本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有潛在應(yīng)用價值的新型金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開鏈吡啶羧酸衍生物及其制備方法。

背景技術(shù)：

自20世紀30年代抗生素應(yīng)用于臨床治療細菌感染以來，多種類抗菌藥物被開發(fā)并應(yīng)用于臨床，開啟了抗感染治療的新時代。然而，隨著抗菌藥物的不合理使用和濫用導(dǎo)致細菌獲得性耐藥日益嚴重，耐藥菌的比例逐年上升，不同程度影響到抗菌藥物的臨床治療效果。在抗菌藥物篩選壓力下，可水平傳播的獲得性耐藥發(fā)展越來越快，導(dǎo)致新藥耐藥迅速，使抗菌新藥研發(fā)陷入瓶頸期。例如2000年美國輝瑞公司上市的第一個人工合成惡唑烷酮類化合物利奈唑胺，該藥針對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌和萬古霉素耐藥的腸球菌表現(xiàn)良好的抗菌活性。然而僅上市一年就出現(xiàn)了利奈唑胺耐藥的陽性球菌報道。細菌獲得性耐藥的機制主要有四種：1)對藥物結(jié)構(gòu)修飾的鈍化酶和對藥物結(jié)構(gòu)破壞的水解酶；2)藥物作用靶點的改變或修飾；3)菌體細胞細胞膜通透性的改變；4)主動外排機制。其中，β-內(nèi)酰胺酶是臨床菌株中較為常見的一大類水解酶，按照該酶分子結(jié)構(gòu)中氨基酸序列同源性的差異，Ambler分類法將其分為A、B、C和D四類，其中由于其末端氨基殘留不同又將其分為絲氨酸類β-內(nèi)酰胺酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶。其中A、C和D屬于絲氨酸類β-內(nèi)酰胺酶，B類屬于金屬β—內(nèi)酰胺酶。目前已上市的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦。其與頭孢類抗菌藥物聯(lián)用可以提高抗菌藥物的活性。但是其都屬于絲氨酸類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，而有關(guān)金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑目前沒有任何上市藥物報道。

2014年，Gerard D.Wright等人報道了從真菌中得到的一種天然的化合物AMA，它可以快速、有效的抑制含有NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性，與美羅培南聯(lián)合用藥的情況下可使產(chǎn)NDM‐1酶菌株對美羅培南恢復(fù)敏感(Nature 2014,510,503.)。2015年，Sabiha Y.Essack等人報道了兩種鋅離子螯合劑NOTA和DOTA，此兩種螯合劑可以攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株恢復(fù)對碳青霉烯類抗生素的敏感性(Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2015,70,1594.)。2015年，西北大學(xué)楊科武課題組報道了一系列巰基乙酸硫酯氨基酸衍生物，其對于金屬β‐內(nèi)酰胺酶L1的IC₅₀最小可以達到18nM，但是其體外活性實驗證明其恢復(fù)美羅培南敏感性效果并不理想(Acs Medicinal Chemistry Letters 2015,6,660.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以使產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株恢復(fù)對碳青霉烯類抗生素敏感性的非環(huán)螯合類衍生物；另一目的在于提供其制備方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案如下：

具有聯(lián)合抗菌活性的氮雜環(huán)類衍生物，該化合物結(jié)構(gòu)式如下：

合成本發(fā)明金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑1路線如下：

具體合成方法如下：

取2,6-吡啶二甲酸二甲酯于圓底燒瓶中，冰浴下加入甲醇，攪拌，分批次加入NaBH₄，接三通空氣球，TLC觀測。反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓蒸干，加入飽和NaHCO₃溶液，除去過量的NaBH₄，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，抽濾旋干，得化合物b。

冰浴條件下，將化合物b加入氯仿中，攪拌溶解，隨后緩慢滴加PBr₃，室溫反應(yīng)，TLC觀測。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，過濾，合并有機相，得到化合物c。

將化合物d加入盛有二氯甲烷的圓底燒瓶中，攪拌均勻。滴入二氯甲烷和乙二胺的混液?；亓鞣磻?yīng)。18h后，待體系冷卻后，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到黃白色固體，抽濾得化合物e。

將化合物e溶解于甲醇中，攪拌溶解，冰浴下，加入NaBH₄，TLC觀測。待反應(yīng)完成后，減壓蒸餾除去溶劑，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，合并有機相，減壓蒸餾，得到亮黃色油狀物，柱層析(乙酸乙酯:甲醇＝10:1)后得到黃色油狀物為化合物f。

將化合物f溶解于乙腈溶液中，依次加入化合物c，無水碳酸鈉，保溫65℃-70℃反應(yīng)過夜，TLC觀測。待反應(yīng)完成后，將體系過濾，濾液減壓蒸餾得到黃棕色油狀物，柱層析(二氯：甲醇＝20:1)得到亮黃色油狀物化合物g。

將化合物g溶解于四氫呋喃和水溶劑中(四氫呋喃：水＝3:1)，隨后加入氫氧化鋰室溫攪拌，TLC觀測。待體系反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，緩慢滴加鹽酸溶液析出類白色固體，經(jīng)過濾，得到黃白色固體化合物1。

本發(fā)明優(yōu)點：該化合物在一定條件下可以將碳青霉烯類抗生素美羅培南的的MIC(最小殺菌濃度)值降低約小于40960倍，并且毒性小，有利于新金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研發(fā)。合成方法簡單可行，收率高，達44％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明化合物1體外紅細胞溶血性的實驗結(jié)果，由圖可知，本發(fā)明化合物1在1000μg/mL時紅細胞溶血率小于3％，對紅細胞沒有明顯的損傷，由此可以證明其對于哺乳動物的紅細胞損傷很小。

圖2為本發(fā)明化合物1在體外對于Hela細胞毒性的實驗結(jié)果，由圖可知，化合物1在1000μg/mL時對Hela細胞的抑制率在48.71％，由此可以初步證明，在體外實驗過程中，化合物1具有較小的細胞毒性。

圖3為本發(fā)明化合物1在體外對于Hela細胞毒性的活死細胞熒光實驗結(jié)果，圖中，a–c陰性對照(不加藥組)，d–f本發(fā)明化合物1(64μg/mL)，g–i本發(fā)明化合物1(32μg/mL)，j–l陽性對照組0.1％Triton X-100。圖中比例尺為100nm。由圖可以顯著的觀察到，本發(fā)明化合物1于64μg/mL作用于Hela細胞后，對于細胞維持正常形態(tài)的生長幾乎沒有影響。

圖4為本發(fā)明化合物1在體外對于大腸埃希菌14-55的殺菌動力學(xué)結(jié)果對比圖，圖中，a為本發(fā)明化合物1，b為NOTA，c為濁度實驗，c-1為空白對照，c-2為本發(fā)明化合物1(0.125μg/mL)，c-3為本發(fā)明化合物1(0.25μg/mL)。由圖可知，當本發(fā)明化合物1在4×MIC和8×MIC兩個濃度作用24h后，對于對數(shù)生長初期的細菌有很好的殺菌活性。與陽性對照NOTA的活性相當。從24h后的外觀可以清楚地看到，本發(fā)明化合物1作用后的菌液濁度很低，而空白對照組濁度明顯大。圖5為本發(fā)明化合物1和NOTA在體外與美羅培南、Zn²⁺聯(lián)用后的結(jié)果柱狀圖，由圖可知，本發(fā)明化合物1與美羅培南聯(lián)用16-18h之后幾乎可以達到100％的抑制率，但是與鋅離子聯(lián)合使用后藥物失效，說明本發(fā)明化合物1和金屬β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合是可逆性結(jié)合。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。

合成化合物表征使用的儀器：NMR譜使用瑞典Bruker DPX-400型超導(dǎo)核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標；高分辨質(zhì)譜使用Waters-Micromass公司Q-Tof質(zhì)譜儀測定。

實施例1化合物b的制備：

取2,6-吡啶二甲酸二甲酯(1.03g,5.26mmol)于圓底燒瓶中，冰浴下加入甲醇(50mL)，攪拌數(shù)分鐘，分批次加入NaBH₄(743.80mg,19.66mmol)，接三通空氣球，TLC觀測。反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓蒸干，加入飽和NaHCO₃溶液，除去過量的NaBH₄，再用二氯甲烷萃取(3×30mL)，水反萃3次，飽和食鹽水洗2次，最后加無水MgSO₄干燥，后抽濾旋干，得白色固體(661mg)，產(chǎn)率75％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.21(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.74(t,J＝7.8Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.25(s,1H),4.36(s,1H),3.93(s,1H),3.88(s,3H),1.17(s,2H),0.91–0.63(m,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.53(s),160.28(s),146.95(s),137.66(s),123.89(d,J＝24.7Hz),64.59(s),52.83(s).

實施例2化合物c的制備:

冰浴條件下，將化合物b(500mg)加入氯仿(10mL)中，攪拌溶解，隨后緩慢滴加PBr₃(341μL，3.59mmol)，室溫反應(yīng)4-5h，TLC觀測。反應(yīng)結(jié)束后，加飽和K₂CO₃溶液淬滅，減壓蒸餾除去溶劑，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，水洗一次，飽和食鹽水洗2-3次，加無水MgSO₄干燥，過濾，合并有機相，減壓蒸餾除去溶劑，得到淡黃色固體680mg，產(chǎn)率98.8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.08(t,J＝9.2Hz,1H),7.88(t,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.7Hz,1H),4.65(s,2H),4.02(s,3H).

實施例3化合物e的制備:

將化合物d(2mL，16.45mmol)加入盛有二氯甲烷(45mL)的圓底燒瓶中，攪拌均勻。另取一小燒杯，加入二氯甲烷(5mL)和乙二胺(659μl，9.87mmol)，攪拌混勻。然后將其逐漸滴入圓底燒瓶中，90℃回流，過夜反應(yīng)。后旋蒸得黃色油狀液體，用乙酸乙酯熱溶冷析，抽濾得2.21g黃白色固體e。

實施例4化合物f的制備:

將化合物e(1.25g，4.22mmol)溶解于甲醇(50mL)中，攪拌溶解，體系微溶，冰浴下，加入NaBH₄(207mg,5.48mmol),此時，體系逐漸由渾濁變澄清，TLC觀測。待反應(yīng)完成后，減壓蒸餾除去溶劑，加入飽和碳酸氫鈉，攪拌5min，二氯甲烷萃取(4×40mL)，水洗一次，飽和食鹽水反洗一次，無水硫酸鎂干燥，合并有機相，減壓蒸餾，得到粗品油狀物1.38g，柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)得到亮黃色油狀物777mg，產(chǎn)率61％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.17(t,J＝8.3Hz,2H),6.81(t,J＝5.7Hz,2H),3.70(s,3H),3.65(s,2H),2.68(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ158.60(s),132.39(s),129.30(s),113.75(s),77.32(s),77.00(s),76.68(s),55.24(s),53.21(s),48.51(s).

實施例5化合物g的制備:

將化合物f(312mg，1.04mmol)溶解于乙腈(10mL)溶液中，依次加入化合物c(558mg，2.42mmol)，無水碳酸鈉(2.45g，23.08mmol)。保溫70℃反應(yīng)過夜，TLC觀測。待反應(yīng)完成后，將體系過濾，濾液減壓蒸餾得到粗品743mg黃色油狀物，柱層析(二氯甲烷：甲醇＝20:1)后得到亮黃色油狀物510mg，產(chǎn)率82％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.17–7.88(m,4H),7.71–7.58(m,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,4H),6.96–6.74(m,4H),4.50–4.37(m,4H),4.36–4.22(m,4H),3.77–3.71(m,8H),3.63(d,J＝1.3Hz,9H).實施例6化合物1的制備:

將化合物g(480mg，728.65μmol)溶解于四氫呋喃和水(26mL，體積比3:1)溶劑中，隨后加入氫氧化鋰(70mg，2.91mmol)室溫攪拌兩小時，TLC觀測。待體系反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，緩慢滴加12M鹽酸溶液，瓶壁上有類白色固體出現(xiàn)，過濾，得到黃白色固體400mg，產(chǎn)率87.5％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.15–7.93(m,1H),7.53(dd,J＝6.5,2.3Hz,1H),7.19(d,J＝8.6Hz,1H),6.69(d,J＝8.6Hz,1H),4.45(s,1H),4.18(s,1H),3.65(s,1H),3.49(s,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ173.98(s),152.33(s),147.62(s),139.55(s),127.17(s),124.62(s),50.51(s),43.39(s).

HR-MS(ESI)Calcd for C₃₂H₃₄N₄O₆[M+H]⁺:571.2557,found:571.2554.。

應(yīng)用例1本發(fā)明化合物體外抗菌聯(lián)合用藥活性測試：

實驗方法微量肉湯稀釋法：

(1)抗菌藥物貯存液制備：制備抗菌藥物貯備液的濃度為5120μg/mL，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-20℃以下環(huán)境，保存期不超過6個月。

(2)待測菌的制備：用接種環(huán)挑取過夜培養(yǎng)的MH(A)培養(yǎng)皿上的單菌落于MH(B)培養(yǎng)基中，校準為0.5麥氏比濁標準，約含菌數(shù)1×10⁸CFU/mL，然后稀釋100倍，即得到約含菌數(shù)1.0×10⁶CFU/mL的菌液。

(3)分別將抗菌藥物(美羅培南MEM)貯備液母液(5120μg/mL)稀釋160倍，得到濃度為32μg/mL的抗菌藥物溶液。取無菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌藥物，第二至十孔分別加入100μL的MH肉湯培養(yǎng)基，從第一孔吸取100μL加入第二孔，混勻，再吸取100μL至第三孔，依次類推，第十孔吸取100μL棄去。此時各孔藥物濃度依次為：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200μL MH(B)培養(yǎng)基(陰性對照)。

(4)然后將稀釋好的菌液分裝于EP管中，計算需要固定待測化合物的濃度(64μg/mL或32μg/mL)，將其加入菌液中，使待測化合物的終濃度為64或32μg/mL。自稀釋好美羅培南的96孔板的第1孔至第10孔分別加入菌液和待測化合物的混合溶液。將加完藥的96孔板放置37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，16-18h觀察菌液生長情況，根據(jù)美國臨床與實驗室標準協(xié)會(CLSI)的判定標準，肉眼觀測完全不長菌的那一孔為抗菌藥物的MIC。同時用標準株做質(zhì)控。

實驗結(jié)果見表1，表2。

表1：本發(fā)明化合物1和NOTA對含有NDM的菌株的MIC(μg/mL)及其與美羅培南(MEM)聯(lián)合用藥的MIC結(jié)果

^aNOTA為1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid(1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-N,N',N”-三乙酸)，NDM為New Delhi-Metallo(新德里金屬酶)。

由表1可見，本發(fā)明化合物1能使所有攜帶NDM-1和NDM-4酶的菌株恢復(fù)對碳青霉烯類美羅培南的敏感性。針對產(chǎn)NDM-4酶的大腸埃希菌14-55，化合物NOTA與美羅培南(MEM)聯(lián)用能使MEM對產(chǎn)NDM酶耐藥菌的活性提高5120倍，而本發(fā)明化合物1可以將MEM活性提高40960倍。

表2：本發(fā)明化合物1和NOTA對產(chǎn)IMP酶菌株的MIC(μg/mL)及其與美羅培南(MEM)聯(lián)合用藥的結(jié)果

IMP為IMP型金屬beta內(nèi)酰胺酶。

由表2可見，對臨床分離的產(chǎn)IMP酶的10株腸桿菌科細菌，本發(fā)明化合物1均可以提高產(chǎn)IMP酶耐藥株對美羅培南的敏感性。其中針對產(chǎn)IMP酶大腸埃希菌Ec-15-101，化合物NOTA可以將MEM的活性提高32倍，而化合物1可以將美羅培南的活性提高64倍。

應(yīng)用例2本發(fā)明化合物體外NDM-1酶的抑制率和IC₅₀測試：

反應(yīng)在96孔板中進行，終體積為200μL。每個底物濃度平行設(shè)置3個副孔，分別設(shè)置不含美羅培南和不含NDM-1酶的實驗對照組。

(1)反應(yīng)體系中各物質(zhì)的終濃度分別為：NDM-1 3.5U，美羅培南125mM,10mM HEPES(PH＝7.5),待測藥物濃度為10mg/mL。

其中酶NDM-1每孔98μL與抑制劑用DMSO梯度稀釋，使?jié)舛葟?0mg/mL二倍稀釋到0.15625mg/mL每孔2μL加入相應(yīng)孔中，使化合物終濃度為100μg/mL到1.5625μg/mL，用DMSO作為陰性對照組，每組四個平行。在30℃條件下孵育15min，再加入美羅培南100μL捶打均勻啟動反應(yīng)。

(2)將96孔板置入酶標儀中于，測定其相應(yīng)孔中于300nm處的吸光值；每隔60s測定一次，連續(xù)測定60個循環(huán)。分別計算各抑制濃度下的酶抑制率，用Graphpad Prism5分析各抑制劑的IC₅₀。

運用上述模型監(jiān)測待測樣品酶活性的抑制率，其中陰性對照組為不含抑制劑，可以反應(yīng)體系中酶的最大活力?？瞻讓φ战M為不含抑制劑也不含酶，所測得的結(jié)果為體系本底值。因此待測樣品抑制率的計算公式如下：

IR(％)＝(1-V_S/V_N)×100％

V_S代表待測樣品孔的酶反應(yīng)速率

V_N代表陰性對照孔的平均每反應(yīng)速率

實驗結(jié)果見表3。

表3本發(fā)明化合物1對于NDM-1酶的IC₅₀和抑制率。

^a化合物濃度為10μg/mL

由表3可知，化合物1對于NDM-1的抑制活性都明顯優(yōu)于EDTA，尤其是本發(fā)明化合物1的IC₅₀可以達到0.11μM。在濃度為10μg/mL時其抑制率達到95％。

應(yīng)用例3本發(fā)明化合物體外紅細胞溶血性實驗

(1)實驗材料：10mLEP管，96孔板，新鮮脫脂羊血。

(2)PBS緩沖液：500mL規(guī)格，氯化鈉4g，氯化鉀100mg，二水合磷酸二氫鈉1.49g，無水磷酸二氫鉀100mg，去離子水定容至490mL，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4之間，滅菌，用10mL滅過菌的超純水溶解900mg葡萄糖后加入PBS溶液中。

(3)5％紅細胞懸浮液的制備：新鮮的脫纖維羊血冷凍于冰箱里，配置好的PBS緩沖液放置與37℃水浴鍋中，即用即取。

取兩支10mL EP管置于試管架，將37℃1×PBS取出水浴鍋和冷藏的新鮮羊血一起噴酒精，放入超凈臺。用移液槍分別吸取5700μL的1×PBS加入兩支EP管中，再分別吸取300微升羊血，緩慢加入到PBS溶液中，蓋蓋子，上下緩慢顛倒混勻，放入離心機1500轉(zhuǎn)離心10min，取出EP管，小心吸取上清，移除上清。再重新分別加入5～7mL PBS溶液，上下緩慢顛倒混勻，放入離心1500轉(zhuǎn)離10min。如此反復(fù)操作，直至離心后上清液不再渾濁。最后一次離心過后，撇去上清液，紅細胞沉積物留置待用。

取幾支10mL EP管，放置試管架上，于每支EP管中加入5700μL的1×PBS(37℃)，然后依次加入300μL的紅細胞沉積物。上下緩慢顛倒混勻，如此，便配置好5％的紅細胞懸液。

(4)樣品溶液的配置：用少量的DMSO溶解(DMSO終濃度不能大于0.5％)，并且用相同體積的DMSO做陰性對照。溶解后的DMSO用PBS稀釋(例如，第一孔濃度為1000μg/mL，那么第一孔加入的50μL中藥物的含量就是2mg，配置成2mg/50μL的溶液)，此時這支EP管內(nèi)的藥物為初始藥物。然后平行取九支1.5mL EP管置于試管架中，分別加入200μL的PBS(編號2號、3號、4號……10號)。所有藥物都如此平行操作。最后，由初始藥物EP管中吸取200μL的藥品溶液加入2號EP管中，反復(fù)吹洗后吸取200μL到3號EP管中，反復(fù)吹洗……重復(fù)操作，直到10號EP管。如此，稀釋好藥物。

(5)鋪板：取96孔板，寫好實驗編號，藥品代碼，日期。將移液槍調(diào)至150μL，將配置好的5％紅細胞懸液上下輕緩顛倒混勻，依次吸取鋪入96孔板中(6×10)。然后將配置好的藥物對應(yīng)加入96孔板中，一個藥物三個復(fù)孔。加完后放置37℃恒溫箱內(nèi)孵育1h。

(6)后處理：將96孔板從恒溫箱內(nèi)取出，置于-4℃離心機內(nèi)離心(3500rpm，5min)。離心完畢，每塊板對應(yīng)都取一塊新的96孔板。標注和離心后的板子對照。然后對應(yīng)地吸取100μL上清液(孔孔對應(yīng))。吸取完畢后，與酶標儀中測取OD值，分析數(shù)據(jù)，得到HC₅₀。

實驗結(jié)果見附圖1。

應(yīng)用例4本發(fā)明化合物體外細胞毒性測試

實驗材料：DMEM培養(yǎng)基，細胞計數(shù)板，96孔板，細胞計數(shù)試劑CCK-8，酶標儀。

(1)培養(yǎng)基的配置：取無菌分裝瓶，F(xiàn)BS和DMEM培養(yǎng)基1:10的比例配置，于4℃冰箱內(nèi)儲存待用。

(2)鋪板：將培養(yǎng)中狀態(tài)良好的Hela細胞自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培養(yǎng)基，用2mL PBS洗細胞一次，除去殘留的培養(yǎng)基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱，體積百分比0.5％CO₂中孵育1-2min。取出消化后的培養(yǎng)皿，加入1mL培養(yǎng)基終止消化。將終止消化后的細胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mL EP管中，800rpm 3min離心。取出EP管，緩緩倒掉上清，加入2—4mL培養(yǎng)基，反復(fù)吹打50次。從中取10μL細胞混懸液打入細胞計數(shù)板中，于20×顯微鏡下計數(shù)。計算好需要細胞的數(shù)目，配置為5000個/孔的細胞混懸液。每孔100μL依次加入96孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。

(3)加藥：將待測藥物在4ml EP管中梯度稀釋好后，取出已貼壁生長的96孔板，棄掉上清，將稀釋好的待測藥物每個濃度三個副孔，每孔200μL加入板中，操作完成后將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中。24h后，細胞計數(shù)試劑cck-8每孔7μL依次加入板中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后于酶標儀中，450nm波長處讀取OD值，計算抑制率，回歸其IC₅₀。

實驗結(jié)果見附圖2。

應(yīng)用例5本發(fā)明化合物體外活死細胞雙染測試

(1)實驗材料：DMEM培養(yǎng)基，細胞計數(shù)板，96孔板，細胞計數(shù)試劑CCK-8，鈣黃綠素-AM，碘化丙啶(PI),PBS緩沖液，熒光顯微鏡。

(2)培養(yǎng)基的配置：取無菌分裝瓶，F(xiàn)BS和DMEM培養(yǎng)基1:10的比例配置，于4℃冰箱內(nèi)儲存待用。

(3)熒光染料的配置：將分裝好的鈣黃綠素-AM和碘化丙啶(PI)用PBS稀釋，即用即稀釋。

(4)鋪板：將培養(yǎng)中狀態(tài)良好的Hela細胞自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培養(yǎng)基，用2mL PBS洗細胞一次，除去殘留的培養(yǎng)基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱，體積百分比0.5％CO₂中孵育1-2min。取出消化后的培養(yǎng)皿，加入1mL培養(yǎng)基終止消化。將終止消化后的細胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mL EP管中，800rpm 3min離心。取出EP管，緩緩倒掉上清，加入2—4mL培養(yǎng)基，反復(fù)吹打50次。從中取10μL細胞混懸液打入細胞計數(shù)板中，于20×顯微鏡下計數(shù)。計算好需要細胞的數(shù)目，配置為30000個/孔的細胞混懸液。每孔1mL依次加入12孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。

(5)加藥與染色：將待測藥物在4mL EP管中梯度稀釋好后，取出已貼壁生長的12孔板，棄掉上清，將稀釋好的待測藥物每孔700μL加入板中，操作完成后將12孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中。24h后，取出，分別收集每個孔的上清，做好標記，3500rpm 5min離心上清，棄掉上清收集死細胞，接著用PBS洗一次，棄掉PBS。將12孔板用PBS每孔各洗一次。用配置好的染料每孔700μL先吹打收集該孔的死細胞，然后將其混合液加入到12孔板的孔中。操作完成后，于恒溫培養(yǎng)箱孵育15min。接著，尼康熒光顯微鏡下拍照。

實驗結(jié)果見附圖3。

應(yīng)用例6本發(fā)明化合物體外殺菌動力學(xué)測試

(1)實驗材料：MHB培養(yǎng)基，MHA培養(yǎng)基，1.5mL無菌EP管，96孔板，PBS緩沖液。

(2)培養(yǎng)基的配置：用超純水溶解一定量的MHA和MHB粉末，121℃高溫滅菌20min后，取出備用。MHA培養(yǎng)基待其冷卻至40℃左右將其倒入一次性無菌培養(yǎng)皿，待至室溫凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。

(3)步驟：取兩支10mLEP管分別加入3mL的MHB培養(yǎng)基，用接種環(huán)分別挑取培養(yǎng)皿中的單克隆菌株(NDM-4菌株14-55和IMP菌株Ec-101)，于恒溫搖床中，37℃250rpm過夜生長。第二天，將兩支管中的菌液分別都按1:10000倍進行稀釋，分別稀釋14管，每管3mL的菌液，分為兩批，分別于37℃250rpm生長2h和5h。待到達生長時間，取出菌液，加入不同濃度MIC的抗菌藥物，此時，分別從每個樣品管里面取出100μL的樣品液，于低溫離心機內(nèi)10000g離心，棄掉上清，用1×PBS稀釋。取無菌96孔板，每孔180μL加入1×PBS。從上述用1×PBS稀釋好的菌液中取出20μL加入第一孔，然后向后倍比稀釋。從稀釋好的孔中取出10μL的樣品液滴到MHA固體培養(yǎng)基上，做好標記，此為0h時的菌落計數(shù)。往后依照上述方法，依次對1h、2h、3h……24h等進行菌落計數(shù)，繪制曲線。結(jié)果見附圖4。

應(yīng)用例7本發(fā)明化合物體外鋅離子聯(lián)合用藥實驗

(1)抗菌藥物貯存液制備：制備抗菌藥物貯備液的濃度為5120μg/mL，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-20℃以下環(huán)境，保存期不超過6個月。

(2)待測菌的制備：用接種環(huán)挑取過夜培養(yǎng)的MH(A)培養(yǎng)皿上的單菌落于MH(B)培養(yǎng)基中，校準為0.5麥氏比濁標準，約含菌數(shù)1×10⁸CFU/mL，然后稀釋100倍，即得到約含菌數(shù)1.0×10⁶CFU/mL的菌液。

(3)分別將抗菌藥物(美羅培南)貯備液母液(5120μg/mL)稀釋160倍，得到濃度為32μg/mL的抗菌藥物溶液。取無菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌藥物，第二至十孔分別加入100μL的MH肉湯培養(yǎng)基，從第一孔吸取100μL加入第二孔，混勻，再吸取100μL至第三孔，依次類推，第十孔吸取100μL棄去。此時各孔藥物濃度依次為：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200mL MH(B)培養(yǎng)基(陰性對照)。

(4)然后將稀釋好的菌液分裝于EP管中，計算需要固定待測化合物的濃度(64μg/mL或32μg/mL)，將其加入菌液中，使待測化合物的終濃度為64或32μg/mL，然后加入等摩爾量的ZnCl₂。自稀釋好美羅培南的96孔板的第1孔至第10孔分別加入菌液和待測化合物的混合溶液。將加完藥的96孔板放置37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，16-18h觀察菌液生長情況，根據(jù)美國臨床與實驗室標準協(xié)會(CLSI)的判定標準，肉眼觀測完全不長菌的孔為抗菌藥物的MIC。同時用標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922做質(zhì)控。結(jié)果見附圖5。

由上述體外生物活性評價實驗可知，本發(fā)明化合物1具有可以使耐藥的美羅培南恢復(fù)其敏感的生物活性，最高可以把美羅培南的活性提高40960倍。體外毒性實驗證實，紅細胞毒性顯示化合物1即使在濃度為1000μg/mL時對于紅細胞依舊沒有什么毒性。而對于體外Hela細胞的毒性顯示，化合物1對于體外細胞毒性也在其治療量MIC范圍之內(nèi)。殺菌動力學(xué)的結(jié)果表明本發(fā)明化合物1對于對數(shù)生長初期的細菌具有很好的殺菌活性。NDM-1酶的抑制實驗也證明了本發(fā)明化合物1的確可以抑制NDM-1的活性，并且對NDM-1的IC₅₀小于EDTA。鋅離子聯(lián)合用藥實驗驗證了本發(fā)明化合物1與金屬β-內(nèi)酰胺酶的鋅離子結(jié)合導(dǎo)致酶失活。一系列的生物活性評價可以初步認定，本發(fā)明化合物1具有潛在聯(lián)合成藥價值。