本發(fā)明涉及干細胞提取培養(yǎng)領域，具體而言，涉及一種人羊膜間充質干細胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術：
：糖尿病是一種常見的由內分泌系統(tǒng)代謝障礙引起的慢性終身疾病，長期患病可導致神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的慢性損害。隨著我國經濟的發(fā)展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，嚴重危害人們的健康，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。最新大樣本流行病學調查顯示，中國成人糖尿病患病率為11.6％，其中男性患病率為12.1％，女性患病率為11％，城市居民為14.3％，農村居民為10.3％；調查結果還顯示糖尿病前期率為50.1％。目前主要是使用口服降糖藥及胰島素替代治療，不能根治，且存在很多不足。人羊膜來源干細胞包括人羊膜上皮細胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜間充質干細胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。人羊膜干細胞可在體內及體外向外胚層來源的神經細胞、神經膠質細胞，內胚層來源的胰腺細胞、肝臟細胞以及中胚層來源的心肌樣細胞、肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞方向分化，并且具有無性集落形成能力和抗炎性。作為很多細胞的前體，羊膜干細胞又能抑制細胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎癥的蛋白都在羊膜干細胞中表達，這也解釋了羊膜的抗血管生成和抗炎癥的作用。這些性質使得羊膜干細胞已在很多治療起到輔佐作用，而且大多數(shù)效果顯著。人羊膜干細胞在具有類似胚胎干細胞性質的同時，因其無致瘤性、低免疫排斥性、含量豐富、容易獲取、不引起倫理爭議，極有潛力成為臨床應用的干細胞來源之一。近年來，隨著干細胞技術的發(fā)展，羊膜干細胞移植已經成為新的疾病治療的發(fā)展方向。在臨床應用上，羊膜干細胞在結膜損傷修復、重建眼表、防治瞼球粘連與視網(wǎng)膜移植等眼科臨床已開展了大量工作，而且在糖尿病難愈性皮膚潰瘍、燒傷等創(chuàng)面修復愈合方面也有積極的療效。而且，已經有實驗證據(jù)證明羊膜干細胞能夠分化在一定條件下能夠分化為胰島細胞。同時，也有學者報道了人羊膜間充質干細胞治療糖尿病的病例，并取得了良好的效果。雖然現(xiàn)在羊膜干細胞的應用研究上已經取得了一定的成果，并已經開始利用人羊膜間充質干細胞進行糖尿病治療的研究。然而，現(xiàn)有的人羊膜間充質干細胞的提取和培養(yǎng)的方法仍比較復雜，且無法得到具有較高純度和活性的人羊膜間充質干細胞。因此，開發(fā)一種便捷高效且能夠產業(yè)化、規(guī)模化提取和培養(yǎng)人羊膜間充質干細胞的方法，就成了目前亟待解決的技術問題。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人羊膜間充質干細胞分離培養(yǎng)方法，所述方法中，通過將人羊膜間充質干細胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質干細胞。從而能夠解決現(xiàn)有技術人羊膜間充質干細胞提取分離方法復雜等技術問題。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種人羊膜間充質干細胞提取分離方法，所述方法包括如下步驟：(1)將羊膜從胎盤組織上剝離，并清洗；(2)將清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶處理；(3)將胰酶處理后的組織清洗后，加入膠原酶I消化處理；(4)將消化處理后的組織過濾，并離心；(5)用培養(yǎng)液將離心后得到的細胞重懸后接種培養(yǎng)；(6)培養(yǎng)后細胞匯合度達到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培養(yǎng)基終止消化，并傳代培養(yǎng)，即得到人羊膜間充質干細胞。本發(fā)明中，通過將人羊膜間充質干細胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)模化的得到人羊膜間充質干細胞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗為以含3％雙抗的HBSS緩沖溶液清洗。本發(fā)明中，通過使用含有雙抗的HBSS緩沖溶液清洗剝離后所得的組織，從而能夠在有效去除殘留血跡的同時，還能夠起到進一步消毒的作用。本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是在無菌條件下進行的。本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離。本發(fā)明中，所述HBSS緩沖溶液為平衡鹽溶液。本發(fā)明中，所述含3％雙抗的HBSS緩沖溶液為含有3％青霉素和鏈霉素的HBSS緩沖溶液。本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗為多次清洗。可選的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶處理為在33～38℃條件下處理25～35min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶處理為在35～37℃條件下處理30～32min?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶為處理2～3次。本發(fā)明中，通過多次胰酶處理，從而能夠充分的將羊膜上皮除去，從而得到高純度的人羊膜間充質干細胞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為以濃度為0.3～0.6mg/ml的膠原酶I消化處理；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為以濃度為0.4～0.5mg/ml的膠原酶I消化處理?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為在35～39℃條件下消化處理1～2h；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為在37～38℃條件下消化處理1～2h。本發(fā)明中，通過對消化處理溫度和時間的調整，從而能夠提高酶活性，并進一步提高酶解處理效率；同時還不會由于酶解時間過長所導致的處理效率過低以及對目標細胞組織的破壞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述的消化處理是在水浴條件下進行的。可選的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述離心為在轉速為1300～1600rpm條件下，離心8～15min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述離心為在轉速為1400～1500rpm條件下，離心8～10min。本發(fā)明中，通過對離心轉速以及離心時間等條件的選擇和調整，從而能夠在將人羊膜間充質干細胞充分離心得到的同時，還能夠避免由于離心時間過長所導致的整體純化處理效率的降低。可選的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述培養(yǎng)是在35～38℃條件下CO2培養(yǎng)箱內進行的培養(yǎng)；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述培養(yǎng)是在36～37℃條件下CO2培養(yǎng)箱內進行的培養(yǎng)。可選的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述胰酶消化是在35～38℃條件下消化3～6min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述胰酶消化是在36～37℃條件下消化4～5min。本發(fā)明中，通過對消化處理溫度和時間的調整，從而能夠提高酶活性，并進一步提高酶解處理效率；同時還不會由于酶解時間過長所導致的處理效率過低以及對目標細胞組織的破壞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(5)所述接種培養(yǎng)是先將離心處理所得的細胞按1×106的細胞密度接種于10mm培養(yǎng)皿內，再放入37℃條件下的CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明中，通過將人羊膜間充質干細胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)模化的得到人羊膜間充質干細胞；(2)本發(fā)明中，通過對酶解消化處理等步驟條件的選擇、調整以及優(yōu)化，從而進一步提高了本發(fā)明間充質干細胞提取純化效率。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為培養(yǎng)48h后，在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖2為培養(yǎng)基中細胞匯合度達到80％-90％時，4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖3為P5代羊膜間充質干細胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖4為P10代羊膜間充質干細胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖5為P15代羊膜間充質干細胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細胞形態(tài)；圖6為細胞表面子在羊膜間充質干細胞上的表達分析檢測圖譜；圖7A為未經誘導分化處理的P3代羊膜間充質干細胞在10×顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)。圖7B為經成脂誘導試劑誘導分化處理后P3代羊膜間充質干細胞在10×顯微鏡下觀察到的細胞染色情況。圖7C為經成骨誘導試劑誘導分化處理后P3代羊膜間充質干細胞在10×顯微鏡下觀察到的細胞染色情況。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。實施例1(1)在無菌條件下，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，然后，用含3％雙抗HBSS沖洗數(shù)次清除殘留血跡；(2)將清洗后的羊膜組織剪碎，并加入胰酶進行處理，從而去除羊膜上皮細胞；(3)將步驟(2)處理后所得組織用HBSS清洗3次后，加入濃度為0.5mg/ml膠原酶I，并在37℃水浴鍋中消化處理1-2h；(4)將消化處理后所得混合物用篩網(wǎng)過濾，并去掉未消化組；然后在1500rpm條件下，離心處理10min.(5)用羊膜間充質干細胞培養(yǎng)液重懸離心處理所得的細胞，并按1×106的細胞密度接種于10mm培養(yǎng)皿內，并放入37℃條件下的CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)48小時后，得到圖1所示細胞形態(tài)的培養(yǎng)基，并更換為新的DMEM/F12培養(yǎng)基；(6)如圖2所示，細胞匯合度達到80％-90％后，加入胰酶37℃消化5min加入培養(yǎng)基終止消化，按1:3進行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明方法培養(yǎng)的人羊膜間充質干細胞可穩(wěn)態(tài)由如圖3所示的P5代、如圖4所示的P10代一直傳代培養(yǎng)至圖5所示的P15代。實驗例1流式細胞儀檢測收集實施例1步驟(3)中消化處理后，過濾離心得到的人羊膜間充質干細胞，并收集約106個細胞；將收集得到的細胞用PBS緩沖溶液洗滌2次，并適當稀釋；然后在流式細胞儀上加樣檢測；檢測后，采用軟件分析CD73、CD90、CD44、CD45、CD105等5種細胞表面子在人羊膜間充質干細胞上的表達，分析結果如圖6所示；進一步根據(jù)圖6所示分析結果進行積分計算，得出5種細胞表面子在各代的表達情況，結果如下：CD73表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代617161.761.7P2代6168100.061.7CD90表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代602860.360.3P2代587297.458.7CD105表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代616461.661.6P3代611899.361.2CD45表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代635763.663.6P3代240.40.2CD44表達情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代621862.262.2P3代616199.161.6然后統(tǒng)計各標志物表達情況，結果如下表所示：細胞表面標志物羊膜間充質干細胞CD73100％CD4499.1％CD10599.3％CD9097.4％CD450.4％檢測結果顯示，本發(fā)明人羊膜間充質干細胞高表達了CD73、CD44、CD105以及CD90，基本不表達CD45。實驗例2成脂及成骨分化的實驗研究干細胞具有自我復制及多項分化的潛能。到目前為止人們已經陸續(xù)從臍帶，胎盤，骨髓，脂肪，皮膚，毛囊等組織提取分離出間充質干細胞。分離方法主要有種植法和酶消化法兩種。不同的方法和實驗程序對提取的干細胞的質量和純度有很大差異。所以干細胞的分化實驗是世界上普遍認可的干細胞鑒定標準。具體檢測方法如下：a、將實施例1步驟(5)中P3代羊膜間充質干細胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達到70％-80％后，加入成脂誘導液，并有對照孔。每周換液兩次，誘導14-18天后，進行油紅O染色鑒定脂滴形成，顯微鏡下觀察并拍照，見圖7B。b、將實施例1步驟(5)中P3代羊膜間充質干細胞細胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達到70％-80％加入成骨誘導液，并有對照孔。每周換液兩次，誘導21-25天后，進行茜素紅染色鑒定骨結節(jié)形成，顯微鏡下觀察并拍照，見圖7C。圖7A為陰性對照，經對照檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明羊膜間充質干細胞具有良好的成脂、成骨能力。經對照檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明羊膜間充質干細胞具有良好的成脂、成骨能力。本發(fā)明方法中，通過將人羊膜間充質干細胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質干細胞。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁1 2 3