本發(fā)明屬于牡蠣深加工領(lǐng)域，具體涉及一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法。

背景技術(shù)：

牡蠣是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大海水養(yǎng)殖貝類之一，沿海各個省份均有分布。牡蠣不僅營養(yǎng)豐富，而且還具有味道鮮、功效好等特點，備受消費者的喜愛。

牡蠣肉中含有豐富的蛋白質(zhì)(45～57％)、脂肪(7～11％)和糖原(19～38％)，此外，還含有充足的維生素和鋅、鈣、硒、鐵等礦物質(zhì)。牡蠣蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，含有豐富的氨基酸，必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于人乳和牛乳，除了人體必需的20種常用氨基酸外，還含有β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、?；撬岬榷喾N具有重要生理價值的氨基酸。牡蠣肉中糖原含量豐富，是組織能源的一種儲備形式。糖原可以被機體直接吸收，減輕胰臟負擔，也具有改善心臟及血循環(huán)、抗疲勞和增強肝臟功能等功效。牡蠣中的脂肪多為具有生理活性的復(fù)合磷脂、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等不飽和脂肪酸。

《本草綱目》記載：牡蠣肉“多食之，能滋潤皮膚，補腎壯陽，并能治虛，解丹毒”。牡蠣及其提取物具有降血糖、降血壓、降血脂、增強免疫力、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑菌和護肝的功能等多重生理活性。

牡蠣捕撈后極易被微生物污染而腐敗變質(zhì)，保藏期短，且牡蠣保鮮貯運鏈條不完善，長時間保存和遠距離運輸均存在困難，導(dǎo)致牡蠣的開發(fā)利用受到限制。運用生物酶解加工技術(shù)處理牡蠣，能夠增加產(chǎn)品附加值，制備的酶解產(chǎn)物含有豐富的小肽、多肽和氨基酸等營養(yǎng)成分，具有多重生理功能價值，可用于生產(chǎn)功能性肽等保健品。

已有研究表明牡蠣肽在壯陽、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖、增強機體免疫等方面具有特殊的生理活性。但是在實際生產(chǎn)中，牡蠣肽的分離提取存在極大困難。牡蠣蛋白酶解液中含有多肽和未降解的蛋白、油脂和糖類等復(fù)雜組分，形成穩(wěn)定的乳化體系，單獨采用離心或抽濾分離的效果均不佳。采用離心技術(shù)分離時，牡蠣蛋白酶解液水相和油相界面不清，難以分離，嚴重影響酶解產(chǎn)物的分離，目標肽得率不高。而抽濾分離牡蠣肽耗時過長，在加工過程中易發(fā)生變質(zhì)，產(chǎn)能低。

因此，采用工藝簡單、操作簡便、成本低廉的方法分離提取活性物質(zhì)，具有較大的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。酶解技術(shù)無需特殊設(shè)備，且其反應(yīng)特異性強、高效、條件溫和、易于控制、安全性較高，且有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。而真空抽濾分離技術(shù)操作方便快捷，可連續(xù)不間斷運作，分離效率高，將其與酶解技術(shù)結(jié)合高效快速分離牡蠣肽具有可操作性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法，該方法的要點在于加入乳化劑促使脂肪酶與牡蠣酶解產(chǎn)物的充分接觸，通過脂肪酶水解作用降解牡蠣酶解體系中的脂肪組分，促使牡蠣酶解產(chǎn)物破乳使得油脂與水相分離；然后采用細胞壁多糖和活性炭高效吸附酶解體系中的水不溶物，并在濾膜上形成濾餅，實現(xiàn)牡蠣肽的快速分離。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的牡蠣肽。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)牡蠣酶解體系的破乳：往滅酶后的牡蠣酶解液中加入乳化劑，調(diào)節(jié)牡蠣酶解液pH值至7.0～8.0，加入脂肪酶，充分混勻，在35～50℃下保溫水解4～8h，滅酶，得到牡蠣二次酶解產(chǎn)物；以牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)為計算基準，乳化劑的加入量占0.10～0.35％，脂肪酶的加入量占1.0～2.0％；

(2)牡蠣肽的分離：往二次酶解產(chǎn)物中加入酵母細胞壁多糖和活性炭，在50～60℃保溫中振蕩0.5～1.5h，采用0.5μm濾膜真空抽濾，收集濾過液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為35～45％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽；

步驟(1)中所述的牡蠣酶解液是以牡蠣肉為原料，加入蛋白酶酶解后得到的；

所述的蛋白酶優(yōu)選木瓜蛋白酶、胰酶或堿性蛋白酶；蛋白酶的加入量是牡蠣肉質(zhì)量的0.2-0.4％，優(yōu)選在pH值6.0-7.0、溫度50-60℃下酶解5-6h；

步驟(1)中所述的乳化劑優(yōu)選單甘脂和/或蔗糖酯；

步驟(1)所述的調(diào)節(jié)牡蠣酶解液pH值是用0.5mol/L的NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)；

步驟(1)中所述的脂肪酶優(yōu)選諾維信公司的磷脂酶A1(Lecitase Ultra)；

步驟(1)中所述的充分混合是指采用轉(zhuǎn)速120r/min以上快速攪拌酶解體系使之與脂肪酶充分接觸；

步驟(1)所述的滅酶是將反應(yīng)體系在95℃下加熱15min；

步驟(2)中所述的酵母細胞壁多糖的加入量占牡蠣二次酶解產(chǎn)物質(zhì)量的0.5～1.0％；

步驟(2)所述的活性炭的加入量占牡蠣二次酶解產(chǎn)物質(zhì)量的0.5～1.5％。

由上述方法制得的牡蠣肽為乳白色或淡黃色粉末。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)由于牡蠣蛋白酶解液中的蛋白和多肽具有較強的乳化特性，在水體系中易與牡蠣中的磷脂等油脂發(fā)生相互作用形成乳濁液，使得油水難以分離，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物難于分離：若采用離心機對牡蠣蛋白酶解液直接進行分離，由于沉淀與清液界面不清，分離效果較差，效率低下；若采用過濾法分離，乳濁液中的油脂會堵塞濾孔，導(dǎo)致無法分離。本發(fā)明方法利用脂肪酶對酶解體系中的脂肪進行水解，破壞酶解體系中的乳化平衡，促使水相和油相分離。該法水解條件溫和、過程安全可控，可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

(2)本發(fā)明加入的乳化劑可增加脂肪酶與脂肪的接觸面積，提高脂肪酶酶解效率，充分水解脂肪，實現(xiàn)油水分離；

(3)本發(fā)明采用酵母細胞壁多糖和活性炭作為吸附劑和助濾劑，一方面可促使濾餅形成，加速水相的過濾，實現(xiàn)牡蠣肽的快速分離；另一方面可吸附牡蠣肽中的腥味和苦味，以及可起到脫色的作用。

(4)本發(fā)明工藝簡單、操作簡便、生產(chǎn)成本低、沒有任何污染、蛋白回收率高，所得蛋白多肽類物質(zhì)品質(zhì)高，可廣泛應(yīng)用于保健品、調(diào)味品等食品領(lǐng)域中。

附圖說明

圖1是實施例和對比例產(chǎn)品的蛋白回收率對比圖。

圖2是實施例和對比例產(chǎn)品的抽真空過濾耗時對比圖。

圖3是實施例和對比例產(chǎn)品的脂肪含量對比圖。

圖4是實施例和對比例產(chǎn)品的肽含量對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明實施例中所涉及的試驗指標其實驗方法如下：

粗蛋白的測定：

凱氏定氮法測定/GB 5009.5-2010。

抽真空過濾耗時的測定：

取1kg牡蠣二次酶解液加入一定量酵母細胞壁多糖和活性炭，在50℃～60℃保溫中振蕩0.5～1.5h后，采用0.5μm濾膜真空抽濾時，從開始抽濾起計時，直至酶解液全部濾過，記錄總耗時。

脂肪的測定：

索式抽提法測定/GB/T 5009.6-2003。

游離氨態(tài)氮含量的測定：

采用甲醛電位滴定法測定樣品的游離氨態(tài)氮含量，以蒸餾水為空白對照，取2g樣品，加入蒸餾水至80g，以0.1mol/L的NaOH滴定至pH值8.2，加入10mL甲醛，繼續(xù)滴定至pH 9.2，得空白對照組和樣品加入甲醛后消耗的NaOH體積V₀及V_i。產(chǎn)物的游離氨態(tài)氮含量為：

游離氨肽氮含量(％)＝(V_i-V₀)×0.7×100％

肽含量的測定：

取2ml酶解液(蛋白含量約20mg/ml)，加入等體積的10％的TCA溶液，混合均勻后靜置30min，然后4000r/min條件下離心10min，取上清液分別測定總氮含量和游離氨氮含量。則肽含量為：

實施例1

一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)新鮮牡蠣肉清洗干凈，按質(zhì)量比1:1加水攪拌混合，過膠體磨得到牡蠣漿液；然后調(diào)節(jié)體系pH值至7.0，加入牡蠣肉質(zhì)量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小時，然后在90℃下加熱15min滅酶，得牡蠣酶解液；

(2)往滅酶后的牡蠣酶解液中加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)0.15％的蔗糖酯和0.15％的單甘脂，調(diào)節(jié)牡蠣酶解液pH值至8.0，加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)1.0％的脂肪酶，充分混勻，在35℃下保溫水解8h，然后在95℃下加熱15min滅酶，得到牡蠣二次酶解產(chǎn)物；

(2)往二次酶解產(chǎn)物中加入牡蠣二次酶解產(chǎn)物質(zhì)量1.0％的酵母細胞壁多糖和0.5％的活性炭，在55℃保溫中振蕩1.0h，采用0.5μm濾膜真空抽濾，收集濾過液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為35％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽1。

實施例2

一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)新鮮牡蠣肉清洗干凈，按質(zhì)量比1:1加水攪拌混合，過膠體磨得到牡蠣漿液；然后調(diào)節(jié)體系pH值至6.0，加入牡蠣肉質(zhì)量0.2％的胰酶，在50℃下水解5小時，然后在90℃下加熱15min滅酶，得牡蠣酶解液；

(2)牡蠣酶解體系的破乳：往滅酶后的牡蠣酶解液中加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)0.08％的蔗糖酯和0.12％的單甘脂，調(diào)節(jié)牡蠣酶解液pH值至7.0，加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)1.5％的脂肪酶，充分混勻，在40℃下保溫水解6h，然后在95℃下加熱15min滅酶，得到牡蠣二次酶解產(chǎn)物；

(2)往二次酶解產(chǎn)物中加入牡蠣二次酶解產(chǎn)物質(zhì)量0.8％的酵母細胞壁多糖和1.0％的活性炭，在60℃保溫中振蕩0.5h，采用0.5μm濾膜真空抽濾，收集濾過液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為40％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽2。

實施例3

一種從牡蠣酶解液中快速分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)新鮮牡蠣肉清洗干凈，按質(zhì)量比1:1加水攪拌混合，過膠體磨得到牡蠣漿液；然后調(diào)節(jié)體系pH值至6.5，加入牡蠣肉質(zhì)量0.4％的堿性蛋白酶，在60℃下水解5小時，然后在90℃下加熱15min滅酶，得牡蠣酶解液；

(2)往滅酶后的牡蠣酶解液中加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)0.05％的蔗糖酯和0.05％的單甘脂，調(diào)節(jié)牡蠣酶解液pH值至7.5，加入牡蠣酶解液質(zhì)量(干物質(zhì)計)2.0％的脂肪酶，充分混勻，在35℃下保溫水解4h，然后在95℃下加熱15min滅酶，得到牡蠣二次酶解產(chǎn)物；

(2)牡蠣肽的分離：往二次酶解產(chǎn)物中加入牡蠣二次酶解產(chǎn)物質(zhì)量1.0％的酵母細胞壁多糖和1.5％的活性炭，在50℃保溫中振蕩1.5h，采用0.5μm濾膜真空抽濾，收集濾過液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為45％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽3。

對比例1

一種從牡蠣酶解液中分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)新鮮牡蠣肉清洗干凈，按質(zhì)量比1:1加水攪拌混合，過膠體磨得到牡蠣漿液；然后調(diào)節(jié)體系pH值至7.0，加入牡蠣肉質(zhì)量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小時，然后在90℃下加熱15min滅酶，得牡蠣酶解液；

(2)將滅酶后的牡蠣酶解液在4℃的條件下5000r/min下離心15min，取上清液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為35％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽A。

對比例2

一種從牡蠣酶解液中分離牡蠣肽的方法，包括以下步驟：

(1)新鮮牡蠣肉清洗干凈，按質(zhì)量比1:1加水攪拌混合，過膠體磨得到牡蠣漿液；然后調(diào)節(jié)體系pH值至7.0，加入牡蠣肉質(zhì)量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小時，然后在90℃下加熱15min滅酶，得牡蠣酶解液；

(2)往牡蠣酶解液中加入其質(zhì)量1.0％的酵母細胞壁多糖和0.5％的活性炭，在55℃保溫中振蕩1.0h，采用0.5μm濾膜真空抽濾，收集濾過液，得牡蠣肽液；真空濃縮至固形物為35％，進行噴霧干燥，得到牡蠣肽B。

牡蠣酶解液的工業(yè)化生產(chǎn)要求分離效果好、生產(chǎn)效率高，且能夠連續(xù)操作。蛋白回收率是評價酶解液生產(chǎn)能力的重要指標。

由圖1可知，采用本發(fā)明方法對牡蠣酶解液進行分離時，獲得的牡蠣肽(牡蠣肽1、2、3)的蛋白回收率顯著高于對比例的牡蠣肽(牡蠣肽A和B)，實現(xiàn)了對原料的高值利用。主要是因為本發(fā)明中，通過乳化劑的輔助使脂肪酶與酶解系統(tǒng)中的油脂充分接觸，利用脂肪酶酶解牡蠣蛋白酶解液中的磷脂等脂肪，破壞蛋白和脂肪的相互作用，降低乳狀液的穩(wěn)定性，從而使油水分離開，利于牡蠣肽的分離。而對比例1中，采用離心技術(shù)可以去除牡蠣酶解液的主要雜質(zhì)，但是沉淀與清液界面不清，分離效果較差，蛋白回收率低。對比例2中采用盡管采用本發(fā)明專利中的活性炭和酵母細胞壁多糖吸附輔助過濾，但由于牡蠣酶解產(chǎn)物中乳化穩(wěn)定性較好，分離仍不理想，仍有部分油脂通過濾紙進入牡蠣肽中，從而降低了牡蠣肽的蛋白回收率。表明采用本專利中的脂肪酶水解結(jié)合吸附過濾分離在分離牡蠣肽中具有顯著的優(yōu)勢。

牡蠣酶解液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)中長時間加工處理易感染微生物導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。因此，簡化分離工藝，縮短分離提取時間具有重要意義。

如圖2所示，實施例1-3的分離時間較對比例2顯著縮短。實施例與對比例最大的區(qū)別在于實施例采用了本發(fā)明中的乳化劑輔助脂肪酶水解牡蠣酶解液中脂肪組分，促使乳液失穩(wěn)，分離速度加快，提高抽濾效率，降低開發(fā)和加工成本。對比例2中牡蠣蛋白酶解液乳化穩(wěn)定性好，在過濾過程中，乳濁液中的油脂會堵塞濾孔，水分被鎖在乳液體系中難以分離出來，隨著時間的延長分離難度越大，甚至導(dǎo)致無法分離。因此，單獨采用真空抽濾分離牡蠣肽(牡蠣肽B)，分離時間過長，不適于工業(yè)生產(chǎn)。

目標牡蠣肽的純度直接反映了產(chǎn)品的品質(zhì)，決定了產(chǎn)品的銷售價格。由圖3和圖4可看出，本發(fā)明中分離方法獲得的牡蠣肽(牡蠣肽1、2、3)含量肽含量高，脂肪含量低。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。