本發(fā)明涉及一種花青素的提取，特別涉及一種采用微波萃取聯(lián)合超聲波輔助快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素方法。

(二)

背景技術(shù)：

原花青素是一種黃烷醇單體及其聚合物的多醇類化合物，廣泛存在于植物界中。它是由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素、棓兒茶素、表棓兒茶素或沒食子酸聚合而成。簡單的原花青素一般指二聚體，因鍵合位置和構(gòu)型不同常形成不同的異構(gòu)體。原花青素中二聚體是最重要也是在植物中分布最廣的。原花青素除二聚體外還有其他多聚體。根據(jù)聚合度的大小，把聚合度小于5的稱為低聚體，大于或等于5的稱為高聚體。通常根據(jù)低聚原花青素的鍵合位置將其分為A、B、C、T、D等幾種類型，如原花青素B1、B2、A1、C1等。相關(guān)研究表明，原花青素具有多種生物學(xué)功能，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑，具有如抗氧化、防衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防心血管疾病等活性，還有滋潤皮膚、防曬美白功能、治療眼科疾病、抑菌作用、消除水腫、保護(hù)肝臟、防止靜脈曲張、改善缺氧等功效，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

自從20世紀(jì)中期，法國科學(xué)家就從松樹皮提取出含有原花青素的物質(zhì)以來迄今，全世界對原花青素的研究日益廣泛，目前已有對葡萄籽、蘋果、山楂、可可豆、蔓越橘、海岸松等幾十種植物原花青素含量、分布和組成進(jìn)行了研究，認(rèn)為原花青素大部分存在于植物的核、皮、莖、葉和種子中。紫蘇，學(xué)名：Perilla frutescens(L.)Britt.，別名：桂荏、白蘇、赤蘇等，為唇形科一年生草本植物。紫蘇植株含各種特有的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分，經(jīng)濟(jì)價值很高，尤其莖葉中高含原花青素更是倍受世界學(xué)術(shù)界關(guān)注。

從植物植株莖葉中提取原花青素的方法有直接浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界流體提取法等。以上方法一般都是將植物莖葉進(jìn)行干燥、粉碎、過篩，脫脂得到粉末，再將粉末經(jīng)提取、過濾、濃縮，再溶解最后固相萃取得到精制原花青素。以上方法過程繁瑣，提取周期長，原花青素不穩(wěn)定容易遭到破壞，尤其干燥和粉碎過程極其容易破壞原花青素的組成。本發(fā)明提出直接從新鮮的紫蘇莖葉中，采用微波萃取聯(lián)合超聲波輔助濕法快速提取低聚原花青素的工藝，并利用紫外分光光度法對其進(jìn)行檢測，具有選擇性好、提取效率高、工藝簡單、提取時間短等優(yōu)點。

迄今尚沒有從新鮮紫蘇莖葉中采用微波萃取聯(lián)合超聲波輔助快速提取低聚原花青素工藝的報道。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種采用微波萃取聯(lián)合超聲波輔助快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素的方法及其應(yīng)用，具有選擇性好、提取效率高、工藝簡單、提取時間短等優(yōu)點。

為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種從新鮮紫蘇莖葉中提取的原花青素，所述原花青素提取方法為：(1)采集新鮮紫蘇莖葉，清洗，晾干，獲得預(yù)處理后的紫蘇莖葉；將預(yù)處理后的紫蘇莖葉加入體積濃度45-65％的乙醇水溶液中研磨成漿液，過濾，取濾液，獲得初提液；(2)將初提液在微波功率280-320W條件下提取30-40s，獲得微波提取液，減壓濃縮至原體積的1/2，獲得微波濃縮液；(3)將微波濃縮液進(jìn)行超聲波提取，超聲波功率420-460W，提取溫度50-60℃，提取時間30-50min，獲得超聲提取液，離心，取上清液減壓濃縮至干，即獲得原花青素粗品，將原花青素粗品用體積濃度5％的乙醇水溶液溶解，采用NKA-II型大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，以體積濃度60％的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集流出液，濃縮至干，獲得原花青素。

進(jìn)一步，步驟(1)所述乙醇水溶液體積用量以預(yù)處理后紫蘇莖葉質(zhì)量計為0.5-3ml/g，優(yōu)選3ml/g。

進(jìn)一步，步驟(2)所述提取是在微波功率320W條件下提取40s。

進(jìn)一步，步驟(3)所述提取條件為超聲波功率460W，提取溫度60℃，提取時間30min。

本發(fā)明提取工藝流程：優(yōu)質(zhì)紫蘇莖葉→研磨、搗汁→過濾→濃漿→微波萃取→蒸發(fā)濃縮→超聲波提取→真空濃縮→粗產(chǎn)品→洗脫→真空濃縮→干燥→精產(chǎn)品。精制原花青素可通過紫外分光光度法進(jìn)行檢測。

本發(fā)明還提供一種所述從新鮮紫蘇莖葉中提取的原花青素在制備肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)劑中的應(yīng)用，即在PM2.5致肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中起著保護(hù)性作用。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明涉及一種采用微波萃取聯(lián)合超聲波輔助快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素工藝，利用該方法可從紫蘇莖葉中快速、簡單地提取得到含量大于76％，提取率可達(dá)9.5％的低聚原花青素制品，二聚體的分子量檢測圖見圖7。提取得到的低聚原花青素制品可應(yīng)用在緩解或保護(hù)PM2.5呼吸暴露導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中。

(四)附圖說明

圖1為紫蘇莖葉中快速提取的低聚原花青素制品；

圖2為兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為NKA-II型大孔吸附樹脂洗脫曲線；

圖4為原花青素粗產(chǎn)品紅外光譜圖；

圖5為原花青素粗產(chǎn)品洗脫精制后的紅外光譜圖；

圖6為MTT法檢測紫蘇原花青素提取物能提高H₂O₂損傷的A549細(xì)胞的存活率圖；

圖7為原花青素與蛇毒磷脂酶A2連接反應(yīng)后的SDS-PAGE圖，1.Marker；2.純蛇毒蛋白PLA2；3，4，5為原花青素與PLA2反應(yīng)物。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實施例1：微波萃取聯(lián)合超聲波輔助快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素

(1)采摘生長正常植株的無病損、無干枯優(yōu)質(zhì)紫蘇莖葉，清水洗干凈，晾干，獲得預(yù)處理后的新鮮紫蘇莖葉；稱取500克新鮮紫蘇莖葉，加入1.5L體積濃度為65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎機(jī)(九陽牌JYZ-D51)中連續(xù)研磨2分鐘，取出濃漿，紗布擠壓過濾，得初提液。取初提液經(jīng)12000rpm離心15min，吸取1.0mL上清液用體積濃度0.5％甲醇水溶液稀釋3倍體積后，按實施例2方法采用香草醛-鹽酸比色法方法計算原花青素含量44％和提取率3.5％。

(2)微波萃取

將步驟(1)中的初提液用格蘭仕微波爐，在微波功率320W條件下提取40s，獲得微波提取液。取微波提取液，10000rmp離心15min，吸取上清液，采用香草醛-鹽酸比色法測定原花青素含量69％和提取率6.3％。

(3)蒸發(fā)濃縮

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將步驟(2)微波提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/2，獲得微波提取濃縮液。

(4)超聲波提取

將步驟(3)微波提取濃縮液采用KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器進(jìn)行超聲輔助提取，超聲波功率460W，提取溫度60℃，提取時間30min，獲得超聲提取液；取出，10000rmp離心15min，上清液加入3倍體積體積濃度0.5％甲醇水溶液配制成溶液，然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，比例為1:3.5(原花青素：乙酸乙酯溶劑)，提取液經(jīng)真空濃縮至干燥，獲得低聚原花青素提取物粗品，香草醛-鹽酸比色法測定原花青素含量。測定結(jié)果：原花青素質(zhì)量含量大于76％，提取率可達(dá)9.5％(圖1)。

現(xiàn)有方法首先是將紫蘇葉進(jìn)行干燥、粉碎、過篩，脫脂得到紫蘇葉粉末，再將紫蘇葉粉末按照本實施例經(jīng)提取、過濾、濃縮，再溶解最后經(jīng)NKA-II型大孔吸附樹脂精制得到的原花青素，利用該方法從紫蘇葉中快速、簡單的提取得到的低聚原花青素，干燥粉碎后經(jīng)微波萃取得到的原花青素提取率為4.8％。

表1不同條件對原花青素提取率的影響

實施例2：微波萃取快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素

(1)采摘生長正常植株的無病損、無干枯優(yōu)質(zhì)紫蘇莖葉，清水洗干凈，晾干，獲得預(yù)處理后的新鮮紫蘇莖葉；稱取500克新鮮紫蘇莖葉，加入1.5L體積濃度為65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎機(jī)(九陽牌JYZ-D51)中連續(xù)研磨2分鐘，取出濃漿，紗布擠壓過濾，得初提液。取初提液經(jīng)12000rpm離心15min，吸取1.0mL上清液用體積濃度0.5％甲醇水溶液稀釋3倍體積后，按實施例2方法采用香草醛-鹽酸比色法方法計算原花青素含量44％和提取率3.5％。

(2)微波萃取

將步驟(1)中的初提液用格蘭仕微波爐，在微波功率260、280、300、320、340W條件下提取40s，獲得微波提取液。取微波提取液，10000rmp離心15min，吸取上清液，采用香草醛-鹽酸比色法測定原花青素提取率分別為4.2％、4.8％、5.3％、6.3％和5.2％。

實施例3：超聲波輔助快速提取紫蘇莖葉中的低聚原花青素

(1)采摘生長正常植株的無病損、無干枯優(yōu)質(zhì)紫蘇莖葉，清水洗干凈，晾干，獲得預(yù)處理后的新鮮紫蘇莖葉；稱取500克新鮮紫蘇莖葉，加入1.5L體積濃度為65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎機(jī)(九陽牌JYZ-D51)中連續(xù)研磨2分鐘，取出濃漿，紗布擠壓過濾，得初提液。取初提液經(jīng)12000rpm離心15min，吸取1.0mL上清液用體積濃度0.5％甲醇水溶液稀釋3倍體積后，按實施例2方法采用香草醛-鹽酸比色法方法計算原花青素含量44％和提取率3.5％。

(2)超聲波輔助提取

將步驟(1)中的提取濃縮液采用KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器進(jìn)行超聲輔助提取，在超聲波功率340、380、420、460、500W條件下提取40s，獲得提取液。取提取液，10000rmp離心15min，吸取上清液，采用香草醛-鹽酸比色法測定原花青素提取率分別為4.6％、4.7％、5.4％、5.6％和5.3％。

實施例4：原花青素含量測定

(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用香草醛-鹽酸比色法，用甲醇將兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.07mg/mL、0.lmg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL后依次加入6mL體積濃度0.5％的香草醛-甲醇溶液、質(zhì)量濃度36-38％濃鹽酸3mL，混合均勻后在水浴鍋中恒溫(30℃)，避光反應(yīng)40min，測定500nm處吸光值。空白對照用“甲醇:香草醛-甲醇溶液:濃鹽酸＝1:6:3，v/v/v”的混合溶液，橫坐標(biāo)為兒茶素濃度、縱坐標(biāo)為吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

(2)原花青素含量測定和提取率的計算

采用香草酸-鹽酸比色法測定原花青素的含量，準(zhǔn)確移取1mL樣品溶液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出提取液中原花青素的濃度C，再按公式(1)計算原花青素的提取率，公式如下:

提取率＝(V×C×N/W)×100％ (1)

其中N表示提取液的稀釋倍數(shù)；C表示提取液稀釋后原花青素的濃度(mg/mL)；V表示提取液體積(mL)；W表示莖葉的質(zhì)量(g)。

實施例5：低聚原花青素的精制與光譜分析

(1)選用NKA-II型大孔吸附樹脂，對實施例1步驟(4)獲得的低聚原花青素提取物粗品10g進(jìn)行精分離。

樹脂預(yù)處理：將NKA-II型大孔吸附樹脂放置于燒杯中，用無水乙醇浸泡24h，充分溶脹后用無水乙醇沖洗至樹脂無白色渾濁時停止沖洗，再用去離子水洗至無醇備用。

取經(jīng)預(yù)處理的樹脂2g裝柱(15mm×90mm)；

將實施例1步驟(4)獲得的低聚原花青素提取物粗品10g用體積濃度0.5％甲醇水溶液100mL溶解，制成樣液。取體積濃度0.5％甲醇水溶液100mL上柱(15mm×90mm)，靜置30min后，取等量樣液緩慢加入NKA樹脂柱中，先用去離子水洗脫除去其它成分，再用體積濃度60％乙醇水溶液300mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)真空濃縮至干，獲得低聚原花青素2.5g，測定其吸光值(圖3)。

(2)分別對實施例1步驟(4)獲得的原花青素粗產(chǎn)品和步驟(1)經(jīng)洗脫精制后低聚原花青素進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果見圖4和圖5，紫蘇莖葉原花青素特征骨架振動主要集中在1000～1800cm^–1和800～900cm^–1區(qū)域，因粗產(chǎn)品與精產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單元相似，故其紅外光譜圖相一致。粗產(chǎn)品和精產(chǎn)品紅外光譜曲線清晰一致，故紫蘇莖葉中原花青素紅外光譜受雜質(zhì)影響較小。將紫蘇莖葉原花青素提取物與5類(A、B、C、D、E)聚原花青素紅外光譜進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)紫蘇莖葉原花青素提取物紅外譜圖與原花青素A類紅外圖譜相一致。由此可推斷出：紫蘇莖葉原花青素提取物中主要成分為原花青素A類物質(zhì)。

實施例6：紫蘇原花青素對氧化應(yīng)激損傷肺上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

(1)采用H₂O₂建立體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。具體操作：將A549細(xì)胞分為組1(正常對照組)、組2(H₂O₂氧化損傷組)、組3-組5(H₂O₂加低聚原花青素低、中、高劑量組)，低聚原花青素低、中、高劑量組為：實施例3制備的低聚原花青素用超純水溶解，配制成濃度為1mg/mL的母液，-2℃保存，使用時用超純水稀釋成終濃度分別為100、200、400μg/mL的溶液。組1(正常對照組)低聚原花青素為0μg/mL。組2(H₂O₂氧化損傷組)加入400μmol·L^-1H₂O₂培養(yǎng)12h，組3-組5給予低聚原花青素溶液100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL預(yù)培養(yǎng)24h后加入400μmol·L^-1H₂O₂，然后繼續(xù)培養(yǎng)12h。

(2)MTT法檢測細(xì)胞存活率，檢測各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活性和檢測細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期改變。

細(xì)胞存活率：

將100μL(1×10⁵個/mL)處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，棄原培養(yǎng)液，組1(正常對照組)加入100μL無血清DMEM培養(yǎng)基(低聚原花青素為0μg/mL)，組2(H₂O₂氧化損傷組)加入100μL含400μmol·L^-1H₂O₂無血清DMEM培養(yǎng)基，組3、組4、組5加入50μL含不同濃度低聚原花青素溶液(濃度分別為100、200、400μg/mL)的無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后再加入50μL 400μmol·L^-1H₂O₂，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37℃、含5％CO₂和飽和濕度的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用酶標(biāo)儀于570nm處測定吸光度(A)。A_實驗組表示各加原花青素組的吸光度，A_對照組表示原花青素濃度為0的組的吸光度。按照公式(2)計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A_實驗組/A_對照組×100％ (2)

將2mL(5×10⁴個/mL)處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，按照步驟(1)1的方法進(jìn)行分組，對各處理組進(jìn)行藥物處理。細(xì)胞分為組1(對照組)、組2(H₂O₂氧化損傷組)、組3(H₂O₂加低聚原花青素低、中、高劑量組)。在37℃、含5％CO₂和飽和濕度的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書處理細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)(SOD Assay Kit–WST，上海索來寶)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(GSH-Px Assay Kit，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、一氧化氮合酶(NOS)活性(NOS Assay Kit，長春匯力生物科技有限公司)和細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平(MDA Assay Kit，上海信裕生物科技有限公司)。

(3)結(jié)果：低聚原花青素能明顯提高H₂O₂損傷的A549細(xì)胞的存活率，減少H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，恢復(fù)血細(xì)胞增殖(見圖6)；低聚原花青素提高H₂O₂損傷的A549細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、NOS活性，降低細(xì)胞內(nèi)MDA水平，見表2。結(jié)論：低聚原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化能力及細(xì)胞保護(hù)作用，可減輕肺內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。

表2低聚原花青素對H₂O₂損傷A549細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

注：與對照組比較，*：P＜0.05；**：P＜0.01。