本發(fā)明涉及一種固定化漢遜德巴利酵母的方法，具體涉及一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法。

背景技術(shù)：

3-羥基丙酸在工業(yè)上主要作為化學(xué)中間體，可以合成乙烯基氰、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、1，3-丙二醇和丙二酸等，它還是新型綠色環(huán)保材料聚3-羥基丙酸的重要原料。除此之外，3-羥基丙酸在生產(chǎn)特殊涂料、金屬潤(rùn)滑劑、紡織業(yè)上的抗靜電劑及食品、飼料添加劑和保鮮劑等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用。

目前化學(xué)方法生產(chǎn)3-羥基丙酸由于對(duì)環(huán)境污染危害較大，已經(jīng)逐步被生物合成法所替代。然而生物合成法生產(chǎn)3-羥基丙酸普遍存在產(chǎn)量低的弊端，導(dǎo)致供需之間的不平衡。細(xì)胞固定化技術(shù)是通過(guò)化學(xué)或者物理的方法將細(xì)胞或者細(xì)胞產(chǎn)生的游離酶固定在與之對(duì)應(yīng)載體上，用以催化細(xì)胞增殖及生化反應(yīng)的技術(shù)。固定化細(xì)胞技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性能、簡(jiǎn)單方便的操作、產(chǎn)物易于分離、生產(chǎn)效率高、可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。但是固定化細(xì)胞技術(shù)還有很多問(wèn)題有待解決，比如固定化方式、尋找耐受性強(qiáng)的包埋材料、提高產(chǎn)物產(chǎn)量等。目前利用固定化細(xì)胞制備3-羥基丙酸需要解決的主要問(wèn)題是如何提高產(chǎn)量與載體的穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法，固定化后載體穩(wěn)定，并且提高了3-羥基丙酸的產(chǎn)量，適合產(chǎn)業(yè)化推廣。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法，包括以下步驟：

s1、將漢遜德巴利酵母依次經(jīng)種子斜面培養(yǎng)基活化、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，通過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾分離漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種和發(fā)酵培養(yǎng)基，得漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種液；

s2、將海藻酸鈉、活性炭的混合物與所得的漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種與按照0.5∶1-1∶1(w/v)比例混合，得混合液；其中，海藻酸鈉終濃度為25-35g/l，活性炭終濃度為8-10g/l；

s3、用注射器吸取混合液滴入濃度為19-21g/l的cacl2溶液內(nèi)，，室溫固定1-3h，得直徑0.3-0.5cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

s4、按照2-3個(gè)小球/mg過(guò)濾后的菌種的標(biāo)準(zhǔn)，將步驟s3所得的漢遜德巴利酵母小球與過(guò)濾分離后的上述s1步驟的液體發(fā)酵菌種混合，再加入聚乙烯醇和海藻酸鈉并混勻，聚乙烯醇終濃度為80-100g/l，海藻酸鈉終濃度在9-11g/l；用直徑0.8cm吸管吸取混合液滴入濃度為9-11g/l的cacl2溶液內(nèi)，室溫固定1-3h，4℃冰箱固定1-3h，得直徑0.8-1.2cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

s5、將步驟s4所得的漢遜德巴利酵母小球加入到80-120ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，28-32℃，在轉(zhuǎn)速為220-280r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48-72h。

優(yōu)選地，第一次固定化后漢遜德巴利酵母小球直徑為0.3cm，第二次固定化后漢遜德巴利酵母小球直徑為1.2cm。

優(yōu)選地，所述步驟s2中海藻酸鈉、活性炭混合物中海藻酸鈉溶液/活性炭＝1∶1(w/v)。

優(yōu)選地，所述步驟s4中聚乙烯醇、海藻酸鈉混合物中聚乙烯醇/海藻酸鈉溶液＝2∶1(w/v)。

優(yōu)選地，第一次固定化所用海藻酸鈉終濃度為30g/l，第二次固定化所用海藻酸鈉終濃度為10g/l。

優(yōu)選地，第一次固定化所用cacl2溶液的濃度為21g/l，第二次固定化所用cacl2終濃度為10g/l。

優(yōu)選地，第一次固定化所用活性炭終濃度為8g/l，第二次固定化所用聚乙烯醇終濃度為90g/l。

本發(fā)明具有以下有益效果：

利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法，制備方法新穎、簡(jiǎn)便，操作程序易于控制，產(chǎn)量高，克服了傳統(tǒng)菌種產(chǎn)3-羥基丙酸產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，，固定化后載體穩(wěn)定，并且提高了3-羥基丙酸的產(chǎn)量，適合產(chǎn)業(yè)化推廣。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中3-羥基丙酸標(biāo)準(zhǔn)樣品高效液相色譜圖；

圖2為未固定化漢遜德巴利酵母產(chǎn)3-羥基丙酸高效液相色譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所得的復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母產(chǎn)3-羥基丙酸高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

以下實(shí)施例中，所使用的

漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)：本實(shí)驗(yàn)室從葡萄表面分離后，于2015年12月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為：cgmccno.11893。

種子斜面培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，酵母浸膏6，玉米漿9，(nh4)2so415，kh2po49，k2hpo43，mgso41.46，feso4·7h2o0.03，瓊脂20，自然ph；

種子培養(yǎng)基(g/l)：甘油20，酵母浸膏6，麥芽汁9，(nh4)2so415，kh2po43、mgso41.46，feso4·7h2o0.03，自然ph；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按2％(v/v)加入丙酸。

實(shí)施例1

(1)海藻酸鈉與活性炭固定化漢遜德巴利酵母

采用種子斜面培養(yǎng)基活化漢遜德巴利酵母，經(jīng)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離漢遜德巴利酵母細(xì)胞和發(fā)酵培養(yǎng)基，按照0.5∶1(w/v)比例，將漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種與海藻酸鈉、活性炭混合，海藻酸鈉終濃度為25g/l，活性炭終濃度為8g/l；用注射器吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為19g/l，室溫固定1h，制備成直徑0.3cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(2)聚乙烯醇與海藻酸鈉二次固定化漢遜德巴利酵母

按照2個(gè)/mg的標(biāo)準(zhǔn)，將第一次固定化漢遜德巴利酵母小球再次與過(guò)濾分離后的液體發(fā)酵菌種混合，聚乙烯醇終濃度為80g/l，海藻酸鈉終濃度在9g/l；用直徑0.8cm吸管吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為9g/l，室溫固定1h，4℃冰箱固定1h，制備成直徑0.8cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(3)高效液相色譜測(cè)定3-羥基丙酸含量

將第二次固定化漢遜德巴利酵母小球加入到80ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為28℃，在轉(zhuǎn)速為220r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48h，利用高效液相色譜測(cè)定每次過(guò)濾分離的發(fā)酵培養(yǎng)基中3-羥基丙酸含量，取3次平均值為22.56g/l。

實(shí)施例2

(1)海藻酸鈉與活性炭固定化漢遜德巴利酵母

采用種子斜面培養(yǎng)基活化漢遜德巴利酵母，經(jīng)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離漢遜德巴利酵母細(xì)胞和發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1∶1(w/v)比例，將漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種與海藻酸鈉、活性炭混合，海藻酸鈉終濃度為30g/l，活性炭終濃度為9g/l；用注射器吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為20g/l，室溫固定2h，制備成直徑0.4cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(2)聚乙烯醇與海藻酸鈉二次固定化漢遜德巴利酵母

按照3個(gè)/mg的標(biāo)準(zhǔn)，將第一次固定化漢遜德巴利酵母小球再次與過(guò)濾分離后的液體發(fā)酵菌種混合，聚乙烯醇終濃度為90g/l，海藻酸鈉終濃度在10g/l；用直徑0.8cm吸管吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為10g/l，室溫固定2h，4℃冰箱固定2h，制備成直徑1cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(3)高效液相色譜測(cè)定3-羥基丙酸含量

將第二次固定化漢遜德巴利酵母小球加入到100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為30℃，在轉(zhuǎn)速為260r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48h，利用高效液相色譜測(cè)定每次過(guò)濾分離的發(fā)酵培養(yǎng)基中3-羥基丙酸含量，取3次平均值為41.75g/l。

實(shí)施例3

(1)海藻酸鈉與活性炭固定化漢遜德巴利酵母

采用種子斜面培養(yǎng)基活化漢遜德巴利酵母，經(jīng)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離漢遜德巴利酵母細(xì)胞和發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1∶1(w/v)比例，將漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種與海藻酸鈉、活性炭混合，海藻酸鈉終濃度為35g/l，活性炭終濃度為10g/l；用注射器吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為21g/l，室溫固定3h，制備成直徑0.5cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(2)聚乙烯醇與海藻酸鈉二次固定化漢遜德巴利酵母

按照3個(gè)/mg的標(biāo)準(zhǔn)，將第一次固定化漢遜德巴利酵母小球再次與過(guò)濾分離后的液體發(fā)酵菌種混合，聚乙烯醇終濃度為100g/l，海藻酸鈉終濃度在11g/l；用直徑0.8cm吸管吸取混合液滴入cacl2溶液，所述cacl2溶液的濃度為11g/l，室溫固定3h，4℃冰箱固定3h，制備成直徑1cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

(3)高效液相色譜測(cè)定3-羥基丙酸含量

將第二次固定化漢遜德巴利酵母小球加入到100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為32℃，在轉(zhuǎn)速為280r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72h，利用高效液相色譜測(cè)定每次過(guò)濾分離的發(fā)酵培養(yǎng)基中3-羥基丙酸含量，取3次平均值為30.50g/l。

對(duì)比例

漢遜德巴利酵母在種子斜面培養(yǎng)基上活化后，按照5％接種量接入含有300ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，28℃下150r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h。采用高效液相色譜測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中3-羥基丙酸含量，如圖2所示，重復(fù)三次得平均值為14.58g/l。

以上結(jié)果表明：復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母制備方法簡(jiǎn)單，3-羥基丙酸產(chǎn)量較未固定化菌種高，固定化細(xì)胞培養(yǎng)期間固定化小球形態(tài)未發(fā)生顯著變化。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。