本發(fā)明涉及昆蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

昆蟲害蟲和人類戰(zhàn)爭(zhēng)常常伴隨著難以預(yù)測(cè)的新趨勢(shì)。2000年以前，綠盲蝽并非是我國(guó)棉產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要害蟲，原因是為了防止棉鈴蟲所使用的農(nóng)藥把綠盲蝽的數(shù)量保持低水平。然而1997年開(kāi)始，Bt棉花的商業(yè)化種植有效控制了棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的危害，綠盲蝽逐漸成為危害棉花的主要害蟲。目前對(duì)綠盲蝽的防治主要依靠化學(xué)防治，該方法不僅容易導(dǎo)致其產(chǎn)生抗藥性，而且對(duì)環(huán)境造成污染。因此，發(fā)展一種經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的方法控制綠盲蝽具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行抗蟲可以有效抵抗蟲害，并且安全環(huán)保，這些優(yōu)點(diǎn)使轉(zhuǎn)基因作物成為抗蟲策略的首選?；谀壳耙訰NAi為基礎(chǔ)發(fā)展抗蟲轉(zhuǎn)基因作物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，且該技術(shù)在害蟲防治領(lǐng)域已經(jīng)取得一些進(jìn)展。

RNAi指的是內(nèi)源或外源RNA被RNase III內(nèi)切酶DICER切成大小20–25bp，小dsRNA片段，然后這些小片段進(jìn)一步被進(jìn)入RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體內(nèi)并被解開(kāi)雙鏈，把反義鏈作為識(shí)別同源性mRNA的引導(dǎo)者，最后降解同源性mRNA的過(guò)程。表皮生長(zhǎng)因子是一種小肽，由53個(gè)氨基酸殘基組成，是類EGF大家族的一個(gè)成員，是一種多功能的生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)體外都對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。表皮生長(zhǎng)因子通過(guò)與細(xì)胞表面的受體，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)結(jié)合而起作用。EGF一旦同應(yīng)答細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合，便促進(jìn)受體二聚化并使細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)磷酸化。被激活的受體至少可與5種具有不同信號(hào)序列的蛋白結(jié)合，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGF能夠廣泛促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Eps15起初被鑒定為與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)激酶活性有關(guān)。其由三個(gè)部分組成的。研究表明Eps15的干擾影響表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)對(duì)生長(zhǎng)因子(EGF)的內(nèi)吞作用。所以對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。由此可見(jiàn)，該基因很有可能將成為一種新的靶標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)研發(fā)RNAi介導(dǎo)的害蟲防治策略方面能夠應(yīng)用。然而至今在昆蟲中RNAi介導(dǎo)Eps15沉默研究幾乎沒(méi)有。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種綠盲蝽表皮生長(zhǎng)因子途徑底物15命名為ApEps15基因，在綠盲蝽生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程中起著非常重要的作用，沉默該基因后，對(duì)綠盲蝽個(gè)體發(fā)育造成的影響。

本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一種綠盲蝽ApEps15基因在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

綠盲蝽ApEps15基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

綠盲蝽ApEps15基因在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

所述RNAi介導(dǎo)中，合成的dsRNA通過(guò)注射或飼喂進(jìn)入綠盲蝽體內(nèi)。

所述合成dsRNA所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述注射體積為41.6nl，注射dsRNA濃度為10μg/μl，注射部位為綠盲蝽的后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。

所述飼喂的飼料總體積200ul，dsRNA濃度0.5ug/ul。

所述綠盲蝽為三齡綠盲蝽。

本發(fā)明中利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析了綠盲蝽成蟲和幼蟲轉(zhuǎn)錄組，并獲得了ApEps15基因，然后按下面循序進(jìn)項(xiàng)(1)取綠盲蝽總RNA，通過(guò)RT-PCR得到cDNA；(2)設(shè)計(jì)帶有T7序列的特異性引物；(3)通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段：以第一步得到的cDNA為模板，第二步設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(4)構(gòu)建含有選定目的基因片段的載體并轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌中，培養(yǎng)，提取含有目的基因片段的質(zhì)粒；

(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質(zhì)粒為模板，第二步設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產(chǎn)物合成為目的基因片段dsRNA；(7)進(jìn)行顯微注射實(shí)驗(yàn)把靶標(biāo)dsRNA傳遞到體內(nèi)

(8)人工飼料的配制(9)將dsRNA混合到人工飼料中通過(guò)封口膜包裝飼喂3齡幼蟲24小時(shí)后用正常飼料繼續(xù)飼養(yǎng)(9)統(tǒng)計(jì)死亡率，觀察表型。在此基因內(nèi)重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提取綠盲蝽不同組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以這些cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)驗(yàn)所用dsRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。

其中A為ESP-15的dsRNA，B為GFP的dsRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

圖2 ESP-15dsRNA顯微注射后存活率。

圖3 ESP-15dsRNA顯微注射后Qpcr結(jié)果。

圖4 ESP-15dsRNA顯微注射誘導(dǎo)的異常表型，其中左圖為空白對(duì)照，右圖為實(shí)驗(yàn)組。

圖5綠盲蝽ApEps15的dsRNA飼喂傳遞7天后存活率。

圖6綠盲蝽ApEps15的dsRNA飼喂后表型，其中左圖為空白對(duì)照，右圖(2張)為實(shí)驗(yàn)組。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售常規(guī)生化試劑。

實(shí)施例1ApEps15基因克隆、dsApEps15的具備，注射和飼喂實(shí)驗(yàn)

1、ApEps15基因的生物信息學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)室事前對(duì)綠盲蝽進(jìn)行轉(zhuǎn)綠組測(cè)序，成功得到綠盲蝽63029條基因序列，并注釋了其中25760條基因序列。利用生物信息學(xué)技術(shù)及相關(guān)在線軟件對(duì)綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的分析，通過(guò)在線程序NCBI Blast等程序的幫助下確定了到綠盲蝽ApEps15基因，見(jiàn)序列表SEQ ID NO1。

2、供試?yán)ハx及組織收集

綠盲蝽為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所使用新鮮玉米(ZeamaysL)及四季豆(Phaseolusvulgaris L.)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25-28℃，相對(duì)濕度為60％-70％，光照為16:8(L:D)。

3、RNA的提取

昆蟲總RNA提取的全部過(guò)程在無(wú)RNase條件下進(jìn)行。整個(gè)提取步驟如下所示：

1)取-70℃保存的昆蟲組織，加入已經(jīng)用液氮預(yù)冷的玻璃勻漿器中，立即向勻漿器內(nèi)加入1mL Trizol試劑，將組織充分研磨磨碎；將研磨好的組織溶液用無(wú)RNA酶的槍頭轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的1.5mL離心管中，暫時(shí)置于冰上。

2)4℃，12000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到新的無(wú)RNA酶的1.5mL離心管中。

3)將上清在室溫下放置5min后，向離心管中加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩15s，再室溫靜置2-3min。

4)4℃，12000g離心15min，混合物在此后分層，下層為有機(jī)相，上層為水相(RNA就在水相中)，用無(wú)RNA酶的槍頭將上層水相轉(zhuǎn)移到新的無(wú)RNA酶的1.5mL離心管中，注意盡量不要吸到中間層，以免造成蛋白質(zhì)或DNA污染。

5)加入0.5mL異丙醇，混勻后，室溫靜置10min來(lái)沉淀RNA。

6)4℃，12000g離心10min后，觀察到的沉淀即為RNA,棄上清(盡量吸凈)，加入1mL 75％的乙醇(用DEPC水配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)，輕輕震蕩離心管懸浮沉淀，洗滌沉淀。

7)4℃，7500g離心10min后，棄上清(盡量吸凈)，超凈臺(tái)中干燥沉淀5-10min。

8)加入10-20μL RNA-free水(根據(jù)RNA量而定)，輕彈離心，使沉淀充分溶解。

9)55-60℃溫育后，取1μL樣品稀釋至5μL，其中2.5μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，2.5μL用NanoDrop儀器檢測(cè)；剩余的樣品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。

4、第一鏈cDNA的合成

整個(gè)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程在無(wú)RNA酶污染的條件下進(jìn)行，操作步驟按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行，具體如下：

1)在無(wú)RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根據(jù)NanoDrop定量的結(jié)果計(jì)算應(yīng)該加入RNA的體積數(shù))，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Buffer with MgCl₂，用RNA-free水將體系補(bǔ)足到10μL；輕微震蕩后離心；

2)37℃溫育30min后，向體系內(nèi)加入1μL 50mM EDTA，震蕩后離心，然后65℃溫育10min,以去除DNA酶I；

3)加入1μLoligo-dT，用RNA-free水補(bǔ)至12μL；

4)65℃溫育5min后，立即置于冰上；

5)依次加入下列試劑，使體系達(dá)到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTP Mix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNase Inhibitor；簡(jiǎn)單混勻離心；

6)42℃溫育1h，然后再70℃溫育5min；

7)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情況稀釋若干倍。

5、靶標(biāo)基因的克隆

本發(fā)明選取了持家基因、能量代謝相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因上的基因片段，通過(guò)注射法研究其對(duì)昆蟲的影響，GFP基因上的片段作為對(duì)照。持家基因又稱管家基因，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的；而能量代謝相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因也在綠盲蝽生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程中起著非常重要的作用。本發(fā)明選取此類基因上的片段，利用注射法進(jìn)行RNAi將其沉默，研究觀察沉默該基因后，對(duì)綠盲蝽個(gè)體發(fā)育造成的影響。GFP即綠色熒光蛋白，在昆蟲體內(nèi)并不存在，故大量研究中將其作為對(duì)照基因合成dsRNA。

1.靶標(biāo)基因引物的設(shè)計(jì)：

(1)利用BLAST檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索綠盲蝽的相近物種同一靶標(biāo)基因的蛋白或者cDNA編碼的氨基酸序列，用綠盲蝽成蟲若蟲轉(zhuǎn)錄組組建的本地BLAST庫(kù)進(jìn)行比對(duì)查詢，確定所選基因的序列。

(2)根據(jù)靶標(biāo)基因的片段，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)帶T7啟動(dòng)子的引物，引物設(shè)計(jì)原則如下：

a.引物設(shè)計(jì)的區(qū)間要在靶標(biāo)基因的編碼區(qū)，中間片段大小在400～500bp左右。

b.中間片段盡量選在靶標(biāo)基因的特異區(qū)域。

c.引物之間不能形成引物二聚體，交叉二聚體。

2.根據(jù)以上引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物后，送至華大基因進(jìn)行引物合成。

3.相關(guān)靶標(biāo)基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1.實(shí)驗(yàn)所用引物

4.目的片段的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析

1).以綠盲蝽cDNA為模板，用ExTaq酶擴(kuò)增表1-1中基因。反應(yīng)體系為25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

2).PCR產(chǎn)物用溶解在1×TAE緩沖液的1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收(操作步驟按試劑盒內(nèi)附帶的說(shuō)明書進(jìn)行)，回收的片段連接到pGME-T載體上(體系為8μl膠回收產(chǎn)物、1μl 10×T4鏈接反應(yīng)緩沖液、0.5μl pGME-T載體和0.5μl T4連接酶，16℃條件下連接過(guò)夜)，連接體系轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化步驟按感受態(tài)細(xì)胞附帶的說(shuō)明書進(jìn)行)，培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證(體系和條件同上)，將檢測(cè)正確的克隆用液體LB培養(yǎng)基(含氨芐抗生素)培養(yǎng)過(guò)夜檢驗(yàn)?zāi)康钠涡蛄小?/p>

3).根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將正確的菌株加入含有氨芐抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基重新?lián)u菌，獲得新鮮的菌液，將1ml菌液和百分之八十的甘油按照9:1比例混合，存于-80℃低溫冰箱保存。將剩余的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。序列結(jié)果見(jiàn)序列表SEQ ID NO2。

5.dsRNA模板的制備

以帶有靶標(biāo)基因片段的質(zhì)粒為模板，用聚合酶擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl載有靶標(biāo)基因片段的質(zhì)粒，1μl正向(F)引物(10mM)，1μl反向(R)引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

將1μl PCR產(chǎn)物用溶解在1×TAE緩沖液的1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。如果所得條帶長(zhǎng)度與目的片段長(zhǎng)度一致，并且結(jié)果顯示為單一明亮的條帶，則將剩余的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酚氯仿抽提與純化。

PCR產(chǎn)物的酚氯仿抽提的步驟：

1).將需要純化的PCR產(chǎn)物用無(wú)RNA酶的H2O定容至200μl

2).加入等體積(200μl)的酚氯仿試劑(一定取酚氯仿試劑的下層，并且拿試劑瓶時(shí)要平穩(wěn)，不能晃動(dòng))。

3).溫和混勻，在4℃離心機(jī)下離心(12000rpm，4℃)15min.

4).4.取上清，加入1/10體積(20μl)的3M乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積(400μl)的100％乙醇(-20℃貯存)，溫和混勻后放于-20℃靜置沉淀至少3小時(shí)或者過(guò)夜。

5).在4℃離心機(jī)下離心(12000rpm，4℃)30min.

6).白色沉淀積于離心管底部，棄上清液(為防止沉淀一起被吸出，可保留些許上清液)，加入75％乙醇(-20℃貯存)輕輕混勻，洗滌沉淀

7).在4℃離心機(jī)下離心(7500rpm，4℃)5min.

8).將乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的殘留液體用10μl移液槍慢慢吸出。將離心管開(kāi)蓋放入37℃恒溫培養(yǎng)箱干燥，10min左右，待乙醇全部揮發(fā)。

9).加入5μl RNase–free H2O輕彈管底，讓沉淀充分均勻溶解于無(wú)RNA酶的H₂O。

10).取1μl溶液溶于4μl無(wú)RNA酶的H2O中，用濃度測(cè)量?jī)x器檢測(cè)濃度和OD值。用凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物單一性，如果檢測(cè)條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則說(shuō)明PCR產(chǎn)物質(zhì)量良好，可以作為下一步合成dsRNA的模板使用。

6、dsRNA的合成

1.將ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液室溫融化，T7RNA聚合酶放于-20℃貯存，隨用隨拿，用完立即放入-20℃環(huán)境下貯存。溶解以后輕彈管底，瞬時(shí)離心，將試劑離心到管底。

2.按以下比例將試劑混合：

試劑 50μl體系

反轉(zhuǎn)錄緩沖液 10μl

ATP，CTP，GTP，UTP(100mM) 各1μl

RNA酶抑制劑 1.25μl

模板 1.5μg

無(wú)RNA酶的H2O定容至 49μl

T7RNA聚合酶 1μl

輕彈混勻，瞬時(shí)離心。放入37℃金屬浴中4小時(shí)。

3.從金屬浴中取出離心管，放入75℃金屬浴中5min，然后放置室溫冷卻(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀釋5倍，凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物條帶。

4.去除DNA和dsRNA.按照比例加入下列試劑：

試劑 60μl體系

10×反應(yīng)緩沖液 6μl

DNA酶Ⅰ 2μl

RNA酶 0.5μl

無(wú)RNA酶的H2O 2.5μl

dsRNA產(chǎn)物49μl

充分混勻，輕彈管底，瞬時(shí)離心后，放入金屬浴37℃30min，加入EDTA試劑1μl,65℃金屬浴中放置5min終止反應(yīng)。取1μl產(chǎn)物，稀釋5倍，凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物單一性，濃度檢測(cè)儀器檢測(cè)濃度和OD值。如果檢測(cè)條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則說(shuō)明dsRNA質(zhì)量良好，可以進(jìn)行下一步dsRNA酚氯仿抽提。

7、dsRNA的酚氯仿抽提

1.將需要純化的dsRNA(～60μl)用無(wú)RNA酶的H2O定容至200μl(可根據(jù)實(shí)際需要等比例擴(kuò)大體系)。

2.加入1/2體積(100μl)的水飽和酚試劑(一定取水飽和酚試劑的下層，并且拿試劑瓶時(shí)要平穩(wěn)，不能晃動(dòng))和1/2體積的氯仿(100μl)。

3.輕輕混勻，在4℃離心機(jī)下離心(12000rpm，4℃)15min。

4.取上層水相，加入的等體積氯仿(200μl)，輕輕混勻，在4℃離心機(jī)下離心(12000rpm，4℃)15min。

5.取上層水相，加入1/10體積(20μl)的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積(500μl)的100％乙醇(-20℃貯存)，溫和混勻后放于-20℃靜置沉淀至少3小時(shí)或者過(guò)夜。

6.在4℃離心機(jī)下離心(12000rpm，4℃)30min。

7.白色沉淀積于離心管底部，棄上清液(為防止沉淀一起被吸出，可保留些許上清液)，加入80％乙醇(-20℃貯存)輕輕混勻，洗滌沉淀。

8.在4℃離心機(jī)下離心(7500rpm，4℃)5min。

9.將乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的殘留液體用10μl移液槍慢慢吸出。將離心管開(kāi)蓋放入37℃恒溫培養(yǎng)箱干燥，10min左右，待乙醇全部揮發(fā)。

10.加入5μl無(wú)RNA酶的H2O輕彈管底，讓沉淀充分均勻的溶解于無(wú)RNA酶的H2O中。

11.取1μl溶解的dsRNA產(chǎn)物稀釋于4μl DEPC H2O中，用凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物單一性，并用濃度檢測(cè)儀器檢測(cè)濃度和OD值。如果檢測(cè)的條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則證明dsRNA質(zhì)量良好，可以進(jìn)行綠盲蝽體內(nèi)注射RNAi實(shí)驗(yàn)。

8、事實(shí)熒光定量PCR與分析

實(shí)驗(yàn)采用的是2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量，即通過(guò)內(nèi)參基因校準(zhǔn)不同樣品的模板加入總量的差異。ΔΔCT＝(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組，2-ΔΔCT的意義即為：實(shí)驗(yàn)組的目的基因相對(duì)于對(duì)照組的目的基因的倍數(shù)，由此即可得到相對(duì)表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)所用的引物如表2所示

表2實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)所用引物

本實(shí)驗(yàn)中，以α-tubulin,GADPH為內(nèi)參基因，按照TakaRa公司的SYBR PRemix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書對(duì)綠盲蝽對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，以實(shí)驗(yàn)的三組基因的第1d、2d、3d、4d、5d樣品的cDNA模板。反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系為20μL

9、綠盲蝽RNAi飼喂方法的具體實(shí)施

9.1齡(3L)綠盲蝽的準(zhǔn)備

本發(fā)明中所選綠盲蝽為3L若蟲，現(xiàn)以3L若蟲的收集方法如下：收集1L初孵若蟲(200～300頭)，放入養(yǎng)蟲盒中，盒中放入干凈濾紙和一根去皮的新鮮玉米，約4天后所有1L若蟲成長(zhǎng)為3L若蟲，準(zhǔn)備鋪好濾紙和7～8粒新鮮玉米粒的塑料培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿里放15只3L若蟲，放若蟲時(shí)，用軟毛刷輕輕挑取，以免對(duì)若蟲造成不必要的機(jī)械損傷。饑餓處理兩個(gè)小時(shí)

人工飼料的配制

人工飼料是按照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲研究組所提供的配方來(lái)配制的(棉蟲組已經(jīng)在人工飼料的配制和實(shí)際應(yīng)用方面通過(guò)了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證)。

9.2注射篩選Eps15基因片段的dsRNA對(duì)綠盲蝽生長(zhǎng)發(fā)育的影響

合成完dsRNA以后先用注射法傳遞dsRNA，dsGFP和dsβ-actin分別作為對(duì)照。注射法使用3L綠盲蝽，注射參數(shù)如下：注射體積為41.6nl，注射dsRNA濃度為10μg/μl，注射部位為綠盲蝽的后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。結(jié)果表3所示。

表3盲蝽Eps15dsRNA注射7天存活率

9.3飼喂傳遞Eps15dsRNA基因?qū)G盲蝽生長(zhǎng)發(fā)育的影響

三齡綠盲蝽的準(zhǔn)備和人工飼料的配制

為飼喂實(shí)驗(yàn)所準(zhǔn)備的綠盲蝽前期準(zhǔn)備階段與注射實(shí)驗(yàn)一樣然而最后開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)前饑餓處理兩個(gè)小時(shí)。

人工飼料是按照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲研究組所提供的配方來(lái)配制的(棉蟲組已經(jīng)在人工飼料的配制和實(shí)際應(yīng)用方面通過(guò)了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證)

飼料總體積200ul，dsRNA濃度0.5ug/ul。結(jié)果如表3所示。

表4綠盲蝽Eps15的dsRNA飼喂7天存活率