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一種整合缺陷型慢病毒載體、其制備方法及應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):11126107閱讀:來源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種整合缺陷型慢病毒載體,其特征在于,所述慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位堿基編碼的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼岷?或在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4328-4830位堿基編碼的組氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體,其特征在于,所述苯丙氨酸突變?yōu)楸彼崾峭ㄟ^pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位的堿基由CA突變?yōu)镚C。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的慢病毒載體,其特征在于,所述組氨酸突變?yōu)楸彼崾峭ㄟ^pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4828-4830位的堿基由TT突變?yōu)镚C。

4.一種重組慢病毒,其特征在于,如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的慢病毒載體與pFUGW表達(dá)載體及包膜載體pVSV-G載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。

5.一種宿主細(xì)胞,其特征在于,包括如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的慢病毒載體或如權(quán)利要求4所述的重組慢病毒;

優(yōu)選地,所述宿主細(xì)胞為293T、293FT或293LTV中的任意一種或至少兩種的組合,優(yōu)選為293T細(xì)胞。

6.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的慢病毒載體的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物,以pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增,得到一個(gè)突變的基因片段;

任選地,(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的基因片段作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,得到具有兩個(gè)突變的基因片段;

(3)將步驟(1)或步驟(2)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒中,構(gòu)建重組質(zhì)粒;

(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽(yáng)性克隆。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.1-6所示的序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法,其特征在于,步驟(2)擴(kuò)增的引物為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6所示的序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)所述將擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的Acc65I和EcoRI克隆位點(diǎn)。

10.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的慢病毒載體或如權(quán)利要求4所述的重組慢病毒在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

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