本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及川楝內(nèi)生放線菌的分離和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

放線菌是一類數(shù)量大、種類多、具有重要實(shí)用價(jià)值和開發(fā)潛力的微生物資源，是抗生素、酶和酶抑制劑等生理活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生者，迄今從微生物發(fā)現(xiàn)的大約12000多種生理活性物質(zhì)中，有近2/3是放線菌產(chǎn)生的。植物內(nèi)生放線菌是指以共生或寄生方式存在于植物組織內(nèi)部，不引發(fā)植物明顯病癥的微生物，在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，植物內(nèi)生放線菌與宿主間不斷進(jìn)行物質(zhì)、能量以及遺傳信息的交換，許多功能特異的放線菌與植物間形成了復(fù)雜的共生關(guān)系。宿主植物可以通過(guò)自身的新成代謝為內(nèi)生放線菌提供生長(zhǎng)所需，內(nèi)生放線菌則通過(guò)產(chǎn)生各類具有生物活性的代謝產(chǎn)物及基因重組的方式參與植物的新陳代謝，促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)，借助于信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(ISR)來(lái)增強(qiáng)植物的抗性，使宿主植物獲得生理上的優(yōu)勢(shì)，提高宿主抵抗病害及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。此外，內(nèi)生放線菌與植物尤其是與植物間的″協(xié)同進(jìn)化″關(guān)系決定了某些內(nèi)生放線菌具有了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力，近年來(lái)人們從植物中獲得了能產(chǎn)生具有拮抗動(dòng)、植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗腫瘤等功能的內(nèi)生放線菌，為尋找新的環(huán)境友好的天然活性物質(zhì)提供了寶貴的微生物資源庫(kù)。

從環(huán)境樣品中獲得微生物的純培養(yǎng)是當(dāng)前篩選微生物新化合物的第一步，也是開發(fā)新化合物的關(guān)鍵所在。目前對(duì)植物中獲得內(nèi)生放線菌純培養(yǎng)物的方式，主要采用以下程序來(lái)對(duì)內(nèi)生放線菌進(jìn)行分離：表面消毒-組織研磨-分離純培養(yǎng)?，F(xiàn)有的表面消毒方法存在″一刀切″的現(xiàn)象，即不考慮植株的各部位組織結(jié)構(gòu)、生育期等差異而采用同一種消毒方法進(jìn)行處理，但由于某些植物組織不能耐受高濃度消毒劑的處理，而直接導(dǎo)致植物內(nèi)生的放線菌在表面消毒時(shí)就已死亡，最終影響內(nèi)生放線菌的分離效果。

此外，植物組織破碎的程度與最終所分離獲得的內(nèi)生放線菌數(shù)量和種類也密切相關(guān)。已報(bào)道的方法主要有兩種：1、磨碎植物組織或剖開植物組織，直接灑在培養(yǎng)基上；2、在已研磨的植物組織中，加入無(wú)菌水或0.1％的無(wú)菌生理鹽水振蕩離心后，取上清進(jìn)行涂布分離。但這兩種方法分離獲取的內(nèi)生放線菌的數(shù)量和種類都非常有限，特別是木本植物，此類植物根莖粗大并形成大量的木質(zhì)部，其細(xì)胞壁也多數(shù)木質(zhì)化，質(zhì)地非常堅(jiān)固，采用現(xiàn)有方法破碎木本植物，很難有效的分離出組織內(nèi)部的放線菌，分離結(jié)果往往不能達(dá)到預(yù)期目的。

川楝(Melia Toosendan Sieb.et Zucc)為楝科楝屬落葉喬木，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，是重要的工業(yè)用材樹木，也是水土保持的重要植物。作為傳統(tǒng)中藥，川楝在我國(guó)的藥用歷史悠久，樹皮、根皮、樹干、樹葉和果實(shí)均可入藥，以產(chǎn)自四川的川楝果實(shí)為上乘，故名川楝子，是重要的川產(chǎn)地道中藥材。從川楝中提取的川楝素(Toosendanin)對(duì)昆蟲、線蟲和螨蟲以及微生物都有抑制作用，且尚未發(fā)現(xiàn)昆蟲產(chǎn)生抗藥性的情況，是制作高效無(wú)殘毒無(wú)污染新型植物類農(nóng)藥的重要原料。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分析測(cè)定手段的飛速發(fā)展，人們從川楝的果實(shí)、樹皮、葉中進(jìn)一步分離到具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗生育、抗氧化等功能的黃酮類、萜類、芳香族類等新活性化合物。在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，棲于川楝內(nèi)部的放線菌，在宿主植物及外部環(huán)境長(zhǎng)期影響作用下，可能具備產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的生物活性物質(zhì)的潛力，為研究與開發(fā)放線菌資源提供了寶貴的源頭。目前，以川楝作為材料分離內(nèi)生放線菌的研究幾乎沒(méi)有，有關(guān)于川楝各組織內(nèi)生放線菌分離的方法與技術(shù)現(xiàn)在還是空白。

本發(fā)明針對(duì)川楝等木本植物內(nèi)生放線菌分離效果不理想的、雜菌污染率高等現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種盡可能多的分離出川楝內(nèi)生放線菌的分離方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的包括：

充分挖掘川楝內(nèi)生放線菌資源；

有效的從果實(shí)、樹皮、葉等川楝不同組織中分離得到放線菌菌株，尤其是分離植物組織內(nèi)部的內(nèi)生放線菌；

根據(jù)川楝不同組織及其結(jié)構(gòu)，提供一種有針對(duì)性的表面消毒方法，并進(jìn)一步提供一種分離培養(yǎng)方法，獲得盡可能多的放線菌，如內(nèi)生放線菌等；

提供一種放線菌培養(yǎng)基或分離培養(yǎng)基。

一方面，本發(fā)明提供了一種川楝內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)方法，包含以下步驟：

(1)取川楝組織，體積濃度0.1％的吐溫20水溶液清洗60秒-90秒，無(wú)菌水沖洗；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘-10分鐘，無(wú)菌水沖洗；有效氯濃度為1％-2％的次氯酸鈉水溶液浸泡5分鐘-10分鐘，無(wú)菌水沖洗，體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘；其中，有效氯濃度為1％-2％的次氯酸鈉可以是將有效氯為6％的次氯酸鈉溶液稀釋4-6倍得到；

所述″有效氯濃度″的″有效″是指次氯酸溶解于水后，水中氯離子的濃度。該濃度單位是指質(zhì)量濃度；

(2)取步驟(1)處理后的川楝組織，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎后，置于無(wú)菌研缽，加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨；

(3)取步驟(2)得到的研磨液，裝入無(wú)菌離心管，按體積比1∶2的比例，加入酶解液，混勻，避光處置，離心；所述避光處置任選自：避光放置、避光攪拌和/或避光振蕩；

(4)取步驟(3)離心獲得的上清液，稀釋，涂布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基，合終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀。

優(yōu)選的，步驟(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸、1重量份的氯化鈣、0.5重量份的磷酸二氫鉀、0.25重量份的甘露醇、5重量份的果膠酶和10重量份的纖維素酶；

優(yōu)選的，步驟(4)所述的培養(yǎng)基為：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸鉀、0.5重量份的三水合磷酸氫二鉀、0.5重量份的七水合硫酸鎂、0.5重量份的氯化鈉、0.01重量份的氯化鈣、0.01重量份的七水合硫酸亞鐵和1000重量份的水。

具體的，本發(fā)明提供了一種川楝果實(shí)的內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)方法包括以下步驟：

(1)取川楝果實(shí)0.5克，先用體積濃度0.1％的吐溫20水溶液清洗90秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為2％的次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘；

(2)取步驟(1)處理后得到的川楝果實(shí)，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨；

(3)將步驟(2)制備的川楝果實(shí)研磨物裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度分鐘于搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘；取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)15-30天；

其中，步驟(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果膠酶，10重量份的纖維素酶；

步驟(4)所述的培養(yǎng)基為：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸鉀，0.5重量份的三水合磷酸氫二鉀、0.5重量份的七水合硫酸鎂、0.5重量份的氯化鈉、0.01重量份的氯化鈣、0.01重量份的七水合硫酸亞鐵、1000重量份的水。

具體的，本發(fā)明還提供了一種川楝葉的內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)取川楝葉0.5克，先用體積濃度0.1％的吐溫20水溶液清洗60秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1.5％的次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘；

(2)取步驟(1)處理后得到的川楝葉，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨；

(3)將步驟(2)制備的川楝葉研磨物裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘；取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)15-30天；

其中，步驟(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果膠酶，10重量份的纖維素酶；

步驟(4)所述的培養(yǎng)基為：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸鉀，0.5重量份的三水合磷酸氫二鉀、0.5重量份的七水合硫酸鎂、0.5重量份的氯化鈉、0.01重量份的氯化鈣、0.01重量份的七水合硫酸亞鐵、1000重量份的水。

此外，本發(fā)明還提供了一種川楝樹皮內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)取川楝樹皮0.5克，先用體積濃度0.1％的吐溫20水溶液清洗90秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1％的次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％的碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘；將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分；

(2)取步驟(1)處理后得到的川楝樹皮，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨；

(3)將步驟(2)制備的川楝樹皮研磨物裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘。取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)15-30天；

其中，步驟(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果膠酶，10重量份的纖維素酶；

步驟(4)所述的培養(yǎng)基為：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸鉀，0.5重量份的三水合磷酸氫二鉀、0.5重量份的七水合硫酸鎂、0.5重量份的氯化鈉、0.01重量份的氯化鈣、0.01重量份的七水合硫酸亞鐵、1000重量份的水。

另一方面，本發(fā)明提供了一種酶解液，由0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果膠酶，10重量份的纖維素酶組成；以及該酶解液用于酶解川楝組織的用途；所述川楝組織，優(yōu)選為果實(shí)、葉、樹皮。

此外，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)基，由20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸鉀，0.5重量份的三水合磷酸氫二鉀、0.5重量份的七水合硫酸鎂、0.5重量份的氯化鈉、0.01重量份的氯化鈣、0.01重量份的七水合硫酸亞鐵、1000重量份的水組成；以及該培養(yǎng)基用于培養(yǎng)川楝內(nèi)生菌，如內(nèi)生放線菌的用途。

本發(fā)明提供的分離得到川楝放線菌或川楝內(nèi)生放線菌的方法之一為：針對(duì)川楝不同組織結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行有區(qū)別的表面消毒，然后對(duì)已表面消毒的各組織研磨后，酶解處理各組織，將上清涂布于適合放線菌生長(zhǎng)、并能有效抑制非放線菌生長(zhǎng)的分離培養(yǎng)基，以獲得盡可能多的川楝內(nèi)生放線菌。

例如，本發(fā)明分離川楝內(nèi)生放線菌的可采用以下方法實(shí)現(xiàn)：

一種川楝內(nèi)生放線菌的分離方法，其特征包含以下步驟：

(1)采樣：采集健康川楝的果、樹皮、葉等組織，為了防止污染，樣品采集后用乙醇擦拭植物，有切口的部位乙醇消毒，再用蠟封好，放入無(wú)菌塑料袋中，并保存于4℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離。

(2)樣品預(yù)處理：用自來(lái)水洗掉植物表面的泥土，難以清洗的地方用軟刷輕輕刷洗，最后用超聲波清洗(15千赫)5-10分鐘，用濾紙吸干表面水分。

(3)表面消毒：將采集的川楝各組織先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗60秒-90秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘-10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1％-2％次氯酸鈉水溶液浸泡5分鐘-10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。

(4)組織研磨：將表面滅菌處理的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。

(5)植物組織酶解處理：將研磨后的植物材料裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液(0.5重量份的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果膠酶，10重量份的纖維素酶)，，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于28℃搖床中避光振蕩處理8小時(shí)小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心25分鐘。

(6)內(nèi)生放線菌分離培養(yǎng)基制備：在分離培養(yǎng)基中加入終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升重鉻酸鉀作為抑菌劑，抑制非放放線菌的生長(zhǎng)。

(7)內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)：離心后獲得的酶解液，適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于分離培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)15-30天，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。

本發(fā)明選擇果膠酶和纖維素酶處理植物樣品，最主要目的是將分布于細(xì)胞中，維管束等組織中的內(nèi)生菌能釋放出來(lái)，盡可能多的分離出分布于植物組織中的放線菌。

有益效果

本發(fā)明表面消毒方法綜合植物不同組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和對(duì)消毒試劑的耐受性，適當(dāng)調(diào)整了消毒劑處理植物材料的時(shí)間，在保證植物材料表面各微生物被充分徹底殺滅外，還保證了植物內(nèi)生菌不受消毒劑的影響；此外，為了從各組織中盡可能多的分離出放線菌，本發(fā)明采用粉碎研磨再加酶解的方法處理表面消毒后的樣植物樣品，充分的釋放出分布于植物各組織內(nèi)的放線菌；采用在分離培養(yǎng)基加入抑菌劑能有效的抑制非放線菌對(duì)放線菌生長(zhǎng)的影響，減少非放線菌對(duì)后期挑菌干擾，防止污染。本發(fā)明有助于我們更全面了解川楝內(nèi)生放線菌的分布及種群組成，同時(shí)也為后繼功能菌株的篩選提供豐富的菌種資源。

附圖說(shuō)明

圖1A、1B、1C川楝果實(shí)內(nèi)生放線菌分離結(jié)果圖

1A(實(shí)施例5方法1)：酶解液培養(yǎng)；1B：研磨后上清培養(yǎng)(實(shí)施例6)；1C：

樣品研磨后直接灑于培養(yǎng)基(實(shí)施例7)

圖2A、2B、2C川楝葉內(nèi)生放線菌分離結(jié)果圖

2A(實(shí)施例5方法1)：酶解液培養(yǎng)；2B：研磨后上清培養(yǎng)(實(shí)施例6)；2C：

樣品研磨后直接灑于培養(yǎng)基(實(shí)施例7)

圖3A、3B、3C川川楝樹皮內(nèi)生放線菌分離結(jié)果圖

3A：酶解液培養(yǎng)(實(shí)施例5方法1)；3B：研磨后上清培養(yǎng)(實(shí)施例6)；3C：

樣品研磨后直接灑于培養(yǎng)基(實(shí)施例7)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1川楝果實(shí)、樹皮和葉同時(shí)表面消毒

采集川楝果實(shí)、樹皮，葉，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗10分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，川楝果?shí)、樹皮，葉各取0.5克，先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗60秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為2％次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出；如無(wú)菌落長(zhǎng)出，則表面消毒有效；若有菌落長(zhǎng)出，表明表面消毒無(wú)效。經(jīng)本方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明本實(shí)施例表面消毒方法有效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

將經(jīng)過(guò)有效表面消毒的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨后，取適量研磨好的樣品組織均勻撒布于含有抑菌劑的高氏一號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉20克、氯化鈉0.5克、硝酸鉀1克、三水合磷酸氫二鉀0.5克、七水合硫酸鎂0.5克、七水合硫酸亞鐵0.01克、自來(lái)水1000毫升)上，進(jìn)行內(nèi)生菌的培養(yǎng)(經(jīng)有效表面消毒后，植物樣品表面無(wú)菌，因此培養(yǎng)得到的均為內(nèi)生菌)，待內(nèi)生菌長(zhǎng)出后，根據(jù)干燥、不透明、難以挑取、表面為粉末狀或顆粒狀、菌落的正反面呈現(xiàn)出不同色澤等菌落形態(tài)特征進(jìn)行放線菌的甄別和統(tǒng)計(jì)放線菌的菌落數(shù)量，得到放線菌菌落計(jì)數(shù)，內(nèi)生放線菌菌落數(shù)見表1。

待放線菌長(zhǎng)出后，可用無(wú)菌竹簽挑取出放線菌在ISP₄培養(yǎng)基(可溶性淀粉10.0克，硫酸氨4.0克，碳酸鈣2.0克，七水合硫酸鎂4.1克，三水合磷酸氫二鉀2.62克，自來(lái)水1000毫升)上培養(yǎng)純化，純化后的菌株保存在ISP₄斜面培養(yǎng)基上，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2川楝果實(shí)的表面消毒

方法1：采集的川楝果實(shí)，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗10分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，取川楝果實(shí)0.5克，先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗90秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為2％次氯酸鈉水溶液浸泡15分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。如無(wú)菌落長(zhǎng)出，則表面消毒有效；若有菌落長(zhǎng)出，表明表面消毒無(wú)效。經(jīng)本方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

參照實(shí)施例1方法，將經(jīng)過(guò)有效表面消毒的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，研磨，培養(yǎng)內(nèi)生菌并鑒別、統(tǒng)計(jì)放線菌數(shù)量，得到內(nèi)生放線菌的菌落計(jì)數(shù)；內(nèi)生放線菌菌落數(shù)見表1。

方法2：采集的川楝果實(shí)，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗10分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，取川楝果實(shí)0.5克，先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗60秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1％次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗5分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。經(jīng)本方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上有菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法無(wú)效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

實(shí)施例3川楝葉的表面消毒

方法1：采集的川楝葉，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗5分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，川楝葉取0.5克，先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗60s，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1.5％次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。將消毒好的樣品按實(shí)施例1的方法進(jìn)行內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)。經(jīng)本方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

參照實(shí)施例1方法，將經(jīng)過(guò)有效表面消毒的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，研磨，培養(yǎng)內(nèi)生菌并鑒別、統(tǒng)計(jì)放線菌數(shù)量，得到內(nèi)生放線菌的菌落計(jì)數(shù)；內(nèi)生放線菌菌落數(shù)見表1。方法2：采集的川楝葉，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗5分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，川楝葉取0.5克，先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗30秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1.0％次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉水溶液漂洗5分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。經(jīng)本方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上有菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法無(wú)效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

實(shí)施例4川楝樹皮的表面消毒

方法1：采集的川楝樹皮，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗5分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，川楝樹?.5克先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗90秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為1％次氯酸鈉水溶液浸泡15分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。經(jīng)本實(shí)施例方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

參照實(shí)施例1方法，將經(jīng)過(guò)有效表面消毒的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，研磨，培養(yǎng)內(nèi)生菌并鑒別、統(tǒng)計(jì)放線菌數(shù)量，得到內(nèi)生放線菌的菌落計(jì)數(shù)；內(nèi)生放線菌菌落數(shù)見表1。

方法2：采集的川楝樹皮，先用自來(lái)水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗10分鐘，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，川楝樹?.5克先用體積濃度0.1％吐溫20水溶液清洗60秒，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度75％的乙醇水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；有效氯濃度為2％次氯酸鈉水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗三次；體積濃度10％碳酸氫鈉漂洗10分鐘。將處理好的樣品置于鋪有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分。取最后一遍清洗樣品的無(wú)菌水200微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。經(jīng)本實(shí)施例方法表面消毒后，LB固體培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

參照實(shí)施例1方法，將經(jīng)過(guò)有效表面消毒的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，研磨，培養(yǎng)內(nèi)生菌并鑒別、統(tǒng)計(jì)放線菌數(shù)量，得到內(nèi)生放線菌的菌落計(jì)數(shù)；內(nèi)生放線菌菌落數(shù)見表1。

表1不同表面消毒方法對(duì)分離結(jié)果的影響

表1中，各組實(shí)驗(yàn)均使用相同的組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)內(nèi)生菌，但表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表面消毒各試劑的濃度和處理時(shí)間對(duì)川楝各組織內(nèi)生放線菌的分離結(jié)果影響很大。如對(duì)不同組織采用同一種表面消毒方式，則會(huì)使某些組織會(huì)被過(guò)度處理，導(dǎo)致分離獲得的內(nèi)生放線菌數(shù)量減少。

對(duì)于川楝果實(shí)、葉、樹皮分別使用實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1，實(shí)施例4方法1的表面效果效果最佳，使消毒后的植物樣品表面無(wú)菌，在組織培養(yǎng)中能得到最多的內(nèi)生放線菌菌落數(shù)。

經(jīng)實(shí)施例1表面消毒后，盡管植物樣品表面無(wú)菌，但組織培養(yǎng)得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量較少；這表明各植物組織被過(guò)度處理，致使內(nèi)部細(xì)菌被殺滅或去除。

實(shí)施例2方法2、實(shí)施例3方法2均無(wú)法有效殺滅或去除表面細(xì)菌；實(shí)施例4方法2盡管可有效表面消毒，但植物組織被過(guò)度處理，致使內(nèi)部細(xì)菌被殺滅或去除。

因此，在實(shí)際操作過(guò)程中，不同的植物材料應(yīng)考慮使用不同的表面消毒方式來(lái)進(jìn)行處理，才能達(dá)到最佳的分離結(jié)果。

實(shí)施例5添加酶解液的組織處理及培養(yǎng)方法

方法1：取實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后的植物樣品，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。將研磨后的植物材料裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液(0.5克的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1克的氯化鈣，0.5克的磷酸二氫鉀，0.25克的甘露醇，5克的果膠酶，10克的纖維素酶，蒸餾水1000毫升)，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于28℃的搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘。取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于合有抑菌劑(抑菌劑指，培養(yǎng)基合終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀)的改良高氏一號(hào)分離培養(yǎng)基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸鉀，0.5克的三水合磷酸氫二鉀、0.5克的七水合硫酸鎂、0.5克的氯化鈉、0.01克的氯化鈣、0.01克的七水合硫酸亞鐵、1000毫升的蒸餾水)上，于28℃培養(yǎng)15-30天，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次；實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后植物樣品的組織培養(yǎng)菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和說(shuō)明書附圖1A、2A、3A。

待放線菌長(zhǎng)出后，可用無(wú)菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，保種，室溫保藏，記錄菌株的分離情況。

方法2：

取實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后的植物樣品，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。將研磨后的植物材料裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液(0.25克的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1克的氯化鈣，0.5克的磷酸二氫鉀，0.25克的甘露醇，2.5克的果膠酶，5克的纖維素酶，蒸餾水1000毫升)，以每分鐘180轉(zhuǎn)的速度，于28℃的搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘。取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于含有抑菌劑(抑菌劑指，培養(yǎng)基含終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀)的改良高氏一號(hào)分離培養(yǎng)基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸鉀，0.5克的三水合磷酸氫二鉀、0.5克的七水合硫酸鎂、0.5克的氯化鈉、0.01克的氯化鈣、0.01克的七水合硫酸亞鐵、1000毫升的蒸餾水)上，于28℃培養(yǎng)15-30天，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次；；實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后植物樣品的組織培養(yǎng)菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

待放線菌長(zhǎng)出后，用無(wú)菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，保種，室溫保藏，記錄菌株的分離情況。

方法3：

取實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后的植物樣品，放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。將研磨后的植物材料裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入酶解液(1克的2-N-嗎啉乙烷磺酸，1克的氯化鈣，0.5克的磷酸二氫鉀，0.25克的甘露醇，10克的果膠酶，20克的纖維素酶，蒸餾水1000毫升)，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于28℃的搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘。取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于合有抑菌劑(抑菌劑指，培養(yǎng)基含終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀)的改良高氏一號(hào)分離培養(yǎng)基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸鉀，0.5克的三水合磷酸氫二鉀、0.5克的七水合硫酸鎂、0.5克的氯化鈉、0.01克的氯化鈣、0.01克的七水合硫酸亞鐵、1000毫升的蒸餾水)上，于28℃培養(yǎng)15-30天，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次；實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后植物樣品的組織培養(yǎng)菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

待放線菌長(zhǎng)出后，用無(wú)菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，保種，室溫保藏，記錄菌株的分離情況。菌株分離試驗(yàn)的結(jié)果見表2。

實(shí)施例6經(jīng)離心的組織處理及培養(yǎng)方法

將實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。將研磨后的植物材料裝入50毫升無(wú)菌離心管中，按體積比1∶2的比例，加入無(wú)菌水，以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度，于28℃的搖床中避光振蕩處理8小時(shí)，4℃下用600g的離心力離心15分鐘。取上清適當(dāng)稀釋后，取0.1毫升涂布于合有抑菌劑(抑菌劑指，培養(yǎng)基合終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀)的改良高氏一號(hào)分離培養(yǎng)基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸鉀，0.5克的三水合磷酸氫二鉀、0.5克的七水合硫酸鎂、0.5克的氯化鈉、0.01克的氯化鈣、0.01克的七水合硫酸亞鐵、1000毫升的蒸餾水)上，于28℃培養(yǎng)15-30天，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。；實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后植物樣品的組織培養(yǎng)菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和說(shuō)明書附圖1B、2B、3B。

待放線菌長(zhǎng)出后，用無(wú)菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，保種，室溫保藏，記錄菌株的分離情況。

實(shí)施例7組織處理及培養(yǎng)方法

將實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理的植物樣品放入無(wú)菌的攪拌器中打碎，然后再置于無(wú)菌的研缽加滅菌細(xì)砂與液氮進(jìn)行研磨。取適量研磨好的樣品組織均勻撒布于含有抑菌劑(抑菌劑指，培養(yǎng)基含終濃度為50微克每毫升的制霉菌素和終濃度為50微克每毫升的重鉻酸鉀)的改良高氏一號(hào)分離培養(yǎng)基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸鉀，0.5克的三水合磷酸氫二鉀、0.5克的七水合硫酸鎂、0.5克的氯化鈉、0.01克的氯化鈣、0.01克的七水合硫酸亞鐵、1000毫升的蒸餾水)上，正置平板，28℃培養(yǎng)15-30天。實(shí)施例2方法1、實(shí)施例3方法1、實(shí)施例4方法1表面滅菌處理后植物樣品的組織培養(yǎng)菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和說(shuō)明書附圖1C、2C、3C。

待放線菌長(zhǎng)出后，用無(wú)菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，保種，室溫保藏，記錄菌株的分離情況。

表2不同組織處理方法對(duì)分離結(jié)果的影響。

結(jié)果表明，經(jīng)特定配方的酶液處理后的植物樣品，有助于分布于植物材料中的放線菌盡可能多的釋放出來(lái)，雖然植物材料酶解處理后分離獲得的內(nèi)生放線菌的數(shù)量均高于非酶解處理，但酶解液濃度過(guò)低可能會(huì)導(dǎo)致植物組織分解不完全，而酶液濃度過(guò)高又可能影響釋放出的內(nèi)生放線菌活性，而最終導(dǎo)致內(nèi)生放線菌分離效果不佳，本發(fā)表明涉及的酶解液濃度能明顯提高川楝內(nèi)生放線菌的分離數(shù)量(表2)。此外，直接灑植物組織的方法分離出的放線菌數(shù)量也較多，但放線菌種類非常單一。本發(fā)明分離出來(lái)的放線菌不僅在數(shù)量上還是在種類上都明顯高于傳統(tǒng)的兩種處理方法(表2，圖1-3)。