本發(fā)明涉及免疫磁珠的制備領(lǐng)域，具體地說是一種CD20抗體免疫磁珠及其制備方法。
背景技術(shù)：
CD20分子是B淋巴細胞上的跨膜蛋白質(zhì)，由297個氨基酸組成，屬于非糖基化磷蛋白，是B淋巴細胞表面分化抗原，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用，常被用作鑒定B細胞的標記。CD20是B淋巴細胞表面的特異性標志分子，它高表達于多數(shù)B淋巴細胞表面，在95％以上的正?；驉盒訠淋巴細胞中表達，而在造血干細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達，并且不會發(fā)生明顯的內(nèi)化和脫落，是B淋巴細胞理想的生物免疫標志物。
免疫磁珠分選法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年來興起的一種用于細胞分選的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反應性的抗體進行抗原-抗體反應，在細胞表面形成“抗原-抗體-磁珠”免疫復合物。這些結(jié)合了磁珠的細胞一旦置于強大的磁場下，就會定向移動，使免疫復合物與其他未被結(jié)合的細胞分群。當具超順磁性的磁珠脫離磁場后，磁性立即消失，從而達到陽性或陰性選擇特定細胞的目的。
將免疫磁珠分選法應用于細胞的分選是本領(lǐng)域近年來興起的技術(shù)。但是利用免疫磁珠分選法從血液復雜的環(huán)境中分選出特定的細胞，需要免疫磁珠具有特異性的生物標志物，而且穩(wěn)定性、分散性好，不能團聚。同時，免疫磁珠的粒徑不能過大，過大會壓迫細胞；免疫磁珠的粒徑也不能過小，粒徑過小磁響應性也小，容易無法達到細胞分選的效果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種CD20抗體免疫磁珠及其制備方法，本發(fā)明的CD20抗體免疫磁珠粒徑小，磁響應性好，用于B淋巴細胞捕獲，捕獲效率高，富集時間短，捕獲得到的B淋巴細胞可以進行進一步的分析，同時制備過程簡單，成本低。
在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種CD20抗體免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗體部分，所述免疫磁珠的結(jié)構(gòu)式為：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示CD20抗體，或者A表示CD20抗體，B表示磁性微球。
優(yōu)選的，所述磁性微球為核殼結(jié)構(gòu)的無機或有機高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三鐵等。最優(yōu)選的，所述磁性微球部分為二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵。
優(yōu)選的，所述CD20抗體免疫磁珠的粒徑為200～300nm。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備上述CD20抗體免疫磁珠的方法，其步驟包括：
s1.磁性納米簇的制備；
s2.氨基修飾的磁性微球的制備；
s3.肼基修飾的A部分的制備；
s4.醛基修飾的B部分的制備；
s5.免疫磁珠的制備：將步驟s3所述肼基修飾的A部分與步驟s4所述醛基修飾的B部分混合，在4～25℃下進行偶聯(lián)反應2～24小時，得到所述免疫磁珠。
在本發(fā)明的一種實施方式中，對氨基修飾的磁性微球進行醛基修飾，并且對CD20抗體進行肼基修飾。或者對氨基修飾的磁性微球進行肼基修飾，并且對CD20抗體進行醛基修飾，均可以實現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)的免疫磁珠。
進一步的，所述步驟s3中的肼基修飾的A部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或CD20抗體用摩爾當量為10～50倍的SANH進行肼基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SANH的摩爾當量為氨基修飾的磁性微球或CD20抗體的25倍。所述SANH為對-丙腙基吡啶甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(CAS：362522-50-7)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中進行反應，濃度可以根據(jù)磁性微球或CD20抗體的濃度進行調(diào)整，不影響反應結(jié)果。該反應過程可以在15～25℃室溫條件下進行，反應時間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對磁性微球的修飾反應時間16～24h，對CD20抗體的修飾反應時間2～4h。
進一步的，所述步驟s4中的醛基修飾的B部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或CD20抗體用摩爾當量為5～20倍的SFB進行醛基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SFB的摩爾當量為氨基修飾的磁性微球或CD20抗體的10倍。所述SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯(CAS：60444-78-2)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中進行反應，濃度可以根據(jù)磁性微球或CD20抗體的濃度進行調(diào)整，不影響反應結(jié)果。該反應過程可以在15～25℃室溫條件下進行，反應時間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對磁性微球的修飾反應時間16～24h，對CD20抗體的修飾反應時間2～4h。
所述步驟s1中的磁性納米簇是通過水熱法、溶劑熱法或共沉淀法制備得到，也可以采用市售商品。制備磁性納米簇的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，得到的產(chǎn)品只需要滿足具有良好的磁性，并且可以與無機或有機高分子形成核殼結(jié)構(gòu)即可。
作為優(yōu)選的，所述步驟s1中的磁性納米簇是通過如下方法制備得到：
1)在空氣中，向二價鐵鹽的水溶液中加入氨水，然后攪拌使溶液變成黑色，得到黑色Fe3O4顆粒；
2)向步驟1)中加入油酸，混合均勻后轉(zhuǎn)移至密閉的反應釜中，在60～130℃下加熱反應3～5小時，即可得到所述磁性納米簇。
進一步的，所述步驟s2中的氨基修飾的磁性微球為核殼結(jié)構(gòu)的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加優(yōu)于直接在磁性納米簇粒子表面進行氨基修飾得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法制備，均不影響本發(fā)明的結(jié)果。可以使納米簇聚集在二氧化硅內(nèi)部，形成核殼結(jié)構(gòu)，增大粒徑，并且增加磁性和穩(wěn)定性即可。優(yōu)選的，本發(fā)明采用如下方法制備氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性納米簇的溶液中加入氨水、硅烷化試劑和氨基硅烷偶聯(lián)劑，反應1～3天后得到氨基修飾的磁性微球部分；所述磁性納米簇、氨水、硅烷化試劑、氨基硅烷偶聯(lián)劑加入的質(zhì)量比為：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的質(zhì)量百分濃度為25～28％。其中，硅烷化試劑可以為正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶聯(lián)劑可以為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在選擇其他的硅烷化試劑與氨基硅烷偶聯(lián)劑時，可以對反應原料的比例進行調(diào)整，均不超出本發(fā)明的保護范圍。
優(yōu)選的，所述步驟s5中，磁性微球和CD20抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～1)。CD20抗體與磁性微球的質(zhì)量比越高越有利于磁性微球表面偶聯(lián)CD20抗體，但是考慮到CD20抗體的成本因素，本發(fā)明采用磁性微球和CD20抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～0.2)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于捕獲B細胞的試劑盒，所述試劑盒中含有上述的CD20抗體免疫磁珠。
本發(fā)明的有益效果為：
(1)將本發(fā)明的免疫磁珠用于捕獲B細胞，不僅特異性、敏感性好，而且磁響應迅速、富集時間短，捕獲效率高。避免了捕獲的B細胞損傷，B細胞可以用于進一步的分析和培養(yǎng)。
(2)本發(fā)明的免疫磁珠，其磁性微球部分和CD20抗體部分通過腙鍵結(jié)構(gòu)相連，得到的免疫磁珠在弱堿性條件下(血液中)性質(zhì)穩(wěn)定，同時粒徑小，磁響應性好，分散性好。
(3)本發(fā)明的制備方法簡單，反應條件溫和，氨基、醛基和肼基修飾的過程均可以在室溫下進行，不容易造成CD20抗體的變質(zhì)、降解等，同時避免了使用還原劑，使CD20抗體可以在低溫下與細胞孵育，保持CD20抗體和細胞的生物活性。
(4)本發(fā)明原料簡單易得，成本低，工藝步驟簡單，具有很強的實用性。
附圖說明
圖1為本發(fā)明CD20抗體免疫磁珠分選的B細胞免疫熒光圖。
具體實施方式
以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明：下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1CD20抗體免疫磁珠的制備
(1)磁性納米簇的制備：
a.在空氣中，將7g FeCl2·4H2O加入到50mL去離子水中，得到濃度為0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，攪拌20min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?/p>
b.向步驟a中加入1.1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應釜中，在110℃下加熱反應4小時，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各一次，磁分離后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性納米簇Fe3O4 1。
(2)氨基修飾的磁性微球的制備：向10mg磁性納米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應1天后進行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸緩沖液分散后得到濃度為5mmol/L的氨基修飾的磁性微球1。
(3)肼基修飾的CD20抗體的制備：將5μL SANH的DMF溶液(濃度為5mmol/L)加入到100μL CD20抗體溶液(濃度為10μmol/L)中，在室溫反應2h后，用超濾柱純化得到肼基修飾的CD20抗體(簡寫為CD20-SANH)1。
檢測CD20-SANH的濃度：通過BCA法計算修飾后的CD20-SANH的濃度為0.7mg/mL。
檢測肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測肼基修飾率。取純化后的CD20-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37℃反應1h，Nanodrop檢測348nm處的吸光值為0.15。通過348nm處的吸光值和CD20-SANH的濃度計算出CD20-SANH的肼基修飾率為2.6。
(4)醛基修飾的磁性微球的制備：將5μL的氨基修飾的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(濃度為5mmol/L)50μL中，在室溫反應20h后，進行磁分離純化，得到醛基修飾的磁性微球1。
(5)免疫磁珠的制備：將1mg步驟(4)中的醛基修飾的磁性微球與0.01mg步驟(3)中的肼基修飾的CD20抗體混合，在25℃下pH值為6.0的PBS緩沖液中混合2小時后，進行磁分離得到CD20抗體偶聯(lián)磁性微球的CD20抗體免疫磁珠。計算得到每毫克CD20抗體免疫磁珠1上，包被抗體率為83％(消耗的抗體量與加入的抗體總量的比例)。
實施例2CD20抗體免疫磁珠的敏感性檢測
培養(yǎng)Jurkat細胞(人T淋巴細胞白血病細胞，來源中國科學院細胞庫)，然后將人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的B淋巴細胞NK-92細胞(來源中國科學院細胞庫購買)懸液按比例加入到Jurkat中，使Jurkat與NK-92的比例分別為103:1、104:1、105:1、106:1。然后將免疫磁珠依次加入到上述各混合細胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘。在1分鐘內(nèi)進行磁分選并用PBS洗滌2-3次，得到用免疫磁珠捕獲并回收的NK-92細胞。并且磁分選在1分鐘內(nèi)完成，說明免疫磁珠的磁響應性好。
重復各濃度下的實驗，結(jié)果表明，所有濃度下都可以檢測到NK-92細胞，說明免疫磁珠的敏感性好。
對上述孵育后的磁珠用無鈣鎂的PBS緩沖液重懸，將洗脫得到的磁珠-細胞用PicoPure RNA Isolation Kit試劑盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取純化總RNA，采用了PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按說明書要求去除基因組DNA以及進行cDNA鏈合成。接下來涉及相應Taqman引物，進行qPCR檢測，以GAPDH為內(nèi)標比較qPCR檢測結(jié)果，在相同條件下，與NK-92細胞的qPCR檢測結(jié)果一致。說明用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲腫瘤細胞不會損傷細胞，可以用于后續(xù)細胞分析。并且說明，用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲到的細胞基本沒有PBMCs細胞，PBMCs細胞則基本不與CD20抗體免疫磁珠結(jié)合。
實施例3CD20抗體免疫磁珠正向篩選及鑒定捕獲
取健康人的外周血血液，對血液中的腫瘤細胞進行捕獲。要求受試者血常規(guī)白細胞值位于2×106～1.2×107個/mL之間，全血樣本未出現(xiàn)溶血或血塊凝結(jié)。并且受試者相關(guān)信息完整，樣本采集、保存方法規(guī)范，實驗操作規(guī)范，具體步驟如下：取不同健康人血液各3ml，加入分別加入紅細胞裂解液，按照說明書方法處理后獲得白細胞樣品。將CD20抗體免疫磁珠依次加入到上述各混合細胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘，然后在1分鐘內(nèi)進行磁分選并用PBS洗滌2-3次?；厥沾胖檎?、負向篩選的細胞，并分別進行CD19抗體染色、并在載玻片上固定、然后進行細胞核DAPI染色、封片后，用熒光顯微鏡鑒定，結(jié)果如圖1所示，顯示正向篩選的樣品細胞膜表面顯示有熒光，在熒光顯微鏡下為綠光熒光，說明正向篩選捕獲到的細胞表面基本上100％呈CD19陽性，為B細胞。而負向篩選樣品中CD19陽性率低很低，只有2％左右。考慮到B細胞表面基本上都有CD19而只有一部分B細胞表面有CD20，2％的殘留比率并不是由于CD20磁珠本身靈敏度不夠，而是負向篩選樣品中有一部分CD19+CD20-的細胞。
以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實施例原理以及權(quán)利要求的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明實施例的保護范圍。