒溫檢測方法的特異性。

圖2表明本發(fā)明實施例8志賀氏菌檢測方法的靈敏度。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1-6志賀氏菌恒溫反應(yīng)體系和檢測方法

按照以下(1)～(3)步驟進行檢測：

(1)基因組DNA的提取

用于檢測的志賀氏菌(福氏志賀氏菌)菌種來源于中國普通微生物菌種保藏中心，編號CGMCC 1.1868。取1mL細菌培養(yǎng)物使用北京天根生物工程公司的細菌核酸提取試劑盒提取基因組DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8，濃度為400ng/μL。

(2)以待測志賀氏菌基因組DNA為模板，分別采用自配的試劑盒(見表2，表3)，并按照表3中所述條件，配制反應(yīng)體系，以志賀氏菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應(yīng)。實施例1～6中的引物分別為引物組A，A，A’，B，B’，B’。

(3)按照表3中所述條件，通過電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測，進行擴增結(jié)果確認。

由表3可以看出，本發(fā)明檢測方法及其所采用的引物組及反應(yīng)體系能夠很好地對志賀氏菌特異性片段進行擴增并得到檢測結(jié)果。此外，當(dāng)采用檢測儀進行檢測時，縮短反應(yīng)時間至10min時也有很好的檢測效果(如實施例6)。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測樣本中是否含有志賀氏菌。

實施例7志賀氏菌特異性檢測

收集非志賀氏菌26株(表4和圖1中的1～13，17～29)，將這些菌株與志賀氏菌菌株(表4和圖1中的14～16)分別進行培養(yǎng)，取1mL菌液，采用試劑盒IA，提取細菌DNA，并參照實施例1的反應(yīng)體系和條件，分別進行LAMP擴增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。

其檢測結(jié)果如表4和圖1所示，圖1中，1～13分別為金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、表皮葡萄球菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌、蕈樣芽孢桿菌、單核增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、腸沙門氏菌腸亞種、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌，17～29分別為大腸埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、阪崎克羅諾桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌和霍亂弧菌，NTC：陰性對照，14～16分別為痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌和福氏志賀氏菌。圖1中，僅有志賀氏菌菌株擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽性結(jié)果，如第14～16號管所示。而其他非志賀氏菌菌株及陰性對照擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物均呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果，如第1～13號、17～29號管以及NTC陰性對照管所示。

由圖1和表4結(jié)果可以看出，本發(fā)明檢測試劑盒及檢測方法具有良好的志賀氏菌菌株特異性，即，只有志賀氏菌菌株擴增陽性，其他非志賀氏菌菌株為陰性。

配制檢測試劑盒，試劑盒中采用的引物分別為引物組B，引物組A’，B’，按上述特異性檢測方法，分別得到同樣的檢測結(jié)果，即，非志賀氏菌菌株及陰性對照擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陰性結(jié)果，志賀氏菌菌株擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陽性結(jié)果。

此外，按照表1中所述方法，分別對引物組A，引物組B，引物組A’，B’的特異性進行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各條引物最多允許三個錯配的情況下，各引物組最多有一條引物比對到非志賀氏菌上，表明各引物組的特異性均較好。

實施例8靈敏度檢測

按實施例2的方法提取福氏志賀氏菌CGMCC 1.1868的DNA，采用試劑盒IIB，并按照10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg DNA梯度加入反應(yīng)體系，其他反應(yīng)條件參照表3實施例2的方法分別進行LAMP擴增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。如圖2所示，1～7分別為10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg，NTC：陰性對照。圖2中10ng和1ng處理的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽性結(jié)果，100pg、10pg、1pg、100fg、10fg處理和陰性對照的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果。檢測結(jié)果表明，每個反應(yīng)管中最低含1ng(約相當(dāng)于2×10⁵個細菌)的DNA時仍可被檢出。

按上述檢測方法，其他步驟及條件同上，分別用引物組B，引物組A’，B’，每個反應(yīng)管中低至1ng～1pg的DNA仍可被檢出。

實施例9通用性檢測

按照實施例1的方法，對痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌和福氏志賀氏菌(表4和圖1中的14～16)分別進行培養(yǎng)和提取DNA，并進行LAMP擴增(引物組為A)，檢測結(jié)果如表4和圖1所示，三種志賀氏菌株擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物均呈現(xiàn)為亮綠色，為陽性結(jié)果，表明該引物組的通用性較好。

配制檢測試劑盒，試劑盒中采用的引物分別為引物組B，引物組A’，引物組B’，按上述通用性檢測方法，分別得到同樣的檢測結(jié)果，即三種志賀氏菌株擴增陽性，表明各引物組的通用性較好。

按照表1中所述方法，分別對引物組A，引物組B，引物組A’，B’的通用性進行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各引物組的引物區(qū)域與8株志賀氏菌(GI號分別為30061571，74310614，82542618，110804074，187730020，344915202，377520096和384541581)的完全匹配，與GI號為82775382的痢疾志賀氏菌在引物區(qū)(B3和/或B2)共有1～2個錯配，理論上可以用于上述9株志賀氏菌菌株的檢測，表明各引物組的通用性均較好。

表1志賀氏菌的現(xiàn)有檢測方法中引物的通用性和特異性分析

注：a)將專利中引物F3和B3間的序列與志賀氏菌的9個基因組(GI號分別為110804074，82775382，30061571，74310614，82542618，187730020，344915202，377520096和384541581)進行Bowtie比對，確定檢測區(qū)域在GI號110804074基因組中的位置。b)將檢測區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫資源中進行Blast比對，引物區(qū)域完全匹配為通用性好。c)將檢測區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫資源中進行Blast比對，引物區(qū)域匹配程度越高，特異性越差；若引物不能同時比對到非志賀氏菌株上，表明特異性好。

表2恒溫檢測志賀氏菌的試劑盒種類及主要組成成分

表3實施例1-6本發(fā)明恒溫檢測志賀氏菌的方法中的反應(yīng)條件及檢測結(jié)果

表4試驗所用菌株及檢測結(jié)果

注：a)CGMCC：中國普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，

CMCC：中國醫(yī)學(xué)細菌菌種保藏管理中心。b)+：陽性結(jié)果，-：陰性結(jié)果。