本發(fā)明屬于PCR檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌可引起牛羊痢疾和壞死性腸炎，并可導(dǎo)致動(dòng)物死亡。這些細(xì)菌有時(shí)單獨(dú)感染，有時(shí)混合感染，并且在臨床上很難鑒別診斷，對(duì)及時(shí)預(yù)防和治療帶來(lái)很大的困難。目前對(duì)這三種細(xì)菌病的診斷方法主要是：分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察和PCR檢測(cè)，但是目前的PCR方法一次只能檢測(cè)一種細(xì)菌，并且沒(méi)有商品化的試劑盒，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
如定量檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法，其包括以下步驟：(1)獲得患者分泌物并提取其中細(xì)菌的基因組DNA；(2)以產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)步驟(1)中獲得的DNA 進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；(3)制作CT值與所述產(chǎn)氣莢膜梭菌的濃度之間的標(biāo) 準(zhǔn)曲線，根據(jù)步驟(2)的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)患者分泌物中的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行定量。該方法具有高度的特異性、靈敏性和定量準(zhǔn)確度，可以檢出細(xì)菌或病毒 的存在，全部檢測(cè)過(guò)程在2-3小時(shí)內(nèi)可以完成；最低可檢出約10個(gè)細(xì)菌，定量誤差小于5％，特異性和試劑穩(wěn)定性等指標(biāo)符合有關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但是該方法只能檢測(cè)患者分泌物中的產(chǎn)氣莢膜梭菌，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)溶血梭菌和B型諾維氏梭菌，且該方法成本高，需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員才能完成檢測(cè)。
如一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒包括以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物：內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。該產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)效果更全面、漏檢率低。但是該試劑盒只能檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌一種細(xì)菌，不能同時(shí)檢測(cè)溶血梭菌和B型諾維氏梭菌；而且該方法容易產(chǎn)生氣溶膠，造成實(shí)驗(yàn)室基因污染，造成假陽(yáng)性，從而無(wú)法判定樣品的陰陽(yáng)性，操作方法繁瑣，試劑昂貴，不適合推廣應(yīng)用。
目前還未見(jiàn)有在同一樣品中同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的相關(guān)報(bào)道，也沒(méi)有商品化的試劑盒。因此對(duì)能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒的研究已成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒操作方便、省時(shí)省力、成本低、特異性高。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，包括以產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)的引物PrimerF1和PrimerR1，以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型諾維梭菌鞭毛蛋白基因FliA為模板設(shè)計(jì)的引物PrimerF2、PrimerR2和PrimerR3，其中所述引物的序列為：PrimerF1：SEQ ID NO.1，PrimerR1：SEQ ID NO.2，PrimerF2：SEQ ID NO.3，PrimerR2：SEQ ID NO.4，PrimerR3：SEQ ID NO.5。
更進(jìn)一步地，所述的能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒在同時(shí)測(cè)試產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌中的應(yīng)用，包括如下步驟：
步驟一，引物設(shè)計(jì)：以產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物PrimerF1和PrimerR1；分別以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)，B型諾維梭菌鞭毛蛋白基因FliA為模板設(shè)計(jì)引物PrimerF2、PrimerR2、PrimerR3；
步驟二、試劑盒組裝：將步驟一設(shè)計(jì)好的5條引物，分別用滅菌水稀釋成10μM，分別標(biāo)記為F1、F2、F3、F4和F5；將DNA聚合酶預(yù)混液標(biāo)記為試劑T；將DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000標(biāo)記為試劑M；將滅菌水標(biāo)記為試劑W，陽(yáng)性對(duì)照為產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌3種細(xì)菌DNA混合物，標(biāo)記為P；陰性對(duì)照為滅菌水標(biāo)記為N；將以上試劑全部組裝入一個(gè)紙盒中，組裝好后置于冰箱儲(chǔ)存；
步驟三，樣品處理：將動(dòng)物組織樣品或腸內(nèi)容物經(jīng)研磨或厭氧肉湯培養(yǎng)；
步驟四，樣品DNA提?。河眉?xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提?。?/p>
步驟五，PCR擴(kuò)增：用設(shè)計(jì)的5條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系：12.5μL DNA聚合酶預(yù)混液，10μM的5條引物各1μL，模板DNA3μL，加滅菌水至25μL；反應(yīng)條件為：95℃ 4 min；95℃ 50s，58℃ 45s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；之后72℃ 7 min；
步驟六，電泳分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳：取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量百分比為1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果；
步驟七，結(jié)果判定：若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為397 bp的條帶則表明樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為427 bp的條帶，則表明樣品中存在B型諾維氏梭菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物中有大小為694 bp的條帶則表明樣品中存在溶血梭菌。
更進(jìn)一步地，所述的能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒在同時(shí)測(cè)試產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌中的應(yīng)用，其中步驟二中所述DNA聚合酶預(yù)混液為500μL，所述滅菌水為500μL，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌3種細(xì)菌DNA混合物為100μL；置于冰箱的儲(chǔ)存溫度為-20℃。
更進(jìn)一步地，所述的能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒在同時(shí)測(cè)試產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌中的應(yīng)用，其中步驟三中樣品處理具體為：將動(dòng)物組織樣品或腸內(nèi)容物經(jīng)研磨或厭氧肉湯培養(yǎng)12小時(shí)。
更進(jìn)一步地，所述的能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒在同時(shí)測(cè)試產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌中的應(yīng)用，其中步驟六中所述瓊脂糖凝膠含0.50 μg 的溴化乙錠。
更進(jìn)一步地，所述的能同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒在同時(shí)測(cè)試產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌中的應(yīng)用，其中步驟六中所述電泳的條件為以80V電壓電泳20min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
第一，采用本試劑盒可同時(shí)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌3種細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)具有良好的特異性和敏感性；
第二，特異性方面：用本試劑盒檢測(cè)肉毒梭菌、衣原體、支原體、大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌的基因組擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；
第三，敏感性方面：以產(chǎn)氣莢膜梭菌為例進(jìn)行PCR檢測(cè)，當(dāng)樣品中細(xì)菌量為1.2×103 CFU/mL時(shí)即可檢測(cè)出產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因、溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)以及B型諾維梭菌鞭毛蛋白基因FliA。
附圖說(shuō)明
圖1為用本發(fā)明試劑盒中5條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后的示意圖，其中，M、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，2為樣品檢測(cè)結(jié)果；3、陽(yáng)性對(duì)照；4、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
本試劑盒包含用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌3種細(xì)菌的5條引物、PCR擴(kuò)增預(yù)混酶、滅菌水、以及產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照DNA。通過(guò)DNA分子量標(biāo)記測(cè)定擴(kuò)增片段的大小，從而確定三種細(xì)菌的存在情況。
實(shí)施例
1、引物設(shè)計(jì)：從網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/下載產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因（登錄號(hào)：L43548），以此基因?yàn)槟０澹捎肞rimer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物：PrimerF1：5′-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3′，PrimerR1：5′-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3′。
依據(jù)溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)（基因登錄號(hào)：AB058931，AB058939），B型諾維梭菌鞭毛蛋白基因FliA（基因登錄號(hào)：AB058938）設(shè)計(jì)3條引物：PrimerF2：5′-AGAATAAACAGAGCTGGAGATG-3′；PrimerR2：5′-TTATGCTAACTTTAGCTG CGTC-3′；PrimerR3：5′- CTGCTGTACCTTCTATGAACC-3′。
2、試劑盒組裝：采用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0）設(shè)計(jì)所需的5條引物，之后送生物公司化學(xué)合成，將合成的5條引物分別用滅菌水稀釋成10μM，標(biāo)記為F1、F2、F3、F4和F5；購(gòu)買商品化的GoTaq DNA聚合酶預(yù)混液1支（500μL），標(biāo)記為試劑T；購(gòu)買商品化的DNA分子量標(biāo)記DL2000，標(biāo)記為試劑M；滅菌水500μL，標(biāo)記為試劑W，陽(yáng)性對(duì)照（產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌3種細(xì)菌DNA混合物）100μL，標(biāo)記為P；陰性對(duì)照（滅菌水）標(biāo)記為N；以上試劑全部組裝入一個(gè)紙盒中，組裝好后置于-20℃冰箱儲(chǔ)存，可置于冰盒中運(yùn)輸。
3、樣品處理：動(dòng)物組織樣品或腸內(nèi)容物經(jīng)研磨或厭氧肉湯培養(yǎng)12小時(shí)后可直接用于細(xì)菌DNA提取。
4、樣品DNA提?。翰捎蒙唐坊募?xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。
5、PCR擴(kuò)增：用設(shè)計(jì)的5條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。
PCR反應(yīng)體系：12.5μL GoTaq DNA聚合酶預(yù)混液，5條引物各1μL（10μmol/L），模板DNA3μL，加滅菌水至25μL；反應(yīng)條件為：95℃ 4 min；95℃ 50s，58℃ 45s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；之后72℃ 7 min。
6.、電泳分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳：取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%質(zhì)量百分比的瓊脂糖凝膠（含0.50 μg 的溴化乙錠）中以80V的電壓電泳20min,觀察結(jié)果并拍照。
7、結(jié)果判定：若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為397 bp的條帶則表明樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為427 bp的條帶，則表明樣品中存在B型諾維氏梭菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物中有大小為694 bp的條帶則表明樣品中存在溶血梭菌。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后的圖片如圖1所示，由圖1可見(jiàn)在同一塊瓊脂糖凝膠上電泳后，當(dāng)DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、陰陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)成立時(shí)，被檢樣品1和2電泳道擴(kuò)增反應(yīng)出現(xiàn)三條帶，大小分別為397bp、427bp和694bp，判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌陽(yáng)性（+）。
作為本申請(qǐng)的延伸可以用產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血梭菌和B型諾維氏梭菌的其它基因設(shè)計(jì)引物，模仿本試劑盒的組分，組建類似的檢測(cè)試劑盒。
本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
SEQ ID NO.1 GCTAATGTTACTGCCGTTGA
SEQ ID NO.2 CCTCTGATACATCGTGTAAG
SEQ ID NO.3 CCTCTGATACATCGTGTAAG
SEQ ID NO.4 TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC
SEQ ID NO.5 CTGCTGTACCTTCTATGAACC