本發(fā)明屬于水稻基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻類病斑基因，以及該基因編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：植物類病變是指植物在沒有受到任何明顯逆境脅迫、物理損害或者病原物侵害的情況下，植株上自發(fā)形成類似于某種病原物侵染后產(chǎn)生的壞死斑的現(xiàn)象。許多類病斑突變體在類病斑形成之前或者形成之后均表現(xiàn)出對病原物抗性的增強(qiáng)。能穩(wěn)定遺傳的水稻類病斑突變體均符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，水稻中已報道了近200份類病變突變體，其類病斑性狀大部分受隱性單核基因控制。目前已有10個控制類病斑性狀的基因被克隆，主要是編碼剪接因子3b亞基的SPL5、編碼E3泛素連接酶的SPL11等(孫惠敏等.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報.2014年第3期)。水稻的抗病性高低與親本材料的血緣背景直接相關(guān)，已克隆的類病斑基因大多源于粳稻背景，而秈稻中鮮有報道，這也限制了類病斑材料在提高秈稻抗病性上的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人在對秈稻品種蜀恢498進(jìn)行EMS(甲基磺酸乙酯)誘變時，意外發(fā)現(xiàn)一個秈稻背景的類病斑突變體材料a344，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)該水稻類病斑性狀由單隱性基因控制，而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因發(fā)生點(diǎn)突變后會顯著提高水稻對白葉枯病的抗性。本發(fā)明是在上述意外發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的。本發(fā)明目的在于提供一種控制水稻類病斑性狀的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的在于提供編碼上述蛋白質(zhì)的基因。該基因能提高水稻對白葉枯病的抗性。本發(fā)明第三目的在于提供含有上述基因的表達(dá)載體。本發(fā)明第四目的在于提供上述基因在提高水稻抗白葉枯病上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供利用上述基因培育抗白葉枯病的水稻品種的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種控制水稻類病斑性狀的蛋白質(zhì)，命名為A344，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸添加、取代或缺失而衍生的、且與控制水稻類病斑性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，命名為A344，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列組成；(b)與序列表中SEQIDNO.1限定的核苷酸序列具有至少90％的同源性，且編碼具有控制水稻類病斑性狀相關(guān)蛋白質(zhì)功能的核苷酸序列；(c)對序列表中SEQIDNO.1限定的核苷酸序列中的一個或幾個核苷酸經(jīng)過添加、取代或缺失而衍生的、且編碼具有控制水稻類病斑性狀相關(guān)蛋白質(zhì)功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有上述基因的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體是指質(zhì)粒、宿主細(xì)胞或植物表達(dá)載體。所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞；本發(fā)明還提供了上述基因在提高水稻抗白葉枯病上的應(yīng)用。利用上述基因培育抗白葉枯病水稻品種的方法，將上述基因轉(zhuǎn)化到水稻品種中。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)或有益效果：(1)、本發(fā)明類病斑基因的抗水稻白葉枯病效果好，且涉及的類病斑突變體和克隆的基因均來源于秈稻，可用于提高秈稻的抗白葉枯病，為秈稻的抗白葉枯病育種提供了一個新的途徑；(2)、本發(fā)明運(yùn)用基因敲除新技術(shù)，成功獲得了粳稻背景下的類病斑材料，提供了利用該基因培育抗白葉枯病的粳稻品種的新方法。(3)、本發(fā)明基因由單隱性基因控制，轉(zhuǎn)基因或雜交后代鑒定和選擇比較簡單，便于應(yīng)用。附圖說明圖1、為分蘗初期蜀恢498和突變體a344植株表型對比照片；其中1為蜀恢498；2為突變體a344。圖2、分蘗初期蜀恢498和突變體a344的新葉和老葉表型對比照片，其中1為新葉；2為老葉。圖3、蜀恢498和突變體a344接種P2后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖4、蜀恢498和突變體a344接種J3后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖5、蜀恢498和突變體a344接種8248后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖6、蜀恢498和突變體a344接種P7后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖7、蜀恢498和突變體a344接種PXO99后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖8、本發(fā)明類病斑候選基因精細(xì)定位示意圖。圖9、引物I7擴(kuò)增后的電泳圖譜；其中1為花B；2為突變體a344；3為交換單株。圖10、引物I8擴(kuò)增后的電泳圖譜；其中1為花B；2為突變體a344；3為交換單株。圖11、引物AA34擴(kuò)增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為突變體a344。圖12、引物P1028擴(kuò)增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為陽性大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。圖13、引物P1092擴(kuò)增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為陽性轉(zhuǎn)基因植株。圖14、Crisper-A344載體示意圖。圖15、轉(zhuǎn)Crisper-A344敲除陽性植株的葉片類病斑表型對比圖片：其中1為陰性對照；2為Cas9-1；3為Cas9-2；4為Cas9-3；5為Cas9-4。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明類病斑突變體a344分離與遺傳分析試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料類病斑突變體a344，花B和蜀恢498均來自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所雜種優(yōu)勢利用實(shí)驗(yàn)室。其中類病斑突變體a344來源于以蜀恢498所構(gòu)建EMS(甲基磺酸乙酯)誘變庫，經(jīng)在四川溫江和海南陵水與蜀恢498進(jìn)行多代回交后發(fā)現(xiàn)，該類病斑表型能穩(wěn)定遺傳。(二)試驗(yàn)方法類病斑突變體a344，花B和蜀恢498均種在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所溫江試驗(yàn)田。利用突變體a344與花B、以及突變體a344與蜀恢498分別構(gòu)建F2群體，統(tǒng)計F1和F2群體的分離比。(1)類病斑表型分析：與野生型蜀恢498相比，突變體a344從分蘗期開始葉片出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)(見圖1),其中全展新葉上的斑點(diǎn)由葉尖向葉片基部蔓延，而老葉上的斑點(diǎn)則是從葉片基部向葉尖擴(kuò)散(見圖2)。(2)遺傳分析：利用突變體a344分別與蜀恢498和花B雜交獲得F1，F(xiàn)1代植株均具有正常的葉片表型和生育期，F(xiàn)2代中的野生型和類病斑表型的分離比(見表1)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，符合孟德爾單基因隱性突變的分離比3:1，說明突變體a344的類病斑表型是受一對隱性核基因控制。表1突變體a344的遺傳分析試驗(yàn)結(jié)果注：X20.05,1＝3.84實(shí)施例2本發(fā)明類病斑突變體a344對白葉枯病抗性鑒定對比試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料1、水稻材料(1)、突變體a344、蜀恢498均來源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所雜種優(yōu)勢利用實(shí)驗(yàn)室。(2)、高感白葉枯病品種IR24和高抗白葉枯病品種IRBB21均來自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所重大病害研究室。2、水稻白葉枯病菌的生理小種：J9、8248、P2、P6、J3或J7，均來自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所重大病害研究室。(二)試驗(yàn)方法1、水稻白葉枯病菌的培養(yǎng)取甘油保存的水稻白葉枯病菌，均勻地涂抹在固體培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)4天備用。所述的固體培養(yǎng)基配方(200ml)：蔗糖2g，L-谷氨酸鈉0.2g。將蔗糖和L-谷氨酸鈉混勻后，用NaOH調(diào)至PH＝7.0，再加入蛋白胨2g，混合后于滅菌高壓鍋121℃滅菌20分鐘。冷卻后倒成平板，4℃儲存。2、接種和觀察突變體a344、蜀恢498、高感白葉枯病品種IR24和高抗白葉枯病品種IRBB21均種在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所溫江試驗(yàn)田。取培養(yǎng)好的白葉枯菌用水稀釋成吸光度OD600值為1.0的懸浮菌液。選擇夏季高溫傍晚且3小時后不下雨的時候接種，利于病菌侵染及發(fā)病。對處于分蘗盛期的植株采用剪葉法接種，在白葉枯感病品種IR24、抗病品種IRBB21、突變體a344和蜀恢498中隨機(jī)選取10株植株，每個單株選取3片全展新葉進(jìn)行接種。3周后參照水稻的白葉枯病情分級標(biāo)準(zhǔn)(見表2)，測量病斑面積。表2水稻的白葉枯病情分級標(biāo)準(zhǔn)病級抗性反應(yīng)抗性評價0病斑面積小于5.0％高抗1病斑面積占葉面積5.1-12.0％抗3病斑面積占葉面積12.1-25.0％中抗5病斑面積占葉面積25.1-50.0％中感7病斑面積占葉面積50.1-75.0％感9病斑面積大于葉面積75.1％高感結(jié)果與蜀恢498的病斑面積相比(見圖3至圖7)，突變體a344受6個生理小種浸染后的病斑面積均明顯減小(見表3)，其中對生理小種P6和J7的抗性達(dá)到高抗水平。表3四種材料對水稻白葉枯病的抗性反應(yīng)結(jié)果實(shí)施例3:突變體a344候選基因的定位試驗(yàn)按照如下方法進(jìn)行：1.候選基因的定位(1)近等基因池構(gòu)建從突變體a344與花B雜交得到的F2群體中，隨機(jī)選取30份有類病斑表型的單株葉片和10份正常單株葉片，每10株的葉片等量混合提取DNA建池，包括3個隱性池和1個顯性池在內(nèi)的共計4個池，用于突變體a344與花B基因組之間的多態(tài)性檢測。從a344與蜀恢498雜交得到的F2群體中，隨機(jī)選取70份有類病斑表型的單株葉片，每10株的葉片等量混合提取DNA建池，共計7個池用于突變位點(diǎn)的共分離分析。葉片DNA采用改進(jìn)CTAB法提取。(2)引物合成和基因定位先利用平均分布于水稻12條染色體上的543對SSR引物(具體序列詳見http://www.gramene.org/bd/markers)，通過PCR擴(kuò)增，篩選出突變體a344與花B基因組之間的多態(tài)性引物98對；隨后用篩選出的多態(tài)性引物檢測近等基因池，以及突變體a344與花B構(gòu)建的F2群體中隱性單株，進(jìn)行基因初步定位；在已初定位的區(qū)間內(nèi)，依據(jù)http://www.gramene.org網(wǎng)站公布的9311和日本晴DNA序列之間的差異序列，設(shè)計Indel引物I7和I8(見表4)，電泳圖譜見圖9和圖10，繼續(xù)檢測近等基因池和突變體a344與花B構(gòu)建的F2群體中隱性單株，進(jìn)行精細(xì)定位；最后，利用AA34引物(見表4)對檢測突變體a344、蜀恢498以及兩者雜交得到F2群體中的7個隱性池，進(jìn)行突變位點(diǎn)的共分離分析(電泳圖譜見圖11)。表4本試驗(yàn)所用的PCR引物引物名稱前引物(5'-3')后引物(5'-3')片段長度(bp)I7CACTCCACCCAATCTCCTCTTCTGTTCTACTTCTCTACCT110I8GAGTCCTCCATGCTCTTAACCCAACAGAATCCTCACTA120AA34GGATCTGTCTTGCGTGTATGCTTGTTGGATGGTATCA150其中PCR反應(yīng)體系(20uL)：Tap酶(5U/μL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)2uL，DNA模板(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O11.8uL。PCR反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃8min，20℃2min。在3.0％的瓊脂糖凝膠、恒壓120-150V條件下電泳2-3h左右，用凝膠成像系統(tǒng)成像并保存記錄。(3)連鎖圖譜的構(gòu)建將帶型為突變體a344的單株標(biāo)記為0，帶型為雜合的單株記為1，帶型為親本的單株記為2，未出帶的單株記為3，通過用MAPMARKER3.0軟件對F2分離群體中分子標(biāo)記和突變性狀的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，再將重組值轉(zhuǎn)化為遺傳圖距(centMorgan,cM)。(4)候選基因初定位結(jié)果首先利用比較均勻分布在水稻12條染色體上的543對SSR引物，分析突變體a344與花B之間多態(tài)性，從中篩選出了98對平均分布水稻12條染色體上的多態(tài)性引物。然后利用該98對多態(tài)性引物在近等基因池和F2群體中46個隱性單株進(jìn)行篩選，結(jié)果(見圖8)發(fā)現(xiàn)第4號染色體的長臂端兩個SSR標(biāo)記RM5478和RM1112均與候選基因有連鎖關(guān)系，遺傳距離分別為1.5cM和1.3cM。(5)候選基因精細(xì)定位和基因預(yù)測通過在該區(qū)段內(nèi)繼續(xù)開發(fā)Indel標(biāo)記I7和I8，最終將候選基因精細(xì)定位在第4號染色體I8與I7之間的46Kb區(qū)段內(nèi)(見圖8)。對該區(qū)間內(nèi)的7個候選基因測序分析，在突變體a344中發(fā)現(xiàn)編碼pelota蛋白的LOC_Os04g56480基因的編碼區(qū)核苷酸序列的第350位由G變?yōu)門(見SEQIDNO.3)，導(dǎo)致該核苷酸編碼的色氨酸(W)變?yōu)榱涟彼?L)(見SEQIDNO.4)，使該蛋白功能受影響。通過在該基因內(nèi)部設(shè)計一對包含突變位點(diǎn)的特異性引物AA34對a344與蜀恢498雜交構(gòu)建的F2群體中具有類病斑表型的植株進(jìn)行共分離檢測(圖11)。測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的7個隱性池均表現(xiàn)為該位點(diǎn)的突變。因此，結(jié)合精細(xì)定位和測序結(jié)果，LOC_Os04g56480基因很可能是候選目的基因。實(shí)施例4：候選基因的敲除驗(yàn)證試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌EHA105菌株均來自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所雜種優(yōu)勢利用實(shí)驗(yàn)室。(二)試驗(yàn)方法1、Crisper-A344基因敲除載體構(gòu)建以野生型中A344基因的核苷酸序列為模板，選擇合適的區(qū)域，設(shè)計敲除的靶位點(diǎn)，利用BGK03載體參照試劑盒(杭州百格生物公司)構(gòu)建Crisper-A344載體。具體構(gòu)建流程如下(圖5)：(1)設(shè)計并合成下述引物對以形成gRNA靶點(diǎn)序列F：5'-TGTGTGCCAGAGCACGTATTGAAACAT-3'(SEQIDNO.11)R：5'-AAACATGTTTCAATACGTGCTCTGGCA-3'(SEQIDNO.12)(2)制備引物二聚體將合成的上述引物對加水溶解至10μM，按下列反應(yīng)體系混合后，在PCR儀95℃加熱3分鐘，然后以約0.2℃/秒緩慢降至20℃。所述的聚合體系為：退火B(yǎng)uffer18ul,gRNA靶點(diǎn)引物各1ul，加ddH2O,補(bǔ)足至20ul。(3)將引物二聚體構(gòu)建至BGK03載體。按下列反應(yīng)體系在冰上混合各個組分，混勻后20℃反應(yīng)1小時后轉(zhuǎn)化大腸桿菌備用。所述的反應(yīng)體系：BGK03載體2ul，Oligo二聚體1ul，酶混合液1ul，加ddH2O,補(bǔ)足至10ul。2、大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)從-80℃冰箱中取出一管制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化；(2)每100ng連接產(chǎn)物加入100μL感受態(tài)細(xì)胞懸浮液，混勻后在冰上放置30min；(3)42℃熱激30s，迅速取出立即置于冰上2min；(4)加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃200r/min培養(yǎng)1小時左右活化菌液；(5)將活化的菌液以5000r/min離心1min，在無菌條件下倒掉大部分上清夜，用移液槍輕輕的重懸沉淀的菌，使其懸浮在100μL左右的LB液體培養(yǎng)基中，在超凈臺上把菌液轉(zhuǎn)移并涂到含有抗生素的LB篩選平板上；(6)將涂有菌液的LB板子正面向上放置十分鐘左右，待菌液完全被LB固體培養(yǎng)基吸收后將涂板的培養(yǎng)基倒置，37℃的恒溫箱中過夜培養(yǎng)；(7)挑取單菌落，利用P1028引物進(jìn)行菌液PCR檢測；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖12)為900bp。所述的P1028引物對為：P1028-F:5'-TACACAGGCCATCGGTCCAGA-3'(SEQIDNO.13)P1028-R:5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'(SEQIDNO.14)。其中PCR反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃8min，20℃2min。(8)將陽性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)液中，置于37℃搖床上，200r/min培養(yǎng)約10h，保存菌液并提取質(zhì)粒。3、大腸桿菌質(zhì)粒的提取按照OMEGAPlasmidExtractionKit產(chǎn)品說明書進(jìn)行，將提取的質(zhì)粒DNA收集到干凈的離心管中，-20℃保存。4、質(zhì)粒序列的測定和序列分析將陽性克隆質(zhì)粒送到成都擎科科技股份有限公司進(jìn)行測序。用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，確證gRNA序列的正確性。5、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化法按照一個質(zhì)粒：50ul感受態(tài)細(xì)胞從-80拿出來時快速放手心化凍；加0.4-1ug構(gòu)建好的CRISPER-A344質(zhì)粒于50ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘；液氮中冷凍2分鐘；37℃水浴2min,溶化細(xì)胞；立即加入5倍體積的無抗LB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)2-3hr(170rpm)；7000rpm離心2分鐘，懸浮細(xì)胞在100ulLB培養(yǎng)基中；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培養(yǎng)2-3天；用潮霉素分子標(biāo)記P1028引物進(jìn)行菌液PCR檢測，將能擴(kuò)增出目的條帶的陽性農(nóng)桿菌單克隆，加入甘油作為保護(hù)劑后置于-80C保存?zhèn)溆谩?2)農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化水稻1)愈傷組織的誘導(dǎo)：日本晴種子先用75％酒精消毒1分鐘，用無菌水漂洗3次，再用40％的次氯酸鈉漂洗30分鐘，再用無菌水沖洗5次，放置于帶濾紙的培養(yǎng)皿中濾干，用鑷子接種于NMB培養(yǎng)基上，于28℃光培養(yǎng)7天。每7天繼代一次。繼代2～3次后，挑取從種子上生長出的良好愈傷組織，把它們繼代于預(yù)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)4天。2)農(nóng)桿菌菌株的活化：將-80C保存的30ul農(nóng)桿菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃下振蕩培養(yǎng)14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的YEP液體培養(yǎng)基中28℃再振蕩培養(yǎng)4h。3)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化：將活化好的菌液在5000rpm下離心收集菌體，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液體培養(yǎng)基30mL重懸菌體，將預(yù)先挑好的愈傷組織浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平鋪于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2d。4)愈傷脫菌培養(yǎng)與愈傷抗性篩選：將共培養(yǎng)2d后的愈傷組織用無菌水沖洗至水澄清，然后用含頭孢霉素(500mg/L)的無菌水振蕩30min殺菌，將愈傷組織用無菌濾紙或吸水紙徹底吸干，然后接種于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周左右。5)轉(zhuǎn)基因植株的分化與生根：將上述新長出的抗性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)1-2個月，然后將長出的3cm左右高的幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，當(dāng)苗長至約10cm時，取葉片提DNA利用潮霉素分子標(biāo)記P1028引物鑒定陽性植株苗，最終獲得4株轉(zhuǎn)基因陽性植株。6)將陽性轉(zhuǎn)基因植株室內(nèi)煉苗后，再移栽于大田。(3)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測應(yīng)用改進(jìn)的CTAB法提取水稻DNA，用P1092引物對按照下述PCR條件擴(kuò)出轉(zhuǎn)基因植株中的敲除后的序列，PCR產(chǎn)物(見圖13)片段大小為559bp。所述的P1092引物對為：P1092-F：5'-ATTAGACCCAACTGCAAGTGCT-3'(SEQIDNo:15)P1092-R：5'-TCAGGAAAGCCTGTAGGCAAAT-3'(SEQIDNo:16)其中PCR反應(yīng)體系(20uL)：Tap酶(5U/μL)0.2ul，Primer(10mmol/L)2ul，dNTP(2.5mmol/L)2ul，DNA(20-100ng/μL)2ul，10×Buffer(25mM)2ul，ddH2O11.8ul。PCR反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃8min，20℃2min。(4)PCR產(chǎn)物的回收目的DNA片斷膠回收操作步驟參照OmegaGelExtractionKit產(chǎn)品說明書進(jìn)行，取2μL膠回收產(chǎn)物置于1％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，檢測后送公司測序。對測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，4棵轉(zhuǎn)基因植株中的A344基因分別發(fā)生了單堿基A/G/T的插入。將含有g(shù)RNA靶點(diǎn)序列的核苷酸片段，連接到BGK03載體上，構(gòu)成基因敲除載體Crisper-A344(見圖14)。轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴。結(jié)果與日本晴對照相比，轉(zhuǎn)基因陽性植株的葉片均表現(xiàn)為類病斑(見圖15)，通過測序結(jié)果(SEQIDNO.3-6)表明轉(zhuǎn)基因植株中A344基因的編碼區(qū)均提前翻譯終止，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)(SEQIDNO.7-10)。經(jīng)A344基因的敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，說明A344是控制水稻該類病斑表型的基因。當(dāng)前第1頁1 2 3