本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及蛋白質(zhì)及其編碼基因在調(diào)控植物抗黃萎病性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃萎病是目前危害棉花生產(chǎn)的重要病害之一，被稱為棉花的“癌癥”，遍布世界各產(chǎn)棉區(qū)，其病原為大麗輪枝菌。棉花黃萎病是一種土傳、沿維管束系統(tǒng)侵染的真菌性病害，嚴(yán)重危害棉花生長發(fā)育，導(dǎo)致棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低，給棉花生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。棉花是世界性的重要纖維作物，同時(shí)也是一種重要的油料與生物能源作物，在國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中占有重要地位。但是我國的基本國情是人多地少，糧棉爭地矛盾非常突出，因此，培育抗病的棉花新品種對于棉花生產(chǎn)至關(guān)重要。僅靠單一的常規(guī)傳統(tǒng)育種方法由于缺乏有效抗源等問題，很難達(dá)到理想效果。因此，分離控制棉花發(fā)育和/或提高棉花抗病性的相關(guān)基因，有助于加快通過分子育種手段培育新的優(yōu)質(zhì)棉花品種。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物的抗黃萎病性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至158位所示；所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第166至313位所示。所述蛋白質(zhì)，可為如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；a3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)；a4)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)；a5)在a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a6)將a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物抗病性和/或發(fā)育性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)；所述發(fā)育性狀為株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小。其中，序列表中序列2可由313個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列4可由306個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列6可由312個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列8可由313個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。為了使a2)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。為了使a3)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。為了使a4)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a6)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a6)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a6)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1、序列表中序列3、序列表中序列5或序列表中序列7所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。所述抗病性可為抗黃萎病。所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強(qiáng)致病菌臨西2-1。編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子，具體可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；(b5)與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；(b6)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。序列表中序列1由942個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918個(gè)核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936個(gè)核苷酸組成，序列表中序列5的核苷酸編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939個(gè)核苷酸組成，序列表中序列7的核苷酸編碼序列表中序列8所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質(zhì)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2、序列表的序列4、序列表的序列6或序列表的序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為向載體插入所述核酸分子得到的重組質(zhì)粒。所述載體具體可為載體pENTR/SD/D-TOPO或載體pMDC83。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1。所述重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1可為向載體pENTR/SD/D-TOPO插入序列表中序列1所示的DNA分子。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP。所述重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pGW-△GhBZR1或重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP。所述重組質(zhì)粒pGW-△GhBZR1或重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP中均含有序列表中序列3所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160或重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。所述重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160或重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中均含有序列表中序列5所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G或重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。所述重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G或重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有序列表中序列7所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)。所述重組微生物為將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到的重組菌。所述重組微生物具體可為將所述重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP、所述重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP、所述重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP或所述重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP導(dǎo)入出發(fā)微生物得到的重組菌。所述出發(fā)微生物可為根癌農(nóng)桿菌。所述根癌農(nóng)桿菌具體可為根癌農(nóng)桿菌GV3101。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均不包括繁殖材料。d1)或d2)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：d1)所述蛋白質(zhì)，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；d2)所述蛋白質(zhì)，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育發(fā)育性狀改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述發(fā)育性狀為株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小。上述應(yīng)用中，所述植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。上述應(yīng)用中，所述抗病性可為抗黃萎病。上述應(yīng)用中，所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強(qiáng)致病菌臨西2-1。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為方法一，包括在受體植物中過表達(dá)所述蛋白質(zhì)，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下表型：抗病性增加和/或葉柄長度增加和/或株高增加。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為方法二，包括向受體植物中導(dǎo)入抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的物質(zhì)，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下表型：抗病性降低和/或株高減少和/或第一節(jié)間距減小和/或第四節(jié)間距減小和/或第五節(jié)間距減小和/或株型緊湊和/或第一果枝夾角減小和/或第二果枝夾角減小和/或第三果枝夾角減小和/或葉柄長度減少和/或棉纖維長度減少。所述株高減少具體體現(xiàn)在主莖的第一節(jié)間距、第四節(jié)間距和五節(jié)間距的減小。所述株型緊湊具體體現(xiàn)在主莖的第一果枝夾角、第二果枝夾角和三果枝夾角減小。上述方法中，編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子，具體可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；(b5)與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；(b6)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。序列表中序列1由942個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918個(gè)核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936個(gè)核苷酸組成，序列表中序列5的核苷酸編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939個(gè)核苷酸組成，序列表中序列7的核苷酸編碼序列表中序列8所示的氨基酸序列。上述方法一中，所述“在受體植物中過表達(dá)所述蛋白質(zhì)”可通過向受體植物中導(dǎo)入編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子實(shí)現(xiàn)。所述“向受體植物中導(dǎo)入編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子”可通過向受體植物中導(dǎo)入重組載體甲實(shí)現(xiàn)；所述重組載體甲可為向載體插入編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體甲具體可為重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP。所述重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。上述方法二中，所述“抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的物質(zhì)”可為抑制編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子的表達(dá)的物質(zhì)。所述“抑制編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子的表達(dá)的物質(zhì)”可通過向受體植物中導(dǎo)入重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1和載體PTRV1實(shí)現(xiàn)。所述重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1具體可為向載體PTRV2的限制性內(nèi)切酶PstⅠ的識別序列間插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。上述方法中，所述受體植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。上述方法中，所述抗病性可為抗黃萎病。上述方法中，所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強(qiáng)致病菌臨西2-1。上文中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述核酸分子轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖所述核酸分子，也可用常規(guī)育種技術(shù)將所述核酸分子轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)及其編碼基因能調(diào)控植物抗黃萎病性和發(fā)育性狀(如株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小)：向擬南芥中導(dǎo)入蛋白質(zhì)的編碼基因，得到葉柄長度增加和抗黃萎病性增加的轉(zhuǎn)基因植物；向徐州142或陸地棉TM-1中導(dǎo)入抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的物質(zhì)，得到株高減少、株型緊湊、棉纖維長度減少和抗黃萎病性降低的轉(zhuǎn)基因植物。因此，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)對培育抗黃萎病的植物具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。附圖說明圖1為實(shí)施例2步驟三中2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為實(shí)施例2步驟三中3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3為實(shí)施例3步驟三中1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為實(shí)施例3步驟三中2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為實(shí)施例3步驟三中3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。擬南芥bri1-5記載于如下文獻(xiàn)中：XueluWang，XiaoqingLi，Ji11Mwisenhelder，TonyHunter，ShigeoYoshida，TadaoAsami，andJoanneChory.AutoregulationandHomodimerizationAreInvolvedintheActivationofthePlantSteroidReceptorBRI1.Deve1opmentCe11，2005年第8期855-865.公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)。在下文中，擬南芥bri1-5簡稱bri1-5。陸地棉TM-1記載于如下文獻(xiàn)中：TronlinderNLetal，1989，PlantCellRep8:133-136.。徐州142記載于如下文獻(xiàn)中：于曉紅等，2000，中國科學(xué)(C輯)，30(5)：517-522。陸地棉TM-1和徐州142均為國家棉花種質(zhì)資源中期庫的產(chǎn)品。在下文中，陸地棉TM-1簡稱為TM-1，徐州142簡稱為Xu-142。根癌農(nóng)桿菌GV3101記載于如下文獻(xiàn)中：鄭銀英，崔百明，常明進(jìn)，彭明.轉(zhuǎn)擬南芥ICE1基因增強(qiáng)煙草抗寒性的研究.西北植物學(xué)報(bào).2009年29卷1期.75-79.公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)。載體PTRV1和載體PTRV2均記載于如下文獻(xiàn)中：DongY，Burch-SmithTM，LiuY，MamillapalliP，Dinesh-KumarSP.Aligation-independentcloningtobaccorattlevirusvectorforhigh-throughputvirus-inducedgenesilencingidentifiesrolesforNbMADS4-1and-2infloraldevelopment.Plantphysiol.2007年145期.1161-1170.公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)。載體pENTR/SD/D-TOPO和載體pMDC83均為Invitrogen公司產(chǎn)品。PDA培養(yǎng)基：去皮的馬鈴薯200g切成小塊，加入1L蒸餾水煮沸30分鐘，過濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20g和瓊脂1g，用蒸餾水定容至1L，pH值自然，121℃高壓滅菌15min。查氏液體培養(yǎng)基：將硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、MgSO4·7H2O0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g和瓊脂15g溶于蒸餾水，用蒸餾水定容至1000mL。黃萎病強(qiáng)致病菌臨西2-1記載于如下文獻(xiàn)中：王國寧，趙貴元，岳曉偉，李志坤，張艷，張桂寅，吳立強(qiáng)，王省芬，馬峙英,河北省棉花黃萎病菌致病性與ISSR遺傳分化，棉花學(xué)報(bào)，2012，24(4)：348-357.在下文中，黃萎病強(qiáng)致病菌臨西2-1簡稱為臨西2-1。侵染溶液：含10mMMES、10mMMgCl2和200mM乙酰丁香酮的水溶液。實(shí)施例1、蛋白GhBZR1的編碼基因和GhBZR1突變蛋白的編碼基因的克隆一、蛋白GhBZR1的編碼基因的克隆本發(fā)明的發(fā)明人從陸地棉TM-1中克隆出蛋白GhBZR1的編碼基因，即GhBZR1基因。1、采用Trizo1法提取生長至14天的陸地棉TM-1幼苗的葉片的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。2、人工合成引物F：5'-CACCATGACGTCAGATGGGGCGACGT-3'和R：5'-ACATCGAGCTTTCCCACTTCCG-3'。3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4、將雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1。根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(以下簡稱蛋白質(zhì)GhBZR1或蛋白GhBZR1)。二、GhBZR1突變蛋白的編碼基因的克隆GhBZR1突變蛋白具體為蛋白△GhBZR1、蛋白GhBZR1△I160和蛋白GhBZR1S163G。1、蛋白△GhBZR1的編碼基因的克隆1)人工合成引物F△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'和R△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'。2)完成步驟1)后，以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以R△GhBZR和步驟一中2合成的F為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子1；以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以F△GhBZR和步驟一中2合成的R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子2。3)將雙鏈DNA分子1和雙鏈DNA分子2按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約920bp的雙鏈DNA分子。4)將約920bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pGW-△GhBZR1。根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒pGW-△GhBZR1含有序列表中序列3所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因1)，表達(dá)序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)(以下簡稱突變體蛋白1或蛋白△GhBZR1)。序列表中序列3所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第475至495位核苷酸進(jìn)行了刪除。序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)與序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的唯一不同在于將后者的第159至165位的氨基酸殘基進(jìn)行了刪除。2、蛋白GhBZR1△I160的編碼基因的克隆1)人工合成引物F△I160：5'-TCTCTGCCTCCTCTCAGATCTAATAGTGCCCCCGTG-3'和R△I160：5'-CACGGGGGCACTATTAGATCTGAGAGGAGGCAGAGA-3'。2)完成步驟1)后，以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以R△I160和步驟一中2合成的F為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子3；以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以F△I160和步驟一中2合成的R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子4。3)將雙鏈DNA分子3和雙鏈DNA分子4按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4)將約940bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160。根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160含有序列表中序列5所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因2)，表達(dá)序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)(以下簡稱突變體蛋白2或蛋白GhBZR1△I160)。序列表中序列5所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第478至480位核苷酸進(jìn)行了刪除。序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)與序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的唯一不同在于將后者的第160位的異亮氨酸殘基進(jìn)行了刪除。3、蛋白GhBZR1S163G的編碼基因的克隆1)人工合成引物FS163G：5'-ATCTCTAATGGTGCCCCCGTG-3'和RS163G：5'-CACGGGGGCACCATTAGAGAT-3'。2)完成步驟1)后，以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以RS163G和步驟一中2合成的F為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子5；以重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1為模板，以F163G和步驟一中2合成的R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子6。3)將雙鏈DNA分子5和雙鏈DNA分子6按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4)將約940bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G。根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G含有序列表中序列7所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因3)，表達(dá)序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)(以下簡稱突變體蛋白3或蛋白GhBZR1S163G)。序列表中序列7所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第487位的A替換為了G。序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)與序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的唯一不同在于將后者的第163位的絲氨酸殘基替換為了甘氨酸殘基。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定一、重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP和GV3101/35S::GhBZR1-GFP的獲得將實(shí)施例1步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1和載體pMDC83進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。將LR反應(yīng)產(chǎn)物加入TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為目標(biāo)克隆，該目標(biāo)克隆中的質(zhì)粒為目標(biāo)質(zhì)粒，將該目標(biāo)質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白GhBZR1。將重組質(zhì)粒35S::GhBZR1-GFP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/35S::GhBZR1-GFP。2、重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP和GV3101/35S::△GhBZR1-GFP的獲得將實(shí)施例1步驟二中1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGW-△GhBZR1和載體pMDC83進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。將LR反應(yīng)產(chǎn)物加入TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為目標(biāo)克隆，該目標(biāo)克隆中的質(zhì)粒為目標(biāo)質(zhì)粒，將該目標(biāo)質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP中含有突變體基因1，表達(dá)突變體蛋白1。將重組質(zhì)粒35S::△GhBZR1-GFP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/35S::△GhBZR1-GFP。3、重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP的獲得將實(shí)施例1步驟二構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160和載體pMDC83進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。將LR反應(yīng)產(chǎn)物加入TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為目標(biāo)克隆，該目標(biāo)克隆中的質(zhì)粒為目標(biāo)質(zhì)粒，將該目標(biāo)質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中含有突變體基因2，表達(dá)突變體蛋白2。將重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1△I160-GFP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP。4、重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP的獲得將實(shí)施例1步驟二構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G和載體pMDC83進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。將LR反應(yīng)產(chǎn)物加入TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為目標(biāo)克隆，該目標(biāo)克隆中的質(zhì)粒為目標(biāo)質(zhì)粒，將該目標(biāo)質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有突變體基因3，表達(dá)突變體蛋白3。將重組質(zhì)粒pGW-GhBZR1S163G-GFP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP。5、GV3101/pMDC83的獲得將載體pMDC83導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/pMDC83。二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1、采用擬南芥花序浸花轉(zhuǎn)化法(記載于如下文獻(xiàn)中Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，將步驟一中1獲得的GV3101/35S::GhBZR1-GFP轉(zhuǎn)至擬南芥bri1-5中，獲得T1代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子。2、將步驟1獲得的T1代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)即為T1代轉(zhuǎn)GhBZR1基因陽性苗，T1代轉(zhuǎn)GhBZR1基因陽性苗收到的種子即為T2代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子。3、將步驟2篩選出的不同株系的T2代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，如果某株系中能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)的數(shù)目與不能夠正常生長的擬南芥(非抗性苗)的數(shù)目比例為3：1，則該株系為GhBZR1基因插入一個(gè)拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為T3代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子。4、將步驟3篩選出的T3代轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥種子再次播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，均為抗性苗的即為T3代純合轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥。將其中2個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)GhBZR1基因擬南芥株系分別命名為OEGhBZR11-2和OEGhBZR11-4，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/35S::△GhBZR1-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因1擬南芥，將其中2個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因1擬南芥株系分別命名為OE△GhBZR12-5和OE△GhBZR12-9，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因2擬南芥，將其中2個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因2擬南芥株系分別命名為OEGhBZR1△I1603-22和OEGhBZR1△I1603-26，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因3擬南芥，將其中2個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)突變體基因3擬南芥株系分別命名為OEGhBZR1△S163G4-7和OEGhBZR1△S163G4-13，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pMDC83，其它步驟均相同，得到T3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥的植株，簡稱轉(zhuǎn)空載體擬南芥。三、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定1、分別取OEGhBZR11-2的T3代種子、OEGhBZR11-4的T3代種子、OE△GhBZR12-5的T3代種子、OE△GhBZR12-9的T3代種子、OEGhBZR1△I1603-22的T3代種子、OEGhBZR1△I1603-26的T3代種子、OEGhBZR1△S163G4-7的T3代種子、OEGhBZR1△S163G4-13的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的T3代種子和擬南芥bri1-5的種子，種植于營養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)4周，依次得到OEGhBZR11-2的幼苗、OEGhBZR11-4的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OE△GhBZR12-9的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗、OEGhBZR1△I1603-26的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗。2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定(1)觀察步驟1各幼苗的表型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1中A。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗的表型無顯著差異。與轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗相比，OE△GhBZR12-5的幼苗、OE△GhBZR12-9的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗和OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗的葉柄變長，OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗的葉柄最長。(2)Real-TimePCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：①樣本的獲得取步驟1得到的OEGhBZR11-2的幼苗，放入液氮保存，得到樣本1。取步驟1得到的OEGhBZR11-4的幼苗，放入液氮保存，得到樣本2。取步驟1得到的OE△GhBZR12-5的幼苗，放入液氮保存，得到樣本3。取步驟1得到的OE△GhBZR12-9的幼苗，放入液氮保存，得到樣本4。取步驟1得到的OEGhBZR1△I1603-22的幼苗，放入液氮保存，得到樣本5。取步驟1得到的OEGhBZR1△I1603-26的幼苗，放入液氮保存，得到樣本6。取步驟1得到的OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗，放入液氮保存，得到樣本7。取步驟1得到的OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗，放入液氮保存，得到樣本8。取步驟1得到的擬南芥bri1-5的幼苗，放入液氮保存，得到樣本9。取步驟1得到的轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗，放入液氮保存，得到樣本10。②Real-TimePCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量采用Trizo1法提取樣本(樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、樣本5、樣本6、樣本7、樣本8、樣本9或樣本10)的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。將樣本1中GhBZR1基因的表達(dá)量作為1，其它樣本中GhBZR1基因的相對表達(dá)量見圖1中B：樣本2中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.8，樣本3中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.5，樣本4中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為1.4，樣本5中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.6，樣本6中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.4，樣本7中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.7，樣本8中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為1.6，樣本9中GhBZR1基因的相對表達(dá)量幾乎檢測不到。樣本10和樣本9中GhBZR1基因的表達(dá)量無顯著差異?？梢?，步驟(1)中幼苗的葉柄越長，則步驟(2)中相應(yīng)幼苗的GhBZR1基因的相對表達(dá)量越高。3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的黃萎病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)株系每次種植10株，具體步驟如下：(1)在PDA培養(yǎng)基上接種臨西2-1，25℃活化培養(yǎng)3～4天。(2)完成步驟(1)后，挑選單菌落，接種于查氏液體培養(yǎng)基，25℃、180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)3周，得到培養(yǎng)菌液。(3)完成步驟(2)后，取培養(yǎng)菌液，使用紗布過濾收集病原菌孢子，得到孢子菌液，孢子菌液中臨西2-1的濃度為106個(gè)/mL。(4)完成步驟(3)后，取轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗、擬南芥bri1-5的幼苗、OEGhBZR11-2的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗或OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗，采用根部接種的方法接種步驟(3)得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染溶液的幼苗作為對照)，每株擬南芥接種200μL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟(4)的第五天，觀察記錄擬南芥的黃萎病發(fā)病情況，并按照黃萎病病級劃分標(biāo)準(zhǔn)(記載于如下文獻(xiàn)中：Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24,348-357)進(jìn)行病級調(diào)查比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(A為擬南芥的生長狀態(tài)，CK為接種侵染溶液，處理為接種孢子菌液；B為病級調(diào)查比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗的黃萎病病級無顯著差異。與擬南芥bri1-5的幼苗相比，OEGhBZR11-2的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗和OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗對黃萎病的抗性均顯著增強(qiáng)?？梢姡跀M南芥bri1-5中過表達(dá)GhBZR1基因、突變體基因1、轉(zhuǎn)突變體基因2或轉(zhuǎn)突變體基因3均可提高擬南芥bri1-5對黃萎病的抗性。實(shí)施例3、棉花沉默株的獲得及鑒定一、重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1的構(gòu)建和重組農(nóng)桿菌的獲得1、采用Trizo1法提取生長至14天的陸地棉TM-1幼苗的葉片的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。2、人工合成引物F1：5'-CGACGACAAGACCCTCACCACTTATCGAAAGGG-3'和R1：5'-GAGGAGAAGAGCCCTATTTCTGGAGGTTGGAG-3'。3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以F1和R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后純化、回收，得到約300bp的雙鏈DNA分子。4、將步驟3中得到雙鏈DNA分子置于含有dATP的T4DNA合成酶緩沖液中，22℃處理30min，然后70℃放置20min，得到片段甲。5、將載體PTRV2用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切8h，回收酶切產(chǎn)物。將該酶切產(chǎn)物置于含有dTTP的T4DNA合成酶緩沖液中，22℃處理30min，然后70℃放置20min，得到載體骨架。6、將片段甲和載體骨架混合，65℃連接2min，得到重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1。根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1為向載體PTRV2的限制性內(nèi)切酶PstⅠ的識別序列間插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。將重組質(zhì)粒PTRV2-GhBZR1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/PTRV2-GhBZR1。將載體PTRV1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/PTRV1。二、棉花沉默株的獲得1、取GV3101/PTRV2-GhBZR1的單菌落，接種至4mL含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)菌液1。2、完成步驟1后，取培養(yǎng)菌液1，按體積比為1：100接種至含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)6h，得到培養(yǎng)菌液2。培養(yǎng)菌液2的0D600為0.5左右。3、完成步驟1后，取培養(yǎng)菌液2，5000rpm離心5min，得到沉淀1，然后用50mL侵染溶液重懸，得到侵染液甲。4、將步驟1～3中的GV3101/PTRV2-GhBZR1替換為GV3101/PTRV1，其它步驟均不變，得到侵染液乙。5、將步驟3得到的侵染液甲和步驟4得到的侵染液乙混合(體積比為1:1)，得到侵染工作液；用該侵染工作液侵染生長至10天的陸地棉TM-1幼苗的子葉，得到10株陸地棉TM-1擬沉默株，依次將其命名為T1～T10。6、完成步驟5兩周后，采用Trizo1法分別提取10株陸地棉TM-1擬沉默株和生長至24天的陸地棉TM-1幼苗的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。以該cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陸地棉TM-1幼苗的GhBZR1基因的表達(dá)量相比，T1、T3、T5和T8中GhBZR1基因的表達(dá)量均顯著降低。因此，T1、T3、T5和T8均為陸地棉TM-1沉默株。以T1、T3、T5和T8為研究材料進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，在下文統(tǒng)一命名為VIGS-GhBZR1。按照上述方法，將步驟5中陸地棉TM-1替換為徐州142，得到徐州142沉默株。徐州142沉默株在下文稱為VIGS-GhBZR1-Xu142。三、陸地棉TM-1沉默株的表型鑒定和黃萎病抗性鑒定1、陸地棉TM-1沉默株現(xiàn)蕾期的表型鑒定(1)觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1現(xiàn)蕾期的表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：自現(xiàn)蕾期開始，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1表現(xiàn)出主要由主莖的第一、四、五節(jié)間距縮短引起的植株矮化(即株高降低)(圖3中A、B和C，CK為陸地棉TM-1，1st為第一節(jié)間距，2nd為第二節(jié)間距，3rd為第三節(jié)間距，4th為第四節(jié)間距，5th為第五節(jié)間距，6th為第六節(jié)間距)、主要由主莖的第一、二、三果枝的夾角減小引起的株型緊湊(圖3中D，CK為陸地棉TM-1，1st為第一果枝的夾角，2nd為第二果枝的夾角，3rd為第三果枝的夾角)和葉柄變短(見圖3中E，CK為陸地棉TM-1)。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：①樣本的獲得取處于現(xiàn)蕾期的VIGS-GhBZR1的幼嫩葉片，放入液氮保存，得到樣本1。取處于現(xiàn)蕾期的陸地棉TM-1的幼嫩葉片，放入液氮保存，得到樣本2。②實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量采用Trizo1法提取樣本1或樣本2的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。將樣本2中GhBZR1基因的表達(dá)量作為1，樣本1中GhBZR1基因的相對表達(dá)量見圖3中F。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.35。(3)葉柄細(xì)胞的電鏡掃描和實(shí)時(shí)定量PCR檢測苯丙烷代謝相關(guān)酶類的九個(gè)基因的表達(dá)量對陸地棉TM-1或VIGS-GhBZR1的葉柄細(xì)胞進(jìn)行電鏡掃描。結(jié)果表明(圖3中G)，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的葉柄細(xì)胞變短。細(xì)胞壁是植物細(xì)胞特有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由初生壁與次生壁組成，其中次生壁的合成影響著細(xì)胞的大小。在次生壁的木質(zhì)素合成過程中，苯丙烷的代謝起了重要作用。對陸地棉TM-1或VIGS-GhBZR1中的苯丙烷代謝相關(guān)酶類的九個(gè)基因(GhPAL1基因、GhC4H1基因、Gh4CL1基因、GhC3H1基因、GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因和GhExp1基因，上述基因均記載于如下文獻(xiàn)中：Xu,L.，Zhu,L.，Tu,L.，Liu,L.，Yuan,D.，Jin,L.，Long,L.，andZhang,X.(2011)LigninmetabolismhasacentralroleintheresistanceofcottontothewiltfungusVerticilliumdahliaeasrevealedbyRNA-Seq-dependenttranscriptionalanalysisandhistochemistry.J.Exp.Bot.62，5607-5621.)的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因的表達(dá)均受到不同程度的抑制(圖3中H)。鑒定GhPAL1基因的引物為5’-CCTGGGTCAATCTTTGCTTC-3’和5’-AGGTCTCACCACCGAGTTTC-3’；鑒定GhC4H1基因的引物為5’-GATGCAAAGCTTGGTGGGTATGAC-3’和5’-ACTTGTTAAATCAAAACACCCTTGGCTT-3’；鑒定Gh4CL1基因的引物為5’-AATCATCAAATTCAAAGGCTTTCAAGTG-3’和5’-AGGCGTTGCAATTTAAAAGCCAAATAGATTA-3’；鑒定GhC3H1基因的引物為5’-ACTCTTCAGGGTCCTTCCAC-3’和5’-GAGGCTGCTCGTGTAGTGG-3’；鑒定GhCCoAOMT1基因的引物為5’-AAAGAAGGGCCTGCAATGCCAGTT-3’和5’-GGTAACGGTGGTTCATTTGAGGCGA-3’；鑒定GhCCR1基因的引物為5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’和5’-GTAGATTCTGCCTTCTCCCAAC-3’；鑒定GhF5H1基因的引物為5’-CGACGGTAGCATAGAACATCC-3’和5’-CAACAAGCAAGATCATTGACCT-3’；鑒定GhCOMT基因的引物為5’-CTTCCTGATTACCCCGACC-3’和5’-TAATTCCAGAAAATCCACCTTTT-3’；鑒定GhCAD6基因的引物為5’-GCTTCCAGCAACATCCACGAC-3’和5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’；鑒定GhExp1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’。2、陸地棉TM-1沉默株的棉鈴和棉纖維的表型鑒定(1)觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉鈴和棉纖維的表型觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉鈴和棉纖維，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：與陸地棉TM-1相比，結(jié)鈴期時(shí)VIGS-GhBZR1的棉鈴生長受到抑制(圖4中A，CK為陸地棉TM-1)；與陸地棉TM-1相比，棉纖維成熟后，VIGS-GhBZR1的棉纖維變短，即棉纖維長度減少(圖4中B和C，CK為陸地棉TM-1)。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達(dá)量GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因(記載于如下文獻(xiàn)中：WangJ，WangH，ZhaoP，HanL，JiaoG，ZhengY，HuangS，XiaG(2010)OverexpressionofaProfilin(GhPFN2)PromotestheProgressionofDevelopmentalPhasesinCottonFibersPlantCellPhysiol.51(8)：1276-1290)均為已知的與纖維相關(guān)的基因。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：①樣本的獲得取VIGS-GhBZR1的開花授粉3天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本1。取陸地棉TM-1的開花授粉3天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本2。取VIGS-GhBZR1的開花授粉15天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本3。取陸地棉TM-1的開花授粉15天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本4。②實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達(dá)量采用Trizo1法提取樣本(樣本1、樣本2、樣本3或樣本4)的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，以5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’為引物，實(shí)時(shí)定量PCR檢測GhBZR1基因的表達(dá)量。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhExp1基因，得到GhExp1基因的表達(dá)量。鑒定GhExp1基因的引物為5’-GAGGGAGCCATTGACAACATCTT-3’和5’-GCGAACAGTTCACAGCTATGTTCA-3’。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhPFN基因，得到GhPFN基因的表達(dá)量。鑒定GhPFN基因的引物為5’-ACCTTTCTGCCGCTGCTATCG-3’和5’-CGCCCAACCTCTCCACAACC-3’。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhTBU1基因，得到GhTBU1基因的表達(dá)量。鑒定GhTBU1基因的引物為5’-AAGGAAGCCGAGAATTGCGATTG-3’和5’-CGAGGGAATGGAATAAGGTTTACAGC-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達(dá)均受到不同程度的抑制(圖4中D)。開花授粉3天后的棉纖維中：將陸地棉TM-1中GhBZR1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.4；將陸地棉TM-1中GhExp1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相對表達(dá)量約為0.2；將陸地棉TM-1中GhPFN基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相對表達(dá)量約為0.1；將陸地棉TM-1中GhTBU1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的相對表達(dá)量約為0.2。開花授粉15天后的棉纖維中：將陸地棉TM-1中GhBZR1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達(dá)量約為0.5；將陸地棉TM-1中GhExp1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相對表達(dá)量約為0.1；將陸地棉TM-1中GhPFN基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相對表達(dá)量約為0.3；將陸地棉TM-1中GhTBU1基因的表達(dá)量作為1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的表達(dá)量幾乎檢測不到。3、棉花沉默株的黃萎病抗性鑒定(1)陸地棉TM-1沉默株的黃萎病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)株系每次種植10株，具體步驟如下：①同實(shí)施例2步驟三3中(1)。②同實(shí)施例2步驟三3中(2)。③同實(shí)施例2步驟三3中(3)。④完成步驟③后，取25℃、培養(yǎng)4周的VIGS-GhBZR1的幼苗和陸地棉TM-1幼苗，采用莖部接種的方法接種步驟③得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染培養(yǎng)基的作為對照)，每株棉花幼苗接種10mL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟④的第五周，觀察記錄棉花的黃萎病發(fā)病情況并計(jì)算致病系數(shù)(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24，348-357.)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5(A為接種孢子菌液的單株棉花的葉片，TM-1為陸地棉TM-1；B為接種孢子菌液的致病系數(shù)，TM-1為陸地棉TM-1)。結(jié)果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的葉片嚴(yán)重黃化甚至枯萎，致病系數(shù)較高，對黃萎病的抗性也顯著降低。(2)徐州142沉默株的黃萎病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)株系每次種植10株，具體步驟如下：①同實(shí)施例2步驟三3中(1)。②同實(shí)施例2步驟三3中(2)。③同實(shí)施例2步驟三3中(3)。④完成步驟③后，取25℃、培養(yǎng)4周的VIGS-GhBZR1-Xu142的幼苗和徐州142的幼苗，采用莖部接種的方法接種步驟③得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染溶液的作為對照)，每株棉花幼苗接種10mL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟④的第五周，觀察記錄棉花的黃萎病發(fā)病情況并計(jì)算致病系數(shù)(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24，348-357.)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中C。結(jié)果表明，與徐州142相比，VIGS-GhBZR1-Xu142的致病系數(shù)較高，對黃萎病的抗性也顯著降低。上述結(jié)果表明，在徐州142或陸地棉TM-1中沉默GhBZR1基因均可降低其對黃萎病的抗性。當(dāng)前第1頁1 2 3