本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，，具體涉及一個(gè)調(diào)控水稻種子休眠基因OsDOG1L3及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

種子休眠是指具有正常生活力的種子在適宜的環(huán)境條件(光照、溫度、水分、氧氣等)下不能萌發(fā)的現(xiàn)象。作物中，特別是水稻和小麥，在收獲前如果遇到高溫陰雨天氣，常常會(huì)發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。而種子休眠的強(qiáng)弱直接決定種子是否會(huì)發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象。

影響種子休眠的因素有很多，環(huán)境因素主要有溫度、濕度、光照及空氣等。溫度是影響水稻種子休眠的主要外部因素，溫度主要影響籽粒成熟過(guò)程中休眠誘導(dǎo)物的形成，在種子發(fā)育期間，高溫下形成的籽粒休眠程度低或無(wú)休眠，而低溫下形成的籽粒休眠性會(huì)增強(qiáng)。水分也是影響種子休眠性強(qiáng)弱的重要因素。隨著種子成熟度的增加，種子休眠界點(diǎn)水分會(huì)降低，一定濕度的環(huán)境下可以破除種子休眠；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)水分只會(huì)影響剛收獲種子的休眠性。種子休眠性也受到光的影響，如紅光可以促進(jìn)發(fā)芽，而遠(yuǎn)紅光和藍(lán)光對(duì)發(fā)芽起抑制作用。在二氧化碳過(guò)多，氧氣不足的情況下，水稻種子的胚芽能夠正常生長(zhǎng)，但胚根的生長(zhǎng)表現(xiàn)不正常。一般認(rèn)為，雜交稻種子在二氧化碳超過(guò)30％的情況下會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)。內(nèi)在因素主要有，后熟作用，種皮障礙，植物激素調(diào)節(jié)以及休眠相關(guān)基因的作用。干的成熟的禾谷類種子在一個(gè)特定溫度(種子收獲時(shí)的溫度)下貯存一段時(shí)間(一般為幾個(gè)月)后休眠會(huì)被打破，這就是因?yàn)楹笫熳饔玫男Ч?nèi)源激素中的脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)是調(diào)節(jié)種子發(fā)芽和休眠的主要因素。其中GA₃可以解除種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，而ABA抑制種子萌動(dòng)，誘導(dǎo)休眠。GA與ABA在種子發(fā)育過(guò)程當(dāng)中具有拮抗作用。種子休眠是由多個(gè)基因控制的，近年來(lái)通過(guò)QTLs的定位與克隆的方式分離出了一些新的種子休眠基因。DELAY OF GERMINATION 1(DOG1)是擬南芥中第一個(gè)被克隆的休眠QTL位點(diǎn)，它編碼一個(gè)未知功能的蛋白。除了這種正向遺傳學(xué)的基因克隆方式，越來(lái)越多的研究者利用反向遺傳學(xué)的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組及蛋白組數(shù)據(jù)分析來(lái)獲得所需要的基因。迄今，水稻休眠基因的定位和克隆取得了一定的進(jìn)展，但是水稻種子休眠的調(diào)控機(jī)制還不清楚，這就需要我們定位和克隆更多的休眠基因來(lái)進(jìn)一步的揭示種子休眠的機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種水稻種子休眠相關(guān)基因OsDOG1L3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，含738bp。其基因組序列與CDS序列相同。

本發(fā)明的第二個(gè)目的還提供所述水稻種子休眠相關(guān)基因OsDOG1L3的編碼的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有245氨基酸。

編碼所述蛋白的基因優(yōu)選為如下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；

3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼植物種子休眠性相關(guān)蛋白的DNA分子。

含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。

所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。

使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

所述重組表達(dá)載體可為在用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI雙酶切載體pCAMBIA1390的重組位點(diǎn)插入所述基因(OsDOG1L3)得到的重組質(zhì)粒。將含有OsDOG1L3的pCAMBIA1390命名為pCAMBIA1390-OsDOG1L3，該重組表達(dá)載體能夠過(guò)表達(dá)所述基因OsDOG1L3。

含有以上任一所述基因(OsDOG1L3)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

擴(kuò)增所述基因(OsDOG1L3)全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述的引物對(duì)優(yōu)選Primer1/Primer2、Primer3/Primer4。

本發(fā)明所述基因(OsDOG1L3)，所述蛋白，所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌中的至少一種在植物育種中的應(yīng)用。

一種培育水稻種子適度休眠性的方法，是將所述基因?qū)霟o(wú)休眠水稻品種中，得到休眠性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻；所述無(wú)休眠水稻品種的發(fā)芽率接近100％的水稻；所述休眠性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)芽率低于80％的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明所述方法優(yōu)選將所述基因通過(guò)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)休眠水稻中。

一種培育種子休眠性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是過(guò)表達(dá)目的植物中本發(fā)明所述基因，得到休眠性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的植物為攜帶所述基因的植物。

有益效果：

本發(fā)明從強(qiáng)休眠水稻N22中分離和克隆到同源的DOG1基因，并將其命名為OsDOG1L3，發(fā)明人將OsDOG1L3基因組的全長(zhǎng)cDNA連接到過(guò)表達(dá)載體啟動(dòng)的表達(dá)載體上，利用農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化水稻無(wú)休眠品種南粳35，發(fā)現(xiàn)上述基因可以使無(wú)休眠品種南粳35的休眠性增強(qiáng)。利用本基因通過(guò)植物基因工程技術(shù)獲得具有適度休眠性的品種，從而使惡劣條件下的稻米品質(zhì)和稻種質(zhì)量得到保證。

附圖說(shuō)明

圖1為水稻與擬南芥DOG1氨基酸序列比對(duì)圖。

圖2為過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1390質(zhì)粒圖譜。

圖3為轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)植株的發(fā)芽情況。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。

實(shí)施例1、水稻OsDOG1L3基因的序列分析以及克隆與載體構(gòu)建

一、水稻休眠基因的序列分析及克隆

通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)明者在水稻N22中克隆獲得了水稻的OsDOG1L3基因如SEQ ID NO.1所示。水稻的OsDOG1L3基因位于第一條染色體上。OsDOG1L3的開(kāi)放閱讀框?yàn)?38bp，編碼245aa如SEQ ID NO.2所示。

根據(jù)找到的水稻OsDOG1L3基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行克隆，克隆方法如下：

(1)DNA的提取:

①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于2.0ml Eppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GENO/GRINDER儀器上粉碎樣品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4M NaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃溫浴10min，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。

④加入100μl 5M NaCl，溫和混勻。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。

⑥加入900μl氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。

⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。

⑧棄上清液，沉淀用70％(體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用鹽酸調(diào)PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用DU800分光光度儀測(cè)定濃度(Beckman Instrument Inc.U.S.A)。

(2)OsDOG1L3基因的克隆:

OsDOG1L3引物序列：

上游引物Primer1：ATGCCGGCGTCGTACCTGCAG(SEQ ID NO.3)

下游引物Primer2：CTAGAGGCCCCGCCGGCCGCCGT(SEQ ID NO.4)

以上述提取的DNA產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

PCR反應(yīng)體系(50μl)用KOD酶擴(kuò)增(購(gòu)自TOYOBO公司)：DNA～200ng，上游引物(10pmol/ul)1.5ul，下游引物(10pmol/ul)1.5ul，2x PCR Buffer for KOD FX 25ul，dNTPs(2mM)10ul，KOD FX(1.0U/ul)1ul，ddH₂O補(bǔ)足，共50ul。

PCR反應(yīng)程序：94.0℃變性2min；98.0℃變性10s、55℃退火30s、68℃延伸1min，共循環(huán)35次；68℃延伸7min；10℃保存。PCR反應(yīng)在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR儀中進(jìn)行。

反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到目的條帶后，切膠并進(jìn)行膠回收，取上述產(chǎn)物與pEASY-T1克隆載體進(jìn)行連接，操作步驟按照全式金司的產(chǎn)品pEASY-T1說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物使用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株(購(gòu)自Tiangen公司)，在含有氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色單個(gè)菌落LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行序列測(cè)序。

二、過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

以正確的帶有OsDOG1L3基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得OsDOG1L3(N22)基因，PCR引物序列如下：

Primer3(下劃線所示的序列為Kpn I重組位點(diǎn))：

5'—TGCACTAGGTACCATGCCGGCGTCGTACC—3'(SEQ ID NO.5)

Primer4(下劃線所示的序列為Spe I重組位點(diǎn))：

5'—CGTTAACACTAGTCTAGAGGCCCCGCCGG—3'(SEQ ID NO.6)

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的編碼區(qū)起始位置和編碼區(qū)終止子位置，擴(kuò)增產(chǎn)物包含了該基因的完整編碼區(qū)，將PCR產(chǎn)物回收純化。采用HD Cloning Kit重組試劑盒(Takara公司)將PCR產(chǎn)物克隆到載體pCAMBIA1390(圖2)中。

In-Fusion重組反應(yīng)體系(10μL)：PCR產(chǎn)物10-200ng，經(jīng)Kpn I和Spe I雙酶切回收pCAMBIA1390載體50-200ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，Deionized water to 10μL。槍頭吹打混勻后將混合體系50℃反應(yīng)15min后置于冰上，取2μL反應(yīng)體系用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen公司)。將全部轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)12-16h，挑取克隆陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。

序列測(cè)定結(jié)果表明，PCR反應(yīng)獲得的片段包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，編碼245個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO.2)。將SEQ ID NO.3所示的蛋白命名為OsDOG1L3(N22)。

實(shí)施例2、過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定

一、重組農(nóng)桿菌的獲得

用電擊法將pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株(購(gòu)自美國(guó)英俊公司)，得到重組菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定。將PCR及酶切鑒定正確的重組菌株分別命名為EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)。

二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得

將EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)轉(zhuǎn)化水稻南粳35，具體方法為：

(1)28℃培養(yǎng)EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)16小時(shí)，收集菌體，并稀釋到含有100μmol/L的N6液體培養(yǎng)基(Sigma公司，C1416)中至濃度為OD₆₀₀≈0.5，獲得菌液；

(2)將培養(yǎng)至一個(gè)月的南粳35水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，Sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；

(3)將步驟(2)的愈傷接種在含有100mg/L巴龍霉素(Phyto Technology Laboratories公司)的N6固體篩選培養(yǎng)基上第一次篩選(16天)；

(4)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有100mg/L巴龍霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選，每15天繼代一次；

(5)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有50mg/L巴龍霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基上第三次篩選，每15天繼代一次；

(6)挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上分化；

得到分化成苗的T₀代陽(yáng)性植株。以南粳35為陰性對(duì)照。

四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

1、PCR分子鑒定

將步驟三獲得的T₀代陽(yáng)性植株提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用pCAMBIA1390上SEQ ID NO.2插入位點(diǎn)左邊界附近的引物Primer3和SEQ ID NO.2上的引物Primer4作為引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增(Primer3：5'—TGCACTAGGTACCATGCCGGCGTCGTACC—3'(SEQ ID NO.5)和Primer4：5'—CGTTAACACTAGTCTAGAGGCCCCGCCGG—3'(SEQ ID NO.6))，擴(kuò)增長(zhǎng)度764bp。PCR反應(yīng)體系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer5(10pmol/ul)2ul，Primer6(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，總體積20ul。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR儀上進(jìn)行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

用試劑盒(北京Tiangen公司)純化回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。(N22)植株。

2、表型鑒定

將T₀代轉(zhuǎn)EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)植株、南粳35和N22種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)站，對(duì)抽穗35天的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行收種，進(jìn)行休眠表型的鑒定。南粳35植株發(fā)芽率約為97％，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽率出現(xiàn)分離，其中Y2906-1-5的發(fā)芽率約為13％，Y2907-1-9的發(fā)芽率約為39％(圖3)。