本發(fā)明屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
中的獸醫(yī)動(dòng)物病原檢測(cè)，特別涉及一種用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其專用引物和TaqMan探針。
背景技術(shù)：
：牛病毒性腹瀉-粘膜病牛病毒性腹瀉-粘膜病(Bovineviraldiarrhea-mucosaldisease，BVD-MD)，簡(jiǎn)稱牛病毒性腹瀉或黏膜病，是由牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)引起的，主要發(fā)生于牛的一種急性、熱性傳染病，其臨診特征為黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死、腹瀉及懷孕母牛流產(chǎn)。2008年頒布的我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第96號(hào)將牛病毒性腹瀉病列入三類疫病。牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)粒子呈圓形顆粒，直徑約為50-80nm，有囊膜，表面有纖突結(jié)構(gòu)。根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞病變的情況，BVDV分為2個(gè)型，非致細(xì)胞病變型(NCP)和致細(xì)胞病變型(CP)，其基因組長(zhǎng)度分別約為12.5Kb和12.3Kb。BVDV基因組核酸為單股正鏈RNA分子，包括5’UTR區(qū)、ORF和3’NRT區(qū)三個(gè)部分。根據(jù)5’UTR區(qū)序列將BVDV分為兩種基因型，即I型(BVDV-I)和II型(BVDV-II)，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)BVDV-I型流行更為廣泛，但隨著II型BVDV病毒傳入我國(guó)，II型BVDV病毒也越來(lái)越受到更多人的關(guān)注。BVDV和豬瘟病毒(CSFV)的核苷酸序列及氨基酸序列同源性非常高，分別約為66％和85％。BVDV病毒在很多細(xì)胞培養(yǎng)物中都能繁殖，例如胎牛腎、睪丸、脾、胎羊睪丸、豬腎等細(xì)胞培養(yǎng)物，目前牛腎繼代細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用。牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的流行情況目前，牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)分布于世界各地，從20世紀(jì)八、九十年代以來(lái)，在北美州，美國(guó)、加拿大BVD-MD的感染率達(dá)到50％-85％；在歐洲、法國(guó)、德國(guó)，經(jīng)血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示BVD-MD的感染率為76％，瑞典的發(fā)病率在10％-80％之間，芬蘭肉牛的感染率不小于50％，希臘陽(yáng)性率為1.3％-14％，立陶宛陽(yáng)性率為70％-100％，瑞士和波蘭的平均陽(yáng)性率分別為12.5％和86％；在南美洲，巴西、委內(nèi)瑞拉、秘魯、新西蘭及澳大利亞BVD-MD的陽(yáng)性率分別為15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。我國(guó)于1980年首次發(fā)現(xiàn)BVDV，之后在全國(guó)的20多個(gè)省、市都陸續(xù)檢測(cè)到了BVDV。菅復(fù)春等從河南省采集了576份樣品，包括從5個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)采了395份血清樣品和6個(gè)奶牛場(chǎng)采了181份牛奶樣品，對(duì)這576份樣品進(jìn)行BVDV抗體的檢測(cè)，結(jié)果顯示，肉牛血清樣品和奶牛牛奶樣品的平均BVDV陽(yáng)性率分別為31.39％和58.60％(河南牛病毒性腹瀉粘膜病流行病學(xué)調(diào)查，菅復(fù)春等，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012,48(5)：3-6)。2006-2008年之間，楊得勝等花費(fèi)3年時(shí)間對(duì)福建省的9個(gè)地區(qū)的56個(gè)散養(yǎng)戶和15個(gè)大型牛場(chǎng)的牛進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果BVDV平均陽(yáng)性率高達(dá)93.1％(福建省牛病毒性腹瀉病的血清學(xué)調(diào)查，楊得勝等，中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008,25(12)：36-37)。這些研究表明，BVDV檢測(cè)不僅對(duì)判斷奶牛是否患病有重要意義，還是奶牛產(chǎn)奶安全性的重要保障。牛病毒性腹瀉-粘膜病的預(yù)防因牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)的廣泛流行，接種疫苗是預(yù)防該病發(fā)生的有效手段，當(dāng)前生產(chǎn)上使用的疫苗主要是用BVDV研究毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)制作而成的弱毒疫苗或滅活疫苗。實(shí)踐證明，BVDV滅活疫苗以及弱毒疫苗可以有效保護(hù)同源或者抗原差異較小的毒株，但對(duì)不同抗原性的BVDV毒株，則無(wú)法完全保護(hù)。Meyers等評(píng)估了BVDVI型滅活疫苗對(duì)BVDVII型感染的免疫效果，結(jié)果BVDV滅活苗只能在一定程度上交叉保護(hù)異源亞型BVDV感染(MeyersG,TantzN,DuboviEJ,Dubovi,Heinz-JürgenT.1991.ViralcytopathogenicitycorrelatedwithintegrationofUbiquitin-codingsequences[J].Virol:180:602～616)。此外，由于BVDV弱毒疫苗存在引發(fā)子宮感染、免疫抑制及外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，BVDV弱毒疫苗的使用仍存在爭(zhēng)議。當(dāng)然，不可否認(rèn)BVDV弱毒疫苗在一定程度上還是安全的。牛病毒性腹瀉-粘膜病的診斷普遍存在的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)，以及復(fù)雜的致病機(jī)理，造成了牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)的防治困難。在我國(guó)BVD-MD病例通常不表現(xiàn)出該病特異性臨床癥狀，大多數(shù)是隱性感染，如持續(xù)感染、免疫耐受等。而隱性感染在牧場(chǎng)中通常不被重視，因此并沒(méi)有得到足夠的監(jiān)控。使用疫苗又存在著效果不理想、安全性較差的問(wèn)題，導(dǎo)致BVD-MD在我國(guó)日趨流行。BVDV檢測(cè)目前，針對(duì)BVDV病毒的檢測(cè)，業(yè)內(nèi)普遍采用的方法有普通PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)和RPA檢測(cè)技術(shù)，其問(wèn)題在于普通PCR檢測(cè)技術(shù)因只采用一對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)目的序列的適應(yīng)性強(qiáng)，導(dǎo)致核酸序列同源性高的病毒也出現(xiàn)特異性條帶，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性，而RPA檢測(cè)技術(shù)敏感性要低于熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，如RPA專利文獻(xiàn)CN201510292386.2的檢測(cè)敏感性僅為2TCID50，而定量PCR專利文獻(xiàn)CN201410658803.6的檢測(cè)敏感性高至0.32TCID50，但是因不同熒光定量PCR方法設(shè)計(jì)的引物和探針序列的位點(diǎn)不同，在進(jìn)行BVDV病毒檢測(cè)時(shí)，其敏感性也不近相同，如海日汗“鑒別GSFV與BVDV1雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立”文獻(xiàn)中檢測(cè)病毒敏感性僅為102copies/uL，并且該方法的建立只針對(duì)I性BVDV病毒而不涉及II型BVDV。由于I型和II型BVDV病毒的核苷酸序列差異比較大，尋找一個(gè)好的位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行I型和II型BVDV的檢測(cè)非常困難，盡管專利文獻(xiàn)CN201410658803.6建立檢測(cè)方法的重復(fù)性好，循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差最高僅為0.6，但因該專利采用的BVDV毒株為C24V毒株，該毒株屬于I型BVDV，該文獻(xiàn)中未涉及到II型BVDV毒株，該方法是否能夠檢測(cè)II性BVDV毒株還需要進(jìn)一步確認(rèn)。還有，BVDV檢測(cè)中還面臨著豬瘟病毒(CSFV)的干擾，因豬瘟病毒(CSFV)和BVDV是同一個(gè)屬的成員，同源性高，具有很強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)以及常規(guī)PCR技術(shù)都存在一定的交叉反應(yīng)，很難將兩者徹底區(qū)分，因此BVDV檢測(cè)中存在假陽(yáng)性。相關(guān)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出的，該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析(HeidCA,StevensJ,LivakKJ,WilliamsPM.RealtimequantitativePCR.GenomeRes.1996Oct；6(10):986-94.)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種對(duì)病毒基因組進(jìn)行檢測(cè)的相對(duì)定量技術(shù)，與普通PCR技術(shù)相比，增加了一個(gè)兩端帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以利用多種熒光基團(tuán)實(shí)現(xiàn)多種基因的檢測(cè)，并可利用中間的寡核苷酸探針實(shí)現(xiàn)相似性較高基因的鑒別。目前，該方法已廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量、以及動(dòng)物病原體的檢測(cè)、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定等領(lǐng)域(JozefczukJ,AdjayeJ.Quantitativereal-timePCR-basedanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.2011；500:99-109.)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針，并實(shí)現(xiàn)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)與豬瘟病毒(CSFV)的鑒別。本發(fā)明所提供的用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物為：上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。由上述引物衍生的引物序列也屬于本
發(fā)明內(nèi)容。所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一至十個(gè)堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。本發(fā)明所提供的用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的TaqMan探針為：TaqMan探針(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：3所示；所述探針為經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的，其5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。由上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本
發(fā)明內(nèi)容。所述衍生序列是指在SEQIDNO：3的基礎(chǔ)上，在序列的5’端和/或3’端再添加、減少一個(gè)或多個(gè)堿基得到的序列。所述用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的TaqMan探針(BVDV-P)的5’端報(bào)告熒光基團(tuán)為ROX，3’端熒光淬滅基團(tuán)為BHQ2。為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述TaqMan探針的3’端已經(jīng)磷酸化處理。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明所提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括上述用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針。具體來(lái)講，所述試劑盒包括以下用于25μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的試劑：實(shí)時(shí)熒光定量一步法PCR反應(yīng)液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。為方便檢測(cè)，所述試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒I型和II型基因組RNA，所述陰性對(duì)照為不含I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的反應(yīng)體系，如H2O(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述引物、探針或試劑盒在對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行非疾病診斷目的的檢測(cè)、或在對(duì)BVDV與豬瘟病毒(CSFV)進(jìn)行非疾病診斷目的的鑒別的應(yīng)用。該應(yīng)用之一為一種用上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行非疾病診斷目的的定性、定量檢測(cè)的方法。該實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)包括以下步驟：1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：選取I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR區(qū)域基因的特異性保守序列(I型病毒自5’端第131-606位堿基)作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建序列，設(shè)計(jì)對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品引物，構(gòu)建攜帶I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR區(qū)域檢測(cè)基因的重組質(zhì)粒pCRTOPO-BVDVstandardplasmid，對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品，將攜帶I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR檢測(cè)基因的重組質(zhì)粒pCRTOPO-BVDVstandardplasmid轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別10倍梯度稀釋成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷貝(copies)/μL，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在上述引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)提取待測(cè)樣品的基因組RNA，以提取的基因組RNA為模板，在上述引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；3)用得到的CT值或熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的定性檢測(cè)，出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線表明待測(cè)樣品中含有I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)，再根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。應(yīng)用之二為一種牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)與豬瘟病毒(CSFV)的鑒別，在上述步驟后還包括：4)結(jié)果判定：本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法只對(duì)BVDV樣品有擴(kuò)增曲線而對(duì)CSFV樣品無(wú)擴(kuò)增曲線，本發(fā)明充分利用兩者基因序列的差異，并利用探針序列差異2個(gè)堿基之上無(wú)法擴(kuò)增的原理，篩選出三處較好的位點(diǎn)(自5’端192、193、206位點(diǎn))，用BVDV-F、BVDV-R和BVDV-P可同時(shí)擴(kuò)增I型和II型BVDV，PCR擴(kuò)增若出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的“S”型曲線可以確認(rèn)其為I型和II型BVDV病毒，因與CSFV序列具有3個(gè)堿基的差異無(wú)法擴(kuò)增CSFV序列(未出現(xiàn)“S”型曲線)，從而實(shí)現(xiàn)鑒別牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)與豬瘟病毒(CSFV)的目的。具體判定方法：35個(gè)循環(huán)內(nèi)若出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，則確認(rèn)為BVDV陽(yáng)性(樣品中含有I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，38個(gè)循環(huán)以上未出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，則確認(rèn)為BVDV陰性(樣品中不含有I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，35-38個(gè)循環(huán)之間判定為可疑，需重檢。在上述方法中，所述步驟2)中的待測(cè)樣品可以為采自胎?；驙倥Ｓ糜谝呙缟a(chǎn)的原料血清、疫苗半成品，也可以為奶牛所產(chǎn)牛奶，對(duì)其檢測(cè)用于非診斷目的。通過(guò)對(duì)此類待測(cè)樣品中BVDV病毒的定量檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)對(duì)疫苗原料及半成品等的監(jiān)控，并為后續(xù)處置提供客觀數(shù)據(jù)。所述步驟1)和步驟2)中的25μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系可包括：模板2μL，實(shí)時(shí)熒光定量一步法PCR反應(yīng)液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。引物稀釋為20ng/μL，反應(yīng)體系中最終加量為10ng。TaqMan探針稀釋為10ng/μL，反應(yīng)體系中最終加量為10ng。所述步驟1)和步驟2)中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件可為：先52℃15min，95℃2min；然后94℃5s，58℃30s，45個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其專用引物、TaqMan探針。本發(fā)明能對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒實(shí)施快速檢測(cè)，可為疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控和合理化配苗(如評(píng)估配制疫苗抗原的準(zhǔn)確含量，為疫苗抗原含量提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ))提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和合理性，對(duì)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒I型和II型疫苗的生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用；還可以對(duì)奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，并為后續(xù)處置提供客觀數(shù)據(jù)，以保證牛奶及其制品的安全性。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，不僅可用于I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒和豬瘟病毒的鑒別，更可以實(shí)現(xiàn)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的準(zhǔn)確定量，將在I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的檢測(cè)(包括臨床診斷中臨床病料或培養(yǎng)物中I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的準(zhǔn)確檢測(cè))及疫苗生產(chǎn)和牛奶制品生產(chǎn)(非診斷目的的應(yīng)用)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的技術(shù)路線圖2為本發(fā)明用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖3為本發(fā)明用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4為I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果圖5為I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖6為I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(W/V，單位g/100mL)百分比濃度或體積/體積(V/V，單位mL/100mL)百分比濃度。實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。所用引物由北京華大基因有限公司合成；所用探針由TAKARA基因公司合成。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。生物基因組是直接反應(yīng)生物基本信息的一個(gè)最客觀的指標(biāo)，不同的病毒所含有的基因組信息不同，通過(guò)基因組信息可將不同的病毒分類至不同的族群，利用基因組堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，可實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)基因序列的大量擴(kuò)增，從而通過(guò)一定的方法使得肉眼可見。如圖1所示，本發(fā)明基于以上基本原理設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一條寡核苷酸探針，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，建立了一種特異性檢測(cè)I型和II型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。實(shí)施例1、設(shè)計(jì)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的引物和TaqMan探針由于I型和II型BVDV病毒的核苷酸序列差異比較大，尋找一個(gè)好的位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行I型和II型BVDV的檢測(cè)是關(guān)鍵。從NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)檢索獲得牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型的5’UTR區(qū)域基因(BVDVI型GenBank號(hào)：JN704144，其全基因序列如序列表中SEDIDNO：4所示，BVDVII型GenBank號(hào)：FJ431191.1，其5’端基因序列如序列表中SEDIDNO：5所示)的序列，用DNAMan軟件進(jìn)行比對(duì)后，根據(jù)引物、TaqMan探針設(shè)計(jì)原則，選取牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型的5’UTR區(qū)域基因(選擇該基因是因?yàn)锽VDV不同毒株之間相對(duì)保守)并將優(yōu)選的特異性保守序列作為檢測(cè)序列(該檢測(cè)序列為I型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒自5’端第131-606位堿基，序列表中SEDIDNO：6)，用PrimerExpress6.0軟件設(shè)計(jì)對(duì)牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物及TaqMan探針，序列如下：BVDV-F(上游引物)：5’-AGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGA-3’(序列表中SEDIDNO：1)BVDV-R(下游引物)：5’-GCCCTCGTCCACGTGGC/TATCTCG-3’(序列表中SEDIDNO：2)BVDV-P(TaqMan熒光探針)：5’-ROX-AGTACAGGGTAGTCGTCAA/GTGGTTCG-BHQ2-3’(序列表中SEDIDNO：3)。BVDV-P的報(bào)告熒光基團(tuán)為ROX，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ2。為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3’端已經(jīng)磷酸化處理。實(shí)施例2、用本發(fā)明的引物及TaqMan探針對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)一、提取待測(cè)樣品的基因組RNA分別對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物(用于獲得標(biāo)準(zhǔn)品和獲得陽(yáng)性對(duì)照)以及待測(cè)樣品提取基因組RNA，具體方法包括以下步驟(AxyprepTMBodyFluidViralDNA/RNAMiniprepKit，AXYGEN公司)：(1)AXYGEN試劑盒準(zhǔn)備：按試劑盒說(shuō)明書，預(yù)先配置含1％冰乙酸的異丙醇和在試劑BufferW1A和BufferW2中添加指定濃度的無(wú)水乙醇。(2)在1.5mL離心管中加入200uL的待檢樣品，并加入200uLBufferV-L，漩渦震蕩混勻后，靜置5min.(3)在步驟(2)的1.5mL樣品及試劑混合離心管中加75uLBufferV-N，漩渦震蕩混勻，12000g離心5min。(4)將上清轉(zhuǎn)移至2mL離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，加300uL異丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均勻。(5)將制備管置于2mL離心管中(試劑盒內(nèi)提供)中，取步驟(4)的混合液移入制備管中，6000g離心1min。(6)棄濾液，將制備管置回至2mL離心管中，加500uLBufferW1A，室溫靜置1min。12000g離心1min。(7)棄濾液，將制備管置回至2mL離心管中，加800uLBufferW2，12000g離心1min。(8)將制備管置回到2mL離心管中，12000g離心1min。(9)將制備管置于潔凈的1.5mL離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備管膜中央加40uL無(wú)酶水，室溫靜置1min。12000g離心1min洗脫RNA。從待測(cè)樣品中提取的RNA作為檢測(cè)樣；從I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)中提取的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照樣；按照下述二的方法將從I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)中提取的RNA制備得到標(biāo)準(zhǔn)品。二、I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1、PCR擴(kuò)增I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒PCR擴(kuò)增引物外圍的的5’UTR區(qū)域基因?qū)Σ襟E一提取的來(lái)自I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的基因組RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR區(qū)域基因的目的片段，25μL反應(yīng)體系如下：表1I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒5’UTR區(qū)域基因的PCR擴(kuò)增體系2、標(biāo)準(zhǔn)品制備將純化回收的I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR區(qū)域含檢測(cè)基因的目的片段克隆至pCRTOPO載體(購(gòu)自Invitrogen公司)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建知否成功。測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的攜帶I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR區(qū)域基因的重組質(zhì)粒，命名為pCRTOPO-BVDVstandardplasmid，對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒采用TAKARA的T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，制備得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立對(duì)測(cè)序正確的攜帶I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR基因的重組質(zhì)粒pCRTOPO-BVDVstandardplasmid轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，用Nanodrop測(cè)定濃度，并計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，按照10倍梯度將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系(25μL)如下：表2I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的5’UTR基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑名稱體積(μL)2×OneStepRT-PCRBufferIII(購(gòu)自TaKaRa公司)12.5TaKaRaExTaqHS(購(gòu)自TakaRa公司)0.5PrimeScriptRTEnzymeMixII(購(gòu)自TakaRa公司)0.5BVDV-F(20μM)0.5BVDV-R(20μM)0.5BVDV-P(10μM)1.0DNA模板2.0RNA-freeH2O7.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為(定量PCR儀，型號(hào)CFX96，購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè))：反轉(zhuǎn)錄條件：52℃15min，95℃2min；PCR擴(kuò)增條件：94℃5s，58℃30s，45個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線為平滑的“S”形曲線(陽(yáng)性)，圖2中八組線條從左向右對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL。檢測(cè)結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，相關(guān)系數(shù)分別為R2＝1.000，誤差較小，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性方程為：y＝-3.295x+42.139。4、對(duì)疫苗原料血清中I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)本實(shí)施例用本發(fā)明建立的I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)所收集的12份疫苗原料血清(待測(cè)樣品)提取的RNA(檢測(cè)樣)進(jìn)行檢測(cè)，以滅活的I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物提取的RNA為陽(yáng)性對(duì)照樣，以無(wú)酶水為陰性對(duì)照樣，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)樣本中I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒進(jìn)行判定，并對(duì)病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。結(jié)果如表3所示，所檢測(cè)的12份檢測(cè)樣中有4份為陰性(沒(méi)有I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒)，8份血清判定為陽(yáng)性(存在I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒)，循環(huán)數(shù)均小于35，且其拷貝數(shù)大于101拷貝，不可以用作I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒疫苗生產(chǎn)的原料(原材料中不允許含有BVDV病毒)?？梢娛褂帽景l(fā)明方法能監(jiān)控疫苗原料血清中的病毒水平，有效篩選出合格原料。表3樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果樣本定量結(jié)果(循環(huán)數(shù))定量結(jié)果(copies/μL)判定結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照26.185.17E+04成立血清樣品132.292.56E+02陽(yáng)性血清樣品200陰性血清樣品333.648.90E+01陽(yáng)性血清樣品431.544.65E+02陽(yáng)性血清樣品500陰性血清樣品632.851.65E+02陽(yáng)性血清樣品734.991.52E+01陽(yáng)性血清樣品834.973.11E+01陽(yáng)性血清樣品934.943.19E+01陽(yáng)性血清樣品1039.548.45E-01陰性血清樣品1128.107.01E+03陽(yáng)性血清樣品1200陰性陰性對(duì)照00成立實(shí)施例3、特異性實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2所述方法利用DNA/RNA同時(shí)進(jìn)行提取的AxyGen試劑盒對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV)提取RNA，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、鼻氣管炎病毒(IBRV)提取DNA，同時(shí)以滅活的I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物提取的RNA為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)酶水為陰性對(duì)照，在本發(fā)明引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的特異性。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，僅有BVDV出現(xiàn)特定的“S”型擴(kuò)增曲線，結(jié)果陽(yáng)性，其它樣品未出現(xiàn)特定的“S”型擴(kuò)增曲線，結(jié)果陰性。檢測(cè)結(jié)果表明用本發(fā)明的方法可特異性地檢測(cè)出I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒。實(shí)施例4、靈敏度實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2所述，將攜帶牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型的5’UTR基因的pCRTOPO-BVDVstandardplasmid標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物按照10倍梯度分別稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在本發(fā)明引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的靈敏度。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，顯示本發(fā)明I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可以檢測(cè)至1×101copies/μL，與其它熒光定量PCR檢測(cè)方法(海日汗，鑒別GSFV與BVDV1雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文)相比，靈敏度要高10倍。實(shí)施例5、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2所述，將稀釋好的定量方法標(biāo)準(zhǔn)品的8個(gè)梯度作為模板，每個(gè)梯度進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，在本發(fā)明引物和TaqMan探針的指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。檢測(cè)結(jié)果如圖6和表4所示，從圖中可見每一個(gè)濃度梯度的擴(kuò)增曲線較聚攏，循環(huán)數(shù)無(wú)明顯差距，表明本發(fā)明I型和II型牛病毒性腹瀉病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性較好，循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差相差最高僅為0.59，與其它熒光定量(CN201410658803.6)PCR檢測(cè)方法最高標(biāo)準(zhǔn)偏差0.6的重復(fù)性相當(dāng)。表4牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型的5’UTR基因的實(shí)時(shí)熒光定量重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果樣品信息重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)品循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)1.00E+0813.4313.3813.360.031.00E+0716.7516.7816.550.131.00E+0619.9520.2020.190.141.00E+0523.2423.4123.550.161.00E+0426.6626.8326.750.081.00E+0329.9129.8229.840.051.00E+0232.8532.7132.440.211.00E+01036.5437.370.59實(shí)施例6、檢測(cè)牛病毒性腹瀉粘膜病病毒I型和II型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒基于實(shí)施例1和2，本發(fā)明所提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括所述用于對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物(BVDV-F和BVDV-R)和TaqMan探針(BVDV-P)。具體來(lái)講，該試劑盒包括以下用于25μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的試劑：實(shí)時(shí)熒光定量一步法PCR反應(yīng)液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(購(gòu)于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。為方便檢測(cè)，試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒I型和II型基因組RNA，所述陰性對(duì)照為不含牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒I型和II型的反應(yīng)體系，如H2O(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等)。試劑盒中各試劑的使用可參考實(shí)施例2的內(nèi)容。實(shí)施例7、疫苗生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)疫苗半成品中抗原的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)本實(shí)施例對(duì)BVDV疫苗生產(chǎn)中半成品樣品中疫苗抗原I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法與實(shí)施例2相同，待檢樣品為BVDV疫苗半成品1-14號(hào)。檢測(cè)結(jié)果如表5：表514份BVDV半成品樣品檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)循環(huán)數(shù)拷貝數(shù)樣品編號(hào)循環(huán)數(shù)拷貝數(shù)疫苗樣品122.601.06E+06疫苗樣品220.085.01E+06疫苗樣品323.385.89E+05疫苗樣品422.071.09E+06疫苗樣品521.572.33E+06疫苗樣品619.537.65E+06疫苗樣品730.462.79E+03疫苗樣品831.448.28E+02疫苗樣品921.063.42E+06疫苗樣品1020.762.98E+06疫苗樣品1120.794.17E+06疫苗樣品1218.511.67E+07疫苗樣品1328.809.80E+03疫苗樣品1419.816.18E+06依據(jù)該定量檢測(cè)結(jié)果，拷貝數(shù)達(dá)到105的半成品苗可進(jìn)行成品苗的配制，而拷貝數(shù)低的7、8、13號(hào)樣品病毒含量不足，不能進(jìn)行成品苗的配制。實(shí)施例8、奶牛產(chǎn)奶中對(duì)I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)本實(shí)施例對(duì)奶牛所產(chǎn)奶樣品中I型和II型牛病毒性腹瀉粘膜病病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法與實(shí)施例2相同，待檢樣品為奶牛場(chǎng)產(chǎn)出奶。檢測(cè)結(jié)果如表6：表610份牛奶樣品的BVDV病毒檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)循環(huán)數(shù)拷貝數(shù)樣品編號(hào)循環(huán)數(shù)拷貝數(shù)奶樣132.185.04E+02奶樣200奶樣333.831.40E+02奶樣434.448.74E+01奶樣500奶樣600奶樣700奶樣800奶樣900奶樣1040.052.92E+00依據(jù)該定量檢測(cè)結(jié)果，10份牛奶樣品中3份樣品為BVDV檢測(cè)陽(yáng)性，分別為1,3,和4號(hào)，剩余7份均為陰性(循環(huán)數(shù)大于38為陰性，故樣品10也判為陰性)。依據(jù)該檢測(cè)，針對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)出奶需做進(jìn)一步處理，并可據(jù)此建立追溯檔案。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3