本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體涉及一種腺苷脫氨酶檢測方法。

背景技術：

腺苷脫氨酶(ADA)是機體必需的核酸分解代謝酶，在臨床實驗診斷中具有重要價值。目前酶學檢測多采用酶偶聯原理的連續(xù)監(jiān)測法，測定樣本中酶的催化活性濃度，該方法具有簡便快速無毒無放射性的優(yōu)點，在臨床中廣泛應用。目前臨床ADA檢測方法雖均采用四步酶偶聯的檢測原理，但性能參差不齊，且不同廠家的試劑配方及檢測過程均存在差異，不同系統(tǒng)間的檢測結果差異較大，且沒有統(tǒng)一的參考區(qū)間，不利于臨床檢測結果的一致化，給臨床診療帶來諸多困擾。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種腺苷脫氨酶的檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種腺苷脫氫酶的檢測試劑，由以下兩部分組成：

試劑1

試劑2

腺苷 10-14mmol/L；

EHSPT 1.5-2.5mmol/L。

優(yōu)選的，所述的腺苷脫氫酶檢測試劑由以下兩部分組成：

試劑1

試劑2

腺苷 11-13mmol/L；

EHSPT 1.8-2.2mmol/L。

優(yōu)選的，所述的腺苷脫氫酶檢測試劑由以下兩部分組成：

試劑1

試劑2

腺苷 12.2mmol/L；

EHSPT 2.0mmol/L。

優(yōu)選的，試劑1和試劑2均由Tris緩沖液或PBS配制得到。

優(yōu)選的，試劑1和試劑2由Tris緩沖液配制得到，其中Tris緩沖液的濃度為65-95mmol/L，pH6-7。

優(yōu)選的，試劑1和試劑2由Tris緩沖液配制得到，其中Tris緩沖液的濃度為70-90mmol/L，pH6.2-6.8。

優(yōu)選的，試劑1和試劑2由Tris-HCl緩沖液配制得到，其中Tris-HCl緩沖液的濃度為80.0mmol/L，pH6.6。

Tris緩沖液包括Tris-HCl和Tris-base。Tris的緩沖體系比PBS緩沖體系效果更佳。最佳的是Tris-HCl緩沖液，其濃度為80.0mmol/L，pH6.6。

優(yōu)選的，穩(wěn)定劑選自NaN₃，其終濃度為0.1-0.3mmol/L。

優(yōu)選的，穩(wěn)定劑選自NaN₃，其終濃度為0.15-0.25mmol/L。

優(yōu)選的，穩(wěn)定劑選自NaN₃，其終濃度為0.2mmol/L。

優(yōu)選的，輔助因子選自TritonX-100，其加入量為試劑1總體積的0.6-0.9％。

優(yōu)選的，輔助因子選自TritonX-100，其加入量為試劑1總體積的0.7-0.8％。

優(yōu)選的，輔助因子選自TritonX-100，其加入量為試劑1總體積的0.76％。

輔助因子TritonX-100，也是一種表面活性劑，它可以快速消除非特異性反應，加快反應進程，是整個反應的催化劑。其他的表面活性劑如吐溫等無法達到本發(fā)明的效果。

優(yōu)選的，試劑1中還添加巰基保護劑EDTA，其終濃度為0.15-0.25mmol/L。

優(yōu)選的，試劑1中還添加巰基保護劑EDTA，其終濃度為0.2mmol/L。EDTA可保護被檢測的ADA蛋白活性。

上述反應中，磷酸氫二鈉可提供足夠磷酸根，保證反應順利進行。嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶是反應偶聯的工具酶，借助這幾個酶的中間反應，使目標酶反應生成的產物經系列反應最終生成利于檢測的有色物質。4-氨基安替比林和EHSPT為反應原理中最后一步的呈色反應底物。

一種腺苷脫氨酶的檢測試劑盒，包括上述任一項所述的試劑。

一種腺苷脫氨酶的檢測方法，包括下列步驟：

1)將180ul試劑1和5ul待測血清樣品混合，孵育至37℃；

2)加入90ul試劑2進行檢測，其中所用試劑如上述任一項所述。

優(yōu)選的，檢測波長：550±1nm；延遲時間：120s；監(jiān)測時間：180s。

優(yōu)選的，檢測參考區(qū)間基于中國人群建立，其范圍為健康成年人0-31U/L。

本發(fā)明檢測方法的檢測參考區(qū)間基于中國人群建立，對中國人群有更好的適應性。

優(yōu)選的，線性范圍為0.3-286U/L。

本發(fā)明檢測方法具有較寬的線性范圍。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法在四步酶偶聯的檢測原理上，對檢測條件、檢測過程進行研發(fā)，優(yōu)化得到的ADA檢測的最佳組合條件。

本發(fā)明腺苷脫氫酶的檢測試劑配方，檢測參數以及參考區(qū)間的確定，有利于臨床檢測結果的一致化，給臨床診療帶來便利。本發(fā)明方法靈敏度更高，優(yōu)于常規(guī)市售產品。

本發(fā)明方法檢測靈敏度大大提高，并且克服了非特異性反應，檢測方法更穩(wěn)定，快速準確簡單，性能得到很大改良，除此外還在該方法基礎上建立了基于中國人群的較大樣本的參考區(qū)間，對于中國人群有更好的適應性。

附圖說明

圖1為樣本反應全程吸光度掃描圖；

圖2為檢測方法的線性范圍；

圖3為參考區(qū)間頻率分布直方圖；

圖4為優(yōu)化方法與邁克方法的相關性及相對偏倚。

具體實施方式

EHSPTN為N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline的簡寫，中文名乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺。

本發(fā)明的檢測原理，如下：

其中，ADA：腺苷脫氫酶；PNP：嘌呤核苷磷酸化酶；XOD：為黃嘌呤氧化酶；POD：過氧化物酶。

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

1、試劑組成及濃度

試劑1：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄，10.3mmol/L)，4-氨基安替比林(4-AA，1.8mmol/L)，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，37℃2760U/L)，黃嘌呤氧化酶(XOD，37℃600U/L)，過氧化物酶(POD，37℃590U/L)，抗壞血酸酶(37℃2306U/L)，NaN₃(0.2mmol/L)，TritonX-100(試劑1總體積的0.76％)，EDTA(0.2mmol/L)；

試劑2(開始試劑)：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，腺苷(12.2mmol/L)，EHSPT(2.0mmol/L)。

2、檢測條件

檢測溫度：37±0.1℃；檢測波長：550±1nm；波寬：10mm±0.01mm，光徑≤2nm，檢測點≥6；孵育時間：300s；延遲時間：120s；監(jiān)測時間：180s。

3、檢測樣本：血清。

4、一種腺苷脫氨酶的檢測方法，包括下列步驟：

1)180ul試劑1和5ul血清樣本加入反應杯，混勻孵育至37℃；

部分儀器可以攪拌加溫同時進行；如果分步進行，即先混勻，后孵育至37℃，溫度達到37℃，約需300s。

2)加入90ul試劑2，延遲120s，監(jiān)測另外180s的線性；其中，可利用生化分析儀自動檢測或利用紫外分光光度計進行手工檢測。樣本反應全程吸光度掃描圖見圖1。

圖1說明在樣本和反應液孵育階段，曲線平直(前300秒)說明無非特異性(干擾)反應，加入開始試劑后，反應呈線性。

3)計算ADA活性：ADA(U/L)＝F*ΔA/Δt₅₅₀；

換算因子F＝1708[在550nm的ε(次黃苷)＝32.2mmol/cm]。

實施例2腺苷脫氨酶檢測的性能參數

按照實施例1的方法確定本技術的性能參數。

結果如下：

批內精密度：≤1％，期間精密度：≤2％；

線性范圍：0.3-286U/L；

靈敏度：檢測標準物質活性超出給定靶值約30％。

抗干擾能力：甘油三酯≤3.39mmol/L(約20倍正常成人水平)，血紅蛋白≤3.75g/L(肉眼可見的溶血為300mg/dl)，膽紅素＜85.5umol/L，維生素C≤40mg/L(正常人血清維生素C的含量為ng/dl級別)，甘草次酸和脫氧膽酸≤20mg/L，黃芩素≤37.5mg/L時對方法無干擾。

檢測方法的線性范圍圖見附圖2。圖2曲線的線性系數顯著，相關系數R²＝0.9998表明X取值范圍合適，在0-286U/L范圍內呈線性。

本發(fā)明檢測方法具有較寬的線性范圍0.3-286U/L，優(yōu)于市面上的市售產品。

實施例3重復性試驗

下面對本發(fā)明建立的方法進行重復性檢測，并分別計算出批內精密度和期間精密度。

選取了無肉眼可見脂血、溶血、黃疸和傳染性指標陰性的血清樣本(高低兩濃度)。批內精密度：一個批次內每樣本連續(xù)檢測10次，計算均值，標準差和變異系數(CV)，期間精密度為：每樣本每天檢測3次，連續(xù)檢測12天，計算均值，標準差和變異系數(CV)。

結果為批內精密度：≤1％，期間精密度：≤2％。

說明方法的批內和期間重復性均較好。

實施例4腺苷脫氨酶檢測結果的參考區(qū)間

選擇18-79周歲(男、女)的健康志愿者，按照實施例1的方法進行檢測。其中總志愿者n＝1662名，納入實驗個體n＝742名，實驗室檢測排除個體n＝92名，納入統(tǒng)計個體n＝650名，其中男n＝296名，女n＝354名。采用非參數統(tǒng)計方法，計算頻率分布95％可信區(qū)間和90％參考限的置信區(qū)間，樣本分布中位數為16.4U/L，均值為17.3U/L，均值的標準差為5.2U/L，標準誤為0.2U/L，最小值4.2U/L，最大值43.5U/L，95％(單側檢驗，α＝0.05)參考區(qū)間為0-31U/L，90％參考上限的置信區(qū)間為30.5-31.1U/L。樣本檢測結果頻率分布見圖3。

圖3為參考區(qū)間頻率分布直方圖；檢測結果頻率分布基本呈正態(tài)，說明樣本量足夠且數據有效，可進行后續(xù)計算。

本發(fā)明檢測方法的檢測參考區(qū)間基于中國人群建立，對中國人群有更好的適應性，其范圍為健康成年人0-31U/L。

對比例1

將本發(fā)明與四川邁克腺苷脫氨酶(ADA)測定試劑盒進行比對實驗。結果見圖4。

圖4A表明本方法和邁克方法呈線性正相關。圖4B表明邁克方法相對本方法均為負偏移，說明本方法檢測條件比邁克方法的條件優(yōu)越，提高檢測靈敏度。本發(fā)明方法ADA檢測活性比邁克試劑盒方法結果提高30-60％左右。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。