本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及甘薯耐逆相關(guān)蛋白IbFBA2、編碼基因、重組載體與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是保障糧食安全的有效途徑。隨著氣候等全球生態(tài)的日益惡化，干旱、鹽漬等極端環(huán)境常常對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)造成重大損害。脫落酸(absicsic acid，ABA)是一種重要的植物激素，在植物的正常新陳代謝及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與多種信號(hào)調(diào)控途徑。脫落酸也被稱(chēng)為“逆境植物激素”，在抵御外界環(huán)境脅迫(包括干旱、低溫、鹽漬、滲透等非生物脅迫和病蟲(chóng)害等生物脅迫)過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。因此，認(rèn)識(shí)植物響應(yīng)ABA處理的分子機(jī)制，進(jìn)而通過(guò)遺傳改良的方法調(diào)控植物的耐逆性，已成為當(dāng)前分子生物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)家們研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，挖掘植物響應(yīng)ABA處理相關(guān)功能基因，對(duì)培育耐逆穩(wěn)產(chǎn)作物新品種具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供與甘薯耐逆相關(guān)蛋白IbFBA2。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的IbFBA2蛋白，來(lái)源于甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam]，為如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)：

(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列由398個(gè)氨基酸殘基組成。

上述蛋白質(zhì)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述IbFBA2蛋白的基因。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的IbFBA2蛋白的編碼基因，是如下(1)-(4)中任何一種DNA分子：

(1)SEQ ID NO：1自5’末端起第97位至第1293位核苷酸所示的DNA分子；

(2)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA分子雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；

(4)與(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。

所述嚴(yán)格條件為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列SEQ ID NO：1的長(zhǎng)度為1617bp，其開(kāi)發(fā)閱讀框(ORF)為來(lái)自5’末端第97位至第1293位堿基，其編碼氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述IbFBA2蛋白的編碼基因的重組載體。

本發(fā)明提供的重組載體為將SEQ ID NO：1自5’端第28位至第1584位核苷酸所示的DNA分子插入到pGWB12的兩個(gè)attR位點(diǎn)之間得到的重組載體。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述IbFBA2蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述耐逆性為ABA脅迫的耐性；所述植物為雙子葉植物，所述雙子葉植物可為擬南芥(Arabidopsis thaliana)；所述調(diào)控植物耐逆性為調(diào)控植物響應(yīng)ABA脅迫，所述調(diào)控植物響應(yīng)ABA脅迫為控制植物在含20mmol ABA的1/2MS培養(yǎng)基上根的長(zhǎng)勢(shì)；所述根的長(zhǎng)勢(shì)為統(tǒng)計(jì)植物根的長(zhǎng)度及根的數(shù)量體現(xiàn)。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述IbFBA2蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的重組載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。具體的，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下性狀：根的長(zhǎng)度較對(duì)照更長(zhǎng)、根的數(shù)量較對(duì)照更多；所述植物為擬南芥。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種培育響應(yīng)ABA處理的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼上述IbFBA2蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物比目的植物更加耐受逆境脅迫。

上述方法中，所述編碼上述IbFBA2蛋白的DNA分子是通過(guò)上述的重組載體導(dǎo)入目的植物中。

上述方法中，所述目的植物為野生型擬南芥(Col_0)。

本發(fā)明提供了一種IbFBA2蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧蛿M南芥中，得到了轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥植株，結(jié)果證明IbFBA2能夠促使目的植物響應(yīng)ABA處理，增加耐逆性，根的長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于對(duì)照，根的數(shù)量顯著多于對(duì)照。說(shuō)明IbFBA2蛋白及其編碼基因在植物響應(yīng)ABA處理過(guò)程中起著重要的作用。本發(fā)明提供的IbFBA2蛋白及其編碼基因在提高植物耐逆性方面具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥植株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2為轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥響應(yīng)ABA處理的表型結(jié)果圖；

圖3為轉(zhuǎn)IbFBA2基因擬南芥在不同ABA濃度下根長(zhǎng)對(duì)比圖；

圖4為轉(zhuǎn)IbFBA2基因擬南芥在不同ABA濃度下根數(shù)量對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

下述實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1與甘薯響應(yīng)ABA處理相關(guān)蛋白IbFBA2及其編碼基因的獲得

實(shí)驗(yàn)材料：將甘薯品種徐781薯塊(由江蘇徐州甘薯研究中心提供)在苗床催芽，待生長(zhǎng)約30天后取1-2片新鮮葉片，液氮速凍，-80℃保存。

1、葉片總RNA提取與純化

RNA提取所用溶液、器皿等均經(jīng)過(guò)DEPC水的特殊處理，其操作嚴(yán)格按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》(2005-3-1，J.薩姆布魯克等，科學(xué)出版社)有關(guān)RNA操作的要求進(jìn)行，嚴(yán)防RNase污染。

采用上海捷瑞公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒(動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)，產(chǎn)品目錄為GK3016)進(jìn)行RNA的提取，具體步驟如下：

1)在液氮中將樣品研磨成粉末，轉(zhuǎn)移50.0mg至1.5ml RNase-Free的離心管中，并加1.0ml RnaEX(Trizol)；

2)渦旋振蕩30sec，室溫靜置5min，以充分裂解樣品；

3)于通風(fēng)廚中加入200.0μl氯仿，渦旋振蕩30sec，室溫靜置5min；

4)臺(tái)式離心機(jī)上，12000rpm，4℃離心10min，使溶液充分分層；

5)直接吸取約500.0μl的上清至離心柱中，加入200.0μl的無(wú)水乙醇，并充分混勻，室溫靜置2min(可能會(huì)有絮狀沉淀產(chǎn)生)；

6)常溫條件下，8000rpm離心1min；

7)小心取出柱子，倒掉濾液，并將柱子放回收集柱中，加入600.0μl buffer RWA，8000rpm，室溫離心30sec，倒掉濾液；

8)重復(fù)7的步驟；

9)倒掉濾液，將柱子放回收集管，12000rpm離心1min；

10)小心取出柱子，放入新的RNase-Free的1.5ml離心管中，在柱膜中央加入50.0μl的DEPC-H2O，60℃下放置2min；

11)12000rpm離心1min，收集管內(nèi)的溶液即為RNA樣品，可立即使用或-80℃保存。

取6μl RNA用于電泳檢測(cè)，取2μl RNA用于濃度測(cè)定，剩余的RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。用紫外分光光度?jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量(OD₂₆₀)和純度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)；并用1.2％變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

2、cDNA第一鏈的合成

將提取的總RNA，通過(guò)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，產(chǎn)品目錄號(hào)為M1701)反轉(zhuǎn)錄成First-strand cDNA，具體步驟如下：

1)取總RNA 2.0μg于PCR管中，加入2.9μl的Oligo(dT)18(0.3μg/μl)，用RNase-Free H₂O補(bǔ)足至15.0μl，混勻離心管，并短暫離心；

2)利用PCR儀控溫，加熱離心管70℃，5min，迅速置于冰上冷卻2min；

3)然后加入以下試劑：5.0μl M-MLV 5×Reaction Buffer，1.2μl dNTP mix(10mM)，0.6μl RNase Inhibitor(40U/μl)，1.1μl M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200.0U/μl)，加RNase-Free H₂O定容至總體積為25.0μl；

4)混勻后輕微離心，在PCR儀中42℃孵育60min，即可得First-strand cDNA；

5)取4.0μl至0.2ml離心管中，并稀釋10倍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或放置-20℃保存。

3、IbFBA2蛋白的cDNA編碼序列克隆

根據(jù)甘薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，通過(guò)同源序列比對(duì)找到IbFBA2蛋白的cDNA序列，并設(shè)計(jì)正向引物1和反向引物2進(jìn)行IbFBA2蛋白cDNA編碼序列克隆。引物序列如下：

引物1：5’–GAGGAGATAAGATCGAATAGTAAAA-3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’–GGAATACAAGATAAACCATAACTGA-3’(SEQ ID NO：4)

以步驟2中準(zhǔn)備好的cDNA為模板，用正向引物1和反向引物2進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系如下：10.0μl 5×PrimeSTAR GXLbuffer，4.0μl dNTPs(2.5mM)，1.0μl PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(1.25U/μl)(購(gòu)自大連TAKARA公司，產(chǎn)品目錄為R050Q)，100ng cDNA，1.0μl正、反向引物(10.0mM)，ddH₂O補(bǔ)充至終體積50.0μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃3min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min30sec，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，1個(gè)循環(huán)；4℃保存，反應(yīng)是在Eppendorf(Mastercycler Nexus)PCR儀上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物在水平電泳槽上1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1557bp長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。

經(jīng)過(guò)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸，該序列所示的基因的編碼區(qū)為序列表中SEQ ID NO：1自5’端第97–1293位核苷酸；序列表中SEQ ID NO：1由1617個(gè)堿基組成；該基因編碼的蛋白命名為IbFBA2，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO：2；序列表中SEQ ID NO：2由398個(gè)氨基酸殘基組成。

實(shí)施例2IbFBA2蛋白在提高植物ABA脅迫耐性中的應(yīng)用

1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)甘薯IbFBA2蛋白cDNA的編碼序列和構(gòu)建載體用的Gateway pCR8/GW/TOPO TA Cloning kit(Invitrogen,產(chǎn)品目錄號(hào)為45-0642)技術(shù)，將實(shí)施例1得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并與pCR8/GW/TOPO載體混合，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CD501)中，涂到含有大觀(guān)霉素(Spe)抗性的固體LB平板培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜待菌落長(zhǎng)出，挑選單克隆作菌落用正向引物1和反向引物2進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下：10.0μl康為2×Taq mix(購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CW0716A)，1.0μl單克隆菌落稀釋液，1.0μl正向引物(序列表中SEQ ID NO：3)、反向引物(序列表中SEQ ID NO：4)(10.0mM)，ddH₂O補(bǔ)充至終體積20.0μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，1個(gè)循環(huán)；4℃保存，反應(yīng)是在Eppendorf(Mastercycler Nexus)PCR儀上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物在水平電泳槽上1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。挑選PCR檢測(cè)有條帶且條帶很亮對(duì)應(yīng)的單克隆送上海生工測(cè)序，確定片段插入的方向以及片段的序列無(wú)變異。

將測(cè)序無(wú)誤的載體命名為pCR8/GW/TOPO::IbFBA2，將載體pCR8/GW/TOPO::IbFBA2與植物表達(dá)載體pGWB12(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所提供)進(jìn)行LR反應(yīng)，得到重組載體pGWB12:IbFBA2，即為植物表達(dá)載體。

將上述重組載體pGWB12:IbFBA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CD501)，涂到含有卡那霉素(Kan)抗性的固體LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h，對(duì)重組載體pGWB12:IbFBA2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明，重組載體pGWB12:IbFBA2為將序列表中SEQ ID NO：1自5’端第28位至第1584位所示核苷酸插入pGWB12的兩個(gè)attR位點(diǎn)之間得到的載體。

2、植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1)從-80℃低溫冰箱中取出100μl的GV3101感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自上海邁其生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CH5002A)，置于冰上融化，加入1.0μg上述步驟1得到的植物表達(dá)載體pGWB12:IbFBA2，混勻；

2)液氮冷凍5min，37℃溫育5min；

3)加入250.0μl的LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2h；

4)取200.0μl菌液于含有抗生素(100.0μg/ml利福平(Rif)、50.0μg/ml卡那霉素(Kan))的LB固體培養(yǎng)基上涂布均勻，于28℃培養(yǎng)1-2天；

5)挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定(鑒定引物為引物1(序列表中SEQ ID NO：3)和引物2(序列表中SEQ ID NO：4))，得到1557bp片段的菌落為陽(yáng)性菌落；

6)將陽(yáng)性單菌落接種含有100.0μg/ml Rif和50μg/ml Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150rpm的搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.8，即得到了可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化工作的農(nóng)桿菌液。

3、轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥的獲得

轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將IbFBA2cDNA的編碼序列導(dǎo)入到野生型擬南植株中，具體方法如下：

1)將步驟2中準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌液離心后，倒掉上清，加入相同體積含有5.0％蔗糖、0.02％silwet L-77表面活性劑的懸浮溶液；

2)用移液槍吸取上述農(nóng)桿菌懸浮液，滴到擬南芥的花蕾以及腋芽上(去除已開(kāi)放的花朵)；

3)將處理好的植株置于透光的塑料盆中，內(nèi)壁噴灑一定量的水，并覆蓋保鮮膜以維持較高濕度，正常光照培養(yǎng)24h；

4)次日去掉保鮮膜，正常培養(yǎng)1個(gè)月后，單株收獲得到T₁代轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥種子；

5)對(duì)T₁代種子進(jìn)行消毒，用Top agar(0.1％agar)將其播種到含40mg/L潮霉素(Hyg)的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；

6)根據(jù)根的萌發(fā)情況，挑選長(zhǎng)根的單株移栽到基質(zhì)中，正常培養(yǎng)1個(gè)月后，PCR檢查挑出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株并單株收獲，得到T₂代轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥種子；

4、轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥的ABA耐受性鑒定

將編號(hào)為T(mén)11、T48、T50轉(zhuǎn)基因擬南芥種子以及野生型擬南芥(WT)種子消毒后播種到1/2MS培養(yǎng)基上，于4℃條件下暗培養(yǎng)48-72小時(shí)，取出后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待兩片子葉完全張開(kāi)后，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗種植到含有0mM(對(duì)照)和20mM ABA的1/2MS方形培養(yǎng)基(100mm×100mm)上，于光照培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)，觀(guān)察擬南芥生長(zhǎng)情況。每個(gè)株系種植3苗，兩個(gè)處理各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取平均值。

用Edwards Solution分別提取野生型擬南芥和T₂代3株轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，所用的IbFBA2基因引物為：引物1(SEQ ID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)，所用的AtTub基因引物為：引物3：5’-AGCAAATGTGGGACTCCAAG-3’(SEQ ID NO：5)和引物4：5’-CACCTTCTTCATCCGCAGTT-3’(SEQ ID NO：6)。PCR反應(yīng)體系如下：10.0μl2×Taq mix(購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CW0716A)，1.0μl DNA(50ng/μl)，1.0μl正向引物(序列表中SEQ ID NO：3)、反向引物(序列表中SEQ ID NO：4)(10.0mM)，ddH2O補(bǔ)充至終體積20.0μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，1個(gè)循環(huán)；4℃保存。

從電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1(泳道M為Marker；泳道P為陽(yáng)性對(duì)照(重組質(zhì)粒pGWB12::IbFBA2)；W為空白對(duì)照；WT為陰性對(duì)照(Col_0擬南芥)；泳道T11、T48和T50為轉(zhuǎn)IbFBA2基因擬南芥)可以看出，得到1557bp的為陽(yáng)性T₂代轉(zhuǎn)IbFBA2擬南芥，表明IbFBA2基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中，并證明這些再生植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

結(jié)果如圖2和圖3所示，可以看出在20mM ABA的培養(yǎng)基上編號(hào)為T(mén)11、T48、T50的轉(zhuǎn)基因擬南芥根的長(zhǎng)度比對(duì)照植株的根長(zhǎng)顯著伸長(zhǎng)，表明其耐逆性明顯增強(qiáng)。從圖4可以看出在20mM ABA的培養(yǎng)基上，編號(hào)為T(mén)11、T48、T50的轉(zhuǎn)基因擬南芥根的數(shù)目較對(duì)照更多。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IbFBA2蛋白及其編碼基因可以增強(qiáng)植物響應(yīng)ABA脅迫的耐性，增強(qiáng)植物耐逆性。