本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種DNA測序方法。
背景技術(shù)：
：DNA是遺傳信息的載體，其內(nèi)四種堿基對的特定排列順序是遺傳信息的本質(zhì)所在。確定DNA中堿基對的特定排列順序被稱為DNA測序，其對于揭示生命奧秘、控制遺傳過程、推動疾病診斷、提升醫(yī)療技術(shù)有著根本的促進作用。迄今為止，先后已經(jīng)有兩代測序技術(shù)被成功研發(fā)并得到廣泛應(yīng)用：第一代基于雙脫氧鏈終止法的測序技術(shù)打開了人類揭示遺傳奧秘的大門，奠定了基因工程最為重要的基礎(chǔ)；第二代大規(guī)模平行合成熒光檢測法，則是在第一代測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用PCR擴增及熒光檢測技術(shù)，該方法在很大程度上提高了測序的效率，為第一個人類基因組測序的完成做出了巨大貢獻。盡管前兩代測序技術(shù)發(fā)展的很成熟，但是仍舊有許多弊端亟待解決，如PCR擴增耗時長成本高，熒光標記及檢測過程復(fù)雜不穩(wěn)定等等。同時，隨著人類對生命本質(zhì)的理解加深和醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)手段的不斷進步，個性化治療方案及分子診斷逐漸成為熱點，這對DNA測序提出了更高的要求。因此，如何快速、準確、低成本進行DNA測序已經(jīng)成為炙手可熱的研究領(lǐng)域。目前相對成熟的DNA測序技術(shù)是基于納米孔的電學測試平臺，甚至已經(jīng)有商業(yè)化測試儀原型出現(xiàn)，但還存在諸多缺陷，如DNA移動速度難以控制、測序信號分辨率低、測序不準確等等，使基于此方法的測序技術(shù)的發(fā)展陷入瓶頸。隨著各種新型納米材料的不斷涌現(xiàn)，以及微納加工技術(shù)的不斷升級進步，具有單分子檢測能力的器件平臺迅猛發(fā)展，為DNA測序的持續(xù)推進提供源源不斷的動力和機會。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何進行DNA測序。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了DNA測序方法。本發(fā)明所提供的DNA測序方法具體可為方法一，依次可包括如下步驟：(1)在待測DNA的3’末端增加標簽序列，形成含有標簽序列的待測DNA；所述標簽序列的核苷酸序列與測序引物的核苷酸序列反向互補；(2)將所述含有標簽序列的待測DNA和所述測序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個體系，分別將每個體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號，與其它三個體系的電信號顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測DNA的3’末端的第一個核苷酸；a2)所述待測DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2。本發(fā)明所提供的DNA測序方法具體可為方法二，依次可包括如下步驟：(1)在待測DNA的3’末端增加標簽序列，形成含有標簽序列的待測DNA；所述標簽序列的核苷酸序列與測序引物的核苷酸序列反向互補；(2)將所述含有標簽序列的待測DNA和所述測序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個體系，分別將每個體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號，與其它三個體系的電信號顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測DNA的3’末端的第一個核苷酸；a2)所述待測DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2；(4)將前一步驟中與其它三個體系的電信號顯著不同的體系的產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個體系，分別將每個體系加入所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號，與其它三個體系的電信號顯著不同的體系中的dNTP即為b1)或b2)：b1)所述待測DNA的3’末端的第二個核苷酸；b2)所述待測DNA的3’末端的第二區(qū)段的核苷酸；所述第二區(qū)段由M個核苷酸組成，M為自然數(shù)且大于等于2。本發(fā)明所提供的DNA測序方法具體可為方法三，依次可包括如下步驟：(1)在待測DNA的3’末端增加標簽序列，形成含有標簽序列的待測DNA；所述標簽序列的核苷酸序列與測序引物的核苷酸序列反向互補；(2)將所述含有標簽序列的待測DNA和所述測序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個體系，分別將每個體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號，與其它三個體系的電信號顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測DNA的3’末端的第一個核苷酸；a2)所述待測DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2；(4)將前一步驟中與其它三個體系的電信號顯著不同的體系的產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個體系，分別將每個體系加入所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號，與其它三個體系的電信號顯著不同的體系中的dNTP即為b1)或b2)：b1)所述待測DNA的3’末端的第二個核苷酸；b2)所述待測DNA的3’末端的第二區(qū)段的核苷酸；所述第二區(qū)段由M個核苷酸組成，M為自然數(shù)且大于等于2；(5)重復(fù)步驟(4)，直至獲得所述待測DNA的測序結(jié)果。上述DNA測序方法中，所述a2)中，N具體可為50。上述DNA測序方法中，所述b2)中，M具體可為50。上述DNA測序方法中，所述待測DNA為單鏈DNA。當待測DNA為雙鏈DNA時，需先變性，再和所述測序引物混合。上述DNA測序方法中，所述測序引物的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第51至68位所示。上述DNA測序方法中，所述單分子器件可為以低維納米材料或單個分子為傳感核心的超靈敏電學測序器件。所述單分子器件可以是現(xiàn)有技術(shù)中任何能響應(yīng)單分子變化的器件，即本領(lǐng)域技術(shù)人員通過檢測或觀察該單分子器件的變化，便能知曉相應(yīng)的分子是否發(fā)生變化。以本發(fā)明為例，本發(fā)明使用了單分子器件，具體使用了以石墨烯或硅納米線作為電極的單分子器件，并使其與所述特異DNA聚合酶連接，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過檢測該單分子器件的電流變化，就可知曉所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象是否發(fā)生了變化。上述DNA測序方法中，所述單分子器件具體可為c1)或c2)或c3)或c4)：c1)石墨烯基單分子器件；c2)硅納米線單分子器件；c3)一維納米材料單分子器件；c4)低維納米材料單分子器件。所述石墨烯基單分子器件和所述硅納米線單分子器件的制備過程均可參考文獻(CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.)中記載的方法。所述特異DNA聚合酶和所述單分子器件的連接方式，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知公用的任何方式，只要保證所述特異DNA聚合酶的活性和構(gòu)象變化即可。所述特異DNA聚合酶和所述石墨烯基單分子器件的連接方式具體可按照下述步驟進行：(1)制備所述石墨烯基單分子器件；(2)將所述石墨烯基單分子器件和對苯二胺混合，得到末端被氨基修飾的石墨烯電極；(3)將1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene和所述末端被氨基修飾的石墨烯電極混合，得到電學回路；(4)將所述電學回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽混合，得到Sulfo-NHS活化的電學回路；(5)將所述Sulfo-NHS活化的電學回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽混合，得到處理后的石墨烯基單分子器件；(6)將所述處理后的石墨烯基單分子器件和過量的所述特異DNA聚合酶混合，得到特異DNA聚合酶修飾的石墨烯基單分子器件。所述特異DNA聚合酶和所述硅納米線單分子器件的連接方式具體可按照下述步驟進行：(1)制備所述硅納米線單分子器件；(2)將所述硅納米線單分子器件和HF溶液混合，得到刻蝕的硅納米線單分子器件；所述HF溶液由7體積份的40％(質(zhì)量百分比)的NH4F水溶液和1體積份的HF水溶液混合而成，其中HF水溶液的濃度為40％(質(zhì)量百分比)，具體可為北京化工廠的產(chǎn)品。(3)將所述刻蝕的硅納米線單分子器件和10—十一碳炔酸混合，得到電學回路；(4)將步驟(3)所述電學回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽混合，得到Sulfo-NHS活化的電學回路；(5)將步驟(4)所述Sulfo-NHS活化的電學回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽混合，得到處理后的硅納米線單分子器件；(6)將所述處理后的硅納米線單分子器件和過量的所述特異DNA聚合酶混合，得到酶修飾的硅納米線單分子器件。上述DNA測序方法中，所述特異DNA聚合酶滿足如下條件：(1)具有DNA聚合酶的生物活性；(2)與所述單分子器件進行連接且僅有一個連接位點，提供該連接位點的氨基酸殘基位于所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化區(qū)；(3)提供該連接位點的氨基酸殘基在所述特異DNA聚合酶中僅出現(xiàn)一次。所述“與所述單分子器件進行連接且僅有一個連接位點，提供該連接位點的氨基酸殘基位于所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化區(qū)”指的是只有一個氨基酸殘基與單分子器件連接，且不影響所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化。所述“提供該連接位點的氨基酸殘基在所述特異DNA聚合酶中僅出現(xiàn)一次”指的是：為了保證只有唯一一個連接位點，若所述特異DNA聚合酶中除了該連接位點外，在其它位置還有與該連接位點一致的氨基酸或氨基酸序列，則需將其它位置的氨基酸或氨基酸序列進行修飾或突變，以防止其它位置的氨基酸或氨基酸序列與單分子器件連接。如果所述特異DNA聚合酶中，除了該唯一連接位點外，其余位置沒有與該唯一連接位點一致的氨基酸或氨基酸序列，則無需將其它位置的氨基酸或氨基酸序列進行修飾或突變。所述修飾或突變指的是在不改變所述特異DNA聚合酶活性和構(gòu)象變化的情況下，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)知識，進行的修飾或突變，如本發(fā)明中，將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸殘基。所述DNA聚合酶可為大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的氨基酸序列可如序列表中序列1所示，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。上述DNA測序方法中，所述特異DNA聚合酶可用微腔包被。所述微腔的材質(zhì)可為聚二甲基硅氧烷。每一個特異DNA聚合酶用一個所述微腔包被。上述DNA測序方法中，所述特異DNA聚合酶可為b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；b2)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；b3)將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為非半胱氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢?，得到的蛋白質(zhì)。所述b3)具體可為將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢?，得到的蛋白質(zhì)。所述特異DNA聚合酶與所述單分子器件的連接時，所述特異DNA聚合酶的連接位點為序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第790位的半胱氨酸。上述DNA測序方法中，所述讀取電信號是通過檢測所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化進行的。所述特異DNA聚合酶也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述DNA測序方法中，所述待測DNA為5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’、5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’、5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’或5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于DNA測序的試劑盒。本發(fā)明所提供的DNA測序的試劑盒，具體可為試劑盒甲，所述試劑盒甲可包括上述任一所述特異DNA聚合酶。上述試劑盒甲中，還可包括所述測序引物。上述試劑盒甲中，還可包括上述任一所述單分子器件。上述試劑盒甲中，還可包括記載有上述任一所述DNA測序方法的載體。本發(fā)明所提供的DNA測序的試劑盒，具體可為試劑盒乙，所述試劑盒乙可包括上述任一所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件。上述試劑盒乙中，還可包括所述測序引物。上述試劑盒乙中，還可包括記載有上述任一所述DNA測序方法的載體。實驗證明，本發(fā)明所提供的方法可進行DNA測序，測序結(jié)果顯示，DNA的合成速度與已有文獻(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。本發(fā)明所提供的DNA測序方法具有重要的應(yīng)用價值。附圖說明圖1為酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備。圖2為低分辨探針臺檢測電學性質(zhì)；其中Vsd為源漏偏壓，Isd為源漏電流。圖3為酶修飾的石墨烯基單分子器件和酶修飾的硅納米線單分子器件。圖4為半胱氨酸和處理后的石墨烯基單分子器件進行化學反應(yīng)的反應(yīng)式。圖5為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈C進行DNA測序的動力學數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計結(jié)果。圖6為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈C進行DNA測序的高態(tài)時間和低態(tài)時間的統(tǒng)計分析結(jié)果。圖7為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈A進行DNA測序的動力學數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計結(jié)果。圖8為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈A進行DNA測序的高態(tài)時間和低態(tài)時間的統(tǒng)計分析結(jié)果。圖9為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈G進行DNA測序的動力學數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計結(jié)果。圖10為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈G進行DNA測序的高態(tài)時間和低態(tài)時間的統(tǒng)計分析結(jié)果。圖11為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈T進行DNA測序的動力學數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計結(jié)果。圖12為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈T進行DNA測序的高態(tài)時間和低態(tài)時間的統(tǒng)計分析結(jié)果。圖13為酶修飾的硅納米線單分子器件的制備。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。DTT緩沖液為含50mMNaCl、10mMMgCl2和1mMDTT的pH7.8、10mMTris－HCl緩沖液。HF溶液：由7體積份的40％(質(zhì)量百分比)的NH4F水溶液和1體積份的HF水溶液混合而成；其中HF水溶液的濃度為40％(質(zhì)量百分比)，具體可為北京化工廠的產(chǎn)品。單鏈DNA分子甲：5’-(C)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列4所示)。單鏈DNA分子乙：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(序列表中序列5所示)。單鏈DNA分子丙：5’-(A)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列6所示)。單鏈DNA分子?。?’-(G)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列7所示)。單鏈DNA分子戊：5’-(T)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列8所示)。模板鏈C的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子甲(單鏈DNA分子甲的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈C。模板鏈C需在動力學測試前3h制備。模板鏈A的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子丙和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子丙(單鏈DNA分子丙的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈A。模板鏈A需在動力學測試前3h制備。模板鏈G的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子丁和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子丁(單鏈DNA分子丁的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈G。模板鏈G需在動力學測試前3h制備。模板鏈T的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子戊和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子戊(單鏈DNA分子戊的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈T。模板鏈T需在動力學測試前3h制備。低分辨探針臺由半導(dǎo)體參數(shù)儀(安捷倫公司的產(chǎn)品，型號為4155C)和探針臺(KarlSuess公司的產(chǎn)品，型號為PM5)兩個部分組成。高分辨探針臺由前置放大器(DigitalInstruments公司的產(chǎn)品，型號為DL1211)和鎖相放大器(ZurichInstruments公司的產(chǎn)品，型號為HF2LI)兩個核心部件組成。1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene為濟南恒化科技有限公司的產(chǎn)品。dATP溶液由DTT緩沖液溶解dATP獲得。dCTP溶液由DTT緩沖液溶解dCTP獲得。dTTP溶液由DTT緩沖液溶解dTTP獲得。dGTP溶液由DTT緩沖液溶解dGTP獲得。dATP、dCTP、dTTP和dGTP均為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。實施例1、采用石墨烯基單分子器件進行DNA測序一、酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備1、制備石墨烯基單分子器件石墨烯基單分子器件的制備過程參考如下文獻：CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.石墨烯基單分子器件上具有納米間隙的石墨烯電極(以下簡稱石墨烯電極，其結(jié)構(gòu)式如圖1中(1))。2、末端氨基修飾完成步驟1后，將所述石墨烯基單分子器件和對苯二胺(見圖1中(2))混合，得到末端被氨基修飾的石墨烯電極。末端被氨基修飾的石墨烯電極的結(jié)構(gòu)式見圖1中(3)。3、電學回路的構(gòu)建完成步驟2后，將1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene(見圖1中(4))和末端被氨基修飾的石墨烯電極混合，得到電學回路。用低分辨探針臺檢測電學回路的電學性質(zhì)，結(jié)果見圖2中左上圖。電學回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(5)所示。4、NHS活化完成步驟3后，將電學回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(見圖1中(6))混合，得到Sulfo-NHS活化的電學回路。用低分辨探針臺檢測Sulfo-NHS活化的電學回路的電學性質(zhì)，結(jié)果見圖2中右上圖。NHS活化的電學回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(7)所示。5、處理后的石墨烯基單分子器件的獲得完成步驟4后，將Sulfo-NHS活化的電學回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽(見圖1中(8))混合，得到處理后的石墨烯基單分子器件。處理后的石墨烯基單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(9)所示。用低分辨探針臺檢測處理后的石墨烯基單分子器件的電學性質(zhì)，結(jié)果見圖2中左下圖。6、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的改造(1)改造原則大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(以下簡稱DNA聚合酶Ⅰ)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，核苷酸序列如序列表中序列2所示。改造后的DNA聚合酶Ⅰ需同時具有如下特點：(1)具有DNA聚合酶Ⅰ的生物活性，即指導(dǎo)DNA的合成；(2)改造后的DNA聚合酶Ⅰ可與處理后的石墨烯基單分子器件進行連接且僅有一個連接位點，提供該連接位點的氨基酸殘基(命名為供體氨基酸殘基)應(yīng)位于改造后的DNA聚合酶Ⅰ的構(gòu)象變化區(qū)(目的為提高后續(xù)DNA測序的靈敏度)；(3)供體氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸和非提供連接位點的氨基酸殘基(命名為非供體氨基酸殘基)對應(yīng)的氨基酸種類不同。(2)改造后的DNA聚合酶Ⅰ的獲得經(jīng)過大量實驗，得到改造后的DNA聚合酶Ⅰ。改造后的DNA聚合酶Ⅰ(氨基酸序列如序列表中序列3所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司制備。改造后的DNA聚合酶Ⅰ為將DNA聚合酶Ⅰ(氨基酸序列如序列表中序列1所示)自N末端起第907位的半胱氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢Ｐ蛄斜碇行蛄?自N末端起第790位氨基酸殘基位于構(gòu)象變化區(qū)。7、酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備完成步驟6后，將處理后的石墨烯基單分子器件和過量的改造后的DNA聚合酶Ⅰ(見圖1中(10))混合，得到酶修飾的石墨烯基單分子器件(圖3中左圖)，酶修飾的石墨烯基單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式見圖1中(11)。用低分辨探針臺檢測酶修飾的石墨烯基單分子器件的電學性質(zhì)，結(jié)果見圖2中右下圖。改造后的DNA聚合酶Ⅰ中半胱氨酸和處理后的石墨烯基單分子器件進行化學反應(yīng)的反應(yīng)式見圖4。將制備的酶修飾的石墨烯基單分子器件置于低分辨探針臺，觀察導(dǎo)電性，若具有導(dǎo)電性，則進行下述實驗。二、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈C進行DNA測序1、取酶修飾的石墨烯基單分子器件，將改造后的DNA聚合酶Ⅰ的區(qū)域用體積為40μL的微腔進行包被，微腔的材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，得到含有微腔的石墨烯基單分子器件。2、完成步驟1后，將含有微腔的石墨烯基單分子器件置于高分辨探針臺，采樣5min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)，實驗結(jié)果見圖5中A的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖5中A的右圖。3、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入10μLDTT緩沖液，采樣5min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖5中B的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖5中B的右圖。4、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液，采樣5min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖5中C的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖5中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖5中D的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖5中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液和5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測試聚合酶在進行DNA合成時源漏電流隨時間的變化情況，亦即DNA聚合酶進行DNA聚合時的動力學數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果見圖5中E的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖5中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動力學數(shù)據(jù)與其它對照實驗中的動力學數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當體系中存在與模板鏈C以及與之匹配的脫氧核苷酸時，體系的動力學數(shù)據(jù)才能與其余四組對照實驗不同。7、將步驟6獲得的動力學數(shù)據(jù)拉展，采用Qub軟件選定相應(yīng)的高態(tài)電流(即大電流)及低態(tài)電流(即小電流)(圖6中A)。將高態(tài)電流對應(yīng)的高態(tài)時間(τhi)和低態(tài)電流對應(yīng)的低態(tài)時間(τlow)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果分別見圖6中B和C。根據(jù)平均低態(tài)時間和平均高態(tài)時間，計算得到本體系中DNA的合成速度是每秒62.62個dGTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。值得說明的是，這里提及的平均，并不是簡單意義上的線性平均，而是在指數(shù)分布基礎(chǔ)上的泊松平均，具體的計算過程，由MatLab軟件進行。表1模板鏈C模板鏈G模板鏈T模板鏈Aτlow(ms)0.1560.1220.7102.825τhi(ms)15.8136.8233.5853.575合成速度(個/秒)62.62143.99232.83156.25三、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈A進行DNA測序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動力學測試的實驗結(jié)果見圖7中A的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖7中A的右圖。3、同步驟二中3。動力學測試的實驗結(jié)果見圖7中B的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖7中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈A。動力學測試的實驗結(jié)果見圖7中C的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖7中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈A的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖7中D的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖7中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈A的DTT緩沖液和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測試聚合酶在進行DNA合成時源漏電流隨時間的變化情況，亦即DNA聚合酶進行DNA聚合時的動力學數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果見圖7中E的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖7中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動力學數(shù)據(jù)與其它對照實驗中的動力學數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當體系中存在與模板鏈A以及與之匹配的脫氧核苷酸時，體系的動力學數(shù)據(jù)才能與其余四組對照實驗不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對應(yīng)的高態(tài)時間(τhi)和低態(tài)電流對應(yīng)的低態(tài)時間(τlow)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果見圖8(左圖為低態(tài)時間，右圖為高態(tài)時間)。根據(jù)平均低態(tài)時間和平均高態(tài)時間，計算得到本體系中DNA的合成速度是每秒156.25個dTTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。四、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈G進行DNA測序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動力學測試的實驗結(jié)果見圖9中A的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖9中A的右圖。3、同步驟二中3。動力學測試的實驗結(jié)果見圖9中B的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖9中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈G。動力學測試的實驗結(jié)果見圖9中C的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖9中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈G的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖9中D的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖9中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈G的DTT緩沖液和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測試聚合酶在進行DNA合成時源漏電流隨時間的變化情況，亦即DNA聚合酶進行DNA聚合時的動力學數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果見圖9中E的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖9中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動力學數(shù)據(jù)與其它對照實驗中的動力學數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當體系中存在與模板鏈G以及與之匹配的脫氧核苷酸時，體系的動力學數(shù)據(jù)才能與其余四組對照實驗不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對應(yīng)的高態(tài)時間(τhi)和低態(tài)電流對應(yīng)的低態(tài)時間(τlow)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果見圖10(左圖為低態(tài)時間，右圖為高態(tài)時間)。根據(jù)平均低態(tài)時間和平均高態(tài)時間，計算得到本體系中DNA的合成速度是每秒143.99個dCTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。五、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈T進行DNA測序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動力學測試的實驗結(jié)果見圖11中A的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖11中A的右圖。3、同步驟二中3。動力學測試的實驗結(jié)果見圖11中B的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖11中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈T。動力學測試的實驗結(jié)果見圖11中C的左圖。峰值統(tǒng)計的實驗結(jié)果見圖11中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈T的DTT緩沖液、5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進行動力學測試(即測試源漏電流隨時間的變化情況)。實驗結(jié)果見圖11中D的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖11中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈T的DTT緩沖液和5μL的dATP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測試聚合酶在進行DNA合成時源漏電流隨時間的變化情況，亦即DNA聚合酶進行DNA聚合時的動力學數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果見圖11中E的左圖。然后采用MatLab軟件進行初步的峰值統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖11中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動力學數(shù)據(jù)與其它對照實驗中的動力學數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當體系中存在與模板鏈T以及與之匹配的脫氧核苷酸時，體系的動力學數(shù)據(jù)才能與其余四組對照實驗不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對應(yīng)的高態(tài)時間(τhi)和低態(tài)電流對應(yīng)的低態(tài)時間(τlow)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果見圖12(左圖為低態(tài)時間，右圖為高態(tài)時間)。根據(jù)平均低態(tài)時間和平均高態(tài)時間，計算得到本體系中DNA的合成速度是每秒232.83個dATP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。因此，采用酶修飾的石墨烯基單分子器件可進行DNA測序。實施例2、采用硅納米線單分子器件進行DNA測序一、酶修飾的硅納米線單分子器件的制備1、制備硅納米線單分子器件硅納米線單分子器件的制備過程參考如下文獻：CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.硅納米線單分子器件上具有納米間隙的硅納米線電極(以下簡稱硅納米線電極)。2、刻蝕完成步驟1后，將硅納米線單分子器件和HF溶液混合，得到刻蝕的硅納米線單分子器件。部分刻蝕的硅納米線單分子器件的結(jié)構(gòu)示意圖如圖13中(1)所示。3、電學回路的構(gòu)建完成步驟2后，將刻蝕的硅納米線單分子器件和10—十一碳炔酸(見圖13中(2))混合，得到電學回路。電學回路的部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖13中(3)所示。4、Sulfo-NHS活化完成步驟3后，將電學回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(見圖13中(4))混合，得到Sulfo-NHS活化的電學回路。Sulfo-NHS活化的電學回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖13中(5)所示。5、處理后的硅納米線單分子器件的獲得完成步驟4后，將Sulfo-NHS活化的電學回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽(見圖13中(6))混合，得到處理后的硅納米線單分子器件。處理后的硅納米線單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式如圖13中(7)所示。6、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的改造同實施例1步驟一中的6。7、酶修飾的硅納米線單分子器件的制備完成步驟6后，將處理后的硅納米線單分子器件和過量的改造后的DNA聚合酶Ⅰ(見圖7中(8))混合，得到酶修飾的硅納米線單分子器件(見圖3中右圖)。部分酶修飾的硅納米線單分子器件的結(jié)構(gòu)示意圖如圖7中(7)所示。將制備的酶修飾的硅納米線單分子器件置于低分辨探針臺，觀察導(dǎo)電性，若具有導(dǎo)電性，則進行下述實驗。二、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對模板鏈C進行DNA測序按照實施例1步驟二的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒65.30個dGTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈C進行DNA測序的結(jié)果無顯著差異。三、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對模板鏈A進行DNA測序按照實施例1步驟三的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒117.27個TTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈A進行DNA測序的結(jié)果無顯著差異。四、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對模板鏈G進行DNA測序按照實施例1步驟四的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒154.51個dCTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈G進行DNA測序的結(jié)果無顯著差異。五、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對模板鏈T進行DNA測序按照實施例1步驟五的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒234.60個dATP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對模板鏈T進行DNA測序的結(jié)果無顯著差異。因此，采用酶修飾的硅納米線單分子器件可進行DNA測序。當前第1頁1 2 3