本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)高敏監(jiān)測(cè)水體PAHs污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)階段環(huán)境污染尤其是水污染在世界各地普遍存在。水質(zhì)的污染不僅會(huì)影響水生生物的生存與繁殖，而且污染物會(huì)通過生物富集濃縮作用到達(dá)食物鏈的終端，嚴(yán)重影響人類健康。近年來，人們?cè)诃h(huán)境中頻繁地檢測(cè)出多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物，研究表明這類污染物已對(duì)水環(huán)境、土壤及沉積物中生物的生存造成了嚴(yán)重威脅。其中環(huán)境水體中的有機(jī)污染物以芳香烴類污染物為主。傳統(tǒng)檢測(cè)芳香烴類污染物毒性效應(yīng)的方法一般分為體外測(cè)試(In vitro test)和體內(nèi)測(cè)試(In vivo test)。但是體外測(cè)試不能體現(xiàn)對(duì)整個(gè)生物體的影響，體內(nèi)測(cè)試又具有操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)昂貴且對(duì)低濃度暴露的反應(yīng)不穩(wěn)定等問題，因此，目前研究中較傾向于利用組合分層式檢測(cè)方法(Tiered test)測(cè)試芳香烴類污染物的毒性效應(yīng)。但是該方法仍耗時(shí)、耗力且需要專業(yè)技術(shù)人員完成，而且不能用于現(xiàn)場(chǎng)直觀監(jiān)測(cè)。

斑馬魚以其獨(dú)特性可作為理想的環(huán)境監(jiān)測(cè)模式生物。現(xiàn)階段，已有部分國(guó)家使用野生型斑馬魚對(duì)水體環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)，轉(zhuǎn)基因魚監(jiān)測(cè)該類污染物的技術(shù)也隨之產(chǎn)生。2001年Mattingly等首次證實(shí)斑馬魚的轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別人的AhREs，在TCDD的誘導(dǎo)下可驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，但是他們僅研究了芳香烴受體及其下游基因的功能，并沒有將其應(yīng)用于活體監(jiān)測(cè)芳香烴類污染物。Payne觀察到在石油污染的海水中，可誘導(dǎo)青鱸的CYP1A1活性出現(xiàn)變化，并通過檢測(cè)苯并芘羥化酶的活性誘導(dǎo)效果監(jiān)控海上的石油污染。此后，Nebert等利用包含AhREs的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LUC報(bào)告基因的表達(dá)，研制出轉(zhuǎn)基因斑馬魚來檢測(cè)水體中芳香烴族有機(jī)污染物,但他們研制的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中LUC報(bào)告基因不能傳至F₂代。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)高敏監(jiān)測(cè)水體PAHs污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種監(jiān)測(cè)水體環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的培養(yǎng)方法，包括步驟：

(1)提供水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和熒光蛋白序列；

(2)提供熒光信號(hào)放大載體，包括步驟：在步驟(1)所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體的熒光蛋白序列之后克隆入轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64編碼序列，獲得熒光信號(hào)放大載體；

(3)將水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體和熒光信號(hào)放大載體與I-SceI酶共同注射入魚的受精卵，培養(yǎng)，獲得監(jiān)測(cè)水體環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

優(yōu)選地，所述魚為斑馬魚，但是在其他魚類也可適用。

優(yōu)選地，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件為多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件，本方法但同樣也適用于雌激素反應(yīng)元件EREs、金屬反應(yīng)原件MREs和親電性響應(yīng)元素EpREs等。所述多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件含有如SEQ ID NO.16所示的序列。

優(yōu)選地，所述熒光蛋白為eGFP，但同樣也適用其他熒光蛋白如RFP、CFP、YFP和mCherry等。

本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體為多環(huán)芳香烴響應(yīng)載體pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP，所述多環(huán)芳香烴響應(yīng)載體含有如SEQ ID NO.14所示的序列。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64含有如SEQ ID NO.17所示的序列。

在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光信號(hào)放大載體為pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF，所述熒光信號(hào)放大載體含有如SEQ ID NO.15所所示的序列。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)還包括純系轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的篩選，包括步驟：將注射后的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚P₀培育至性成熟，然后與野生型魚雜交，收集魚卵，TCDD暴露，篩選出可表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₁代；將所述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₁代再與野生型斑馬魚進(jìn)行雜交，收集魚卵，TCDD暴露，篩選出可表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚雜合體F₂代；然后將雜合體F₂代雌雄魚進(jìn)行自交，篩選出其中轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₃代中的純合體，即為純系轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

進(jìn)一步優(yōu)選地，篩選轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₃代中的純合體，包括步驟：將轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₃代繼續(xù)與野生型魚雜交，如果后代胚胎發(fā)綠色熒光比例為100％，則F₄代的親本F₃為純系 轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種由前述方法培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚為轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚。

所述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚能夠穩(wěn)定遺傳且具有熒光強(qiáng)度放大功能，能夠高敏監(jiān)測(cè)水環(huán)境污染物。

本發(fā)明的第三方面，提供了前述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚用于檢測(cè)水環(huán)境污染物的用途。

本發(fā)明的第四方面，提供一種載體組合，包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體和熒光信號(hào)放大載體，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和熒光蛋白序列；所述熒光信號(hào)載體為在所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體的熒光蛋白序列之后克隆入轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64編碼序列獲得。

本發(fā)明的第五方面，提供了前述載體組合用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明公開了一種對(duì)水體持久性有機(jī)污染物多環(huán)芳烴(PAHs)高度敏感的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚的制備方法。針對(duì)目前已有環(huán)境監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚存在可監(jiān)測(cè)濃度較低、熒光強(qiáng)度不足的缺陷，本發(fā)明提供了一種熒光信號(hào)放大系統(tǒng)，研制出對(duì)水體中多環(huán)芳烴類(PAHs)有機(jī)污染物具有更高敏感度的監(jiān)測(cè)斑馬魚。

本發(fā)明主要是利用UAS-Gal4基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，用優(yōu)化重組的多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件AhREs替換上游質(zhì)粒Gal4中的啟動(dòng)子，達(dá)到響應(yīng)水體環(huán)境中多環(huán)芳香烴，產(chǎn)生的Gal4蛋白結(jié)合下游質(zhì)粒中UAS序列，達(dá)到激活熒光蛋白基因eGFP的目的，此為一個(gè)2級(jí)信號(hào)放大系統(tǒng)。同時(shí)，我們利用TALE-TF轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)技術(shù)，進(jìn)一步對(duì)eGFP基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行增強(qiáng)，最終達(dá)到多重信號(hào)放大效應(yīng)。在利用I-SceI大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，獲得2個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚后，通過不斷篩選最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳且具有熒光強(qiáng)度放大功能的高敏型多環(huán)芳香烴類污染物監(jiān)測(cè)熒光斑馬魚。

附圖說明

圖1：本發(fā)明構(gòu)建的pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP載體示意圖。

圖2：本發(fā)明構(gòu)建的pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF熒光信號(hào)放大載體示意圖。

圖3：經(jīng)篩選所得F₃代純合子，通過不同濃度梯度TCDD誘導(dǎo)熒光表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果。

圖4：通過TALE-TF放大的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚在TCDD暴露下熒光強(qiáng)度的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1

一、構(gòu)建具有響應(yīng)水體環(huán)境中多環(huán)芳香烴的GAL4-UAS上游響應(yīng)載體

1.多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件AhREs的合成：

選取AhREs序列的一個(gè)突變體：TCCGGTCCTTCTCACGCAACGCCTGGG(SEQ ID NO.1)為基本元件。

人工合成3拷貝數(shù)同向串聯(lián)的，包含相應(yīng)酶切位點(diǎn)與下游部分TATA-box序列的基因片段NotI-NheI-AhREs-SpeI-M.EcoP15I-NcoI-TATA+-PstI：

5’-GCGGCCGCGCTAGCTCCGGTCCTTCTCACGCAACGCCTGGGTCCGGTCCT TCTCACGCAACGCCTGGGTCCGGTCCTTCTCACGCAACGCCTGGGACTAGTCAGCAGCCATGGTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAG-3’(SEQ ID NO.2)(下劃線部分為酶切位點(diǎn)，粗體為3倍串聯(lián)的AhREs突變體序列，斜體為AhREs下游TATA-box的部分序列)。

將人工合成片段NotI-NheI-AhREs-SpeI-EcoP15I-NcoI-TATA+-PstI導(dǎo)入質(zhì)粒pJWR，構(gòu)成質(zhì)粒pJER-A。

11.后續(xù)元件GAL4-VP16的設(shè)計(jì)：

以實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒pM3VP16為模板，PCR擴(kuò)增PstI-TATA--GAL4-VP16-XbaI序列。總序列大小854bp。

具體操作步驟如下：

PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pM3VP16的GAL4-VP16序列，前引物P1帶有PstI酶切位點(diǎn)和AhREs下游TATA-box的剩余部分序列(斜體)，P1引物的序列為：PstI-TATA^--G⁺：5’-CTGCAGCGACCCGCTTAAAAGATCCAGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACA A-3’(SEQ ID NO.3)；后引物P2帶有XbaI酶切位點(diǎn)，P2引物的序列為：XbaI-VP16-：5’-TCTAGAACCAAATAATCAGACGACAACCGC-3’(SEQ ID NO.4)。PCR擴(kuò)增TATA--GAL4-VP16片段：PCR程序?yàn)?5℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，除去PCR反應(yīng)體系中的鹽離子、酶及引物等雜物。純化后產(chǎn)物用pMD^TM19-T Vector Cloning Kit試劑盒進(jìn)行TA克隆，反應(yīng)體系為10μL，其中SolutionI 5μL，PMD19-T vector 0.5μL，TATA^--GAL4-VP16片段4.5μL，連接產(chǎn)物16℃連接過夜，后續(xù)轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性篩選過程同上。收集陽(yáng)性菌液并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將得到質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此中間載體命名為pTATA--GAL4-VP16-TA(SEQ ID NO.5)。

以PstI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pJER-A和pTATA^--GAL4-VP16-TA。反應(yīng)體系為20μL，其中PstI和XbaI內(nèi)切酶各1μL，反應(yīng)緩沖液2μL，DNA模板3μL，無菌水13μL，37℃保溫3h。酶切完成后，將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割取pTATA^--GAL4-VP16-TA酶切產(chǎn)物約850bp的片段作為插入片段，割取pJER-A酶切產(chǎn)物中約2900bp片段作為骨架。經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接體系為插入片段10μL，骨架0.5μL，緩沖液2μL，T4連接酶1μL，滅菌水6.5μL。后續(xù)轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證方法同TA克隆，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。收集菌液 并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將得到質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此載體即為包含AhREs-TATAbox-GAL4-VP16基因序列載體pAhREs-TATAbox-GAL4-VP16。

以NotI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pAhREs-TATAbox-GAL4-VP16和實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒pISCE-I-zHSP70-mir30。酶切體系及條件同上。酶切完成后，將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割取前者產(chǎn)物約1000bp的片段作為插入片段，割取后者約3100bp片段作為骨架。后續(xù)連接、轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證方法同上，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。收集菌液并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將得到質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此載體即為能夠響應(yīng)水體環(huán)境中多環(huán)芳香烴，并產(chǎn)生GAL4蛋白的質(zhì)粒pI-SceI/3*AhREs-Gal4(SEQ ID NO.7)。

二、構(gòu)建具有放大作用的帶eGFP熒光蛋白的GAL4-UAS下游顯色載體

首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有載體pG5-Luc設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別為：

P1-M13-48-NotI：5’-GCGGCCGCAGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ ID NO.8)；

P2-NcBg-G5UP-A-AgeI：5’-ACCGGTTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG-3’(SEQ ID NO.9)；

以載體pG5-Luc為模板，PCR擴(kuò)增UAS+PE1B+TATA片段。PCR程序?yàn)?5℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，除去PCR反應(yīng)體系中的鹽離子、酶及引物等雜物。純化后產(chǎn)物用pMD^TM19-T Vector Cloning Kit試劑盒進(jìn)行TA克隆，反應(yīng)體系為10μL，其中SolutionI 5μL，PMD19-T vector 0.5μL，UAS+PE1B+TATA片段4.5μL，連接產(chǎn)物16℃連接過夜，連接產(chǎn)物10μL轉(zhuǎn)化90μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用移液器輕輕吸打混勻，冰上孵育30min后，42℃熱激90s，立即置于冰上2min，加入37℃LB培養(yǎng)基900μL，于37℃180rpm搖床活化1h，活化后菌液5000rpm離心3min富集，吸掉900上清液，100μL菌液混勻后涂于氨芐抗性培養(yǎng)皿上并于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選10個(gè)單菌落利用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。收集菌液并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將得到質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此中間載體命名為pUAS+PE1B+TATA-TA(SEQ ID NO.10)。

以NotI和AgeI雙酶切質(zhì)粒pUAS+PE1B+TATA-TA。反應(yīng)體系為20μL，其中NotI和AgeI內(nèi)切酶各1μL，反應(yīng)緩沖液2μL，DNA模板3μL，無菌水13μL，37℃保溫3h。實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pISCE-I-zHSP70-mir30同時(shí)進(jìn)行雙酶切，體系如上。酶切完成后，將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，前者割取約280bp的片段作為插入片段，割取質(zhì)粒pI-SceI-zHSP70-mir30中約4000bp片段作為骨架。經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接體系為插入片段10μL，骨架0.5μL，緩沖液2μL，T4連接酶1μL，滅菌水6.5μL。后續(xù)轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證方法同TA克隆，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。收集菌液并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將得到質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此載體即為藍(lán)綠色熒光蛋白載體pI-SceI/UAS-eGFP(SEQ ID NO.11)。

三、構(gòu)建具有TALE-TF放大eGFP熒光蛋白作用的GAL4-UAS下游顯色載體

最后結(jié)合TALE-TF技術(shù)。在選取pI-SceI/UAS-eGFP質(zhì)粒上(T)AATACGACTCACTAT(SEQ ID NO.12)作為識(shí)別靶序列，人工設(shè)計(jì)合成NLS-TALE-TF-VP64序列上游，添加2A Peptide序列。最終在此合成T2A-NLS-TALE-TF-VP64序列兩端添加BglII和SpeI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成z質(zhì)粒pBglII-T2A-NLS-TALE-TF-VP64-SpeI。

以BglII和SpeI雙酶切質(zhì)粒pBglII-T2A-NLS-TALE-TF-VP64-SpeI和pI-SceI-CMV-eGFP。反應(yīng)體系為20μL，其中BglII和SpeI雙內(nèi)切酶各1μL，反應(yīng)緩沖液2μL，DNA模板3μL，無菌水13μL，37℃保溫3h。酶切完成后，將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，前者割取約2400bp的片段作為插入片段，割取質(zhì)粒pI-SceI-CMV-eGFP中約4500bp片段作為骨架。經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接及后續(xù)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證方法同上，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。收集菌液并根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。將得到質(zhì)粒繼續(xù)用AgeI和SpeI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，割取約3200bp的片段作為插入片段。同時(shí)AgeI和SpeI雙酶切紅色熒光蛋白載體pI-SceI/UAS-eGFP，割取其中3500bp片段作為骨架。片段與骨架用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接體系及后續(xù)檢測(cè)同上。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，此載體即為最終具有放大效應(yīng)的紅色熒光顯色載體pI-SceI/UAS-eGFP-TALE-TF(SEQ ID NO.13)。

四、構(gòu)建PAHs誘導(dǎo)型熒光蛋白表達(dá)重組轉(zhuǎn)座載體為pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP和pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF

在上述步驟的基礎(chǔ)上，利用已經(jīng)構(gòu)建好的pI-SceI/3*AhREs-Gal4、pI-SceI/UAS-eGFP和pI-SceI/UAS-eGFP-TALE-TF基礎(chǔ)上，通過ApaI和NotI雙酶切上述3個(gè)質(zhì)粒，T4 DNA連接酶4℃連接，構(gòu)建pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP(示意圖如圖1所示)

和pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF(示意圖如圖2所示)。

所述pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP含有如SEQ ID NO.14所示的序列。所述pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF含有如SEQ ID NO.15所示的序列。

五、魚卵顯微注射

利用顯微注射儀和參照顯微注射法，分別將上述實(shí)施例中構(gòu)建好的載體pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP和pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF注射斑馬魚單細(xì)胞受精卵。注射液體系為10μL，其中質(zhì)粒30ng/μL，I-SceI緩沖液0.5×，I-SceI酶0.3U/μL，補(bǔ)水至10μL。取2μL注射液注入毛細(xì)針管中，將其裝入注射儀中，按順序注射受精卵動(dòng)物極。整個(gè)操作過程在45min內(nèi)完成，以確保在細(xì)胞第一次卵裂之前注射完成。注射后的受精卵培養(yǎng)于28℃，培養(yǎng)至性成熟后。

六、篩選穩(wěn)定表達(dá)的純合子親本

篩選穩(wěn)定遺傳純系轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，首先將注射后的轉(zhuǎn)基因魚P₀培育至性成熟，與野生型斑馬魚雜交，收集魚卵，低濃度TCDD暴露，篩選出可表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚F₁代。將F₁代轉(zhuǎn)基因斑馬魚再與野生型斑馬魚進(jìn)行雜交，同樣運(yùn)用低濃度TCDD暴露篩選的方法獲得雜合體F₂代。將這些發(fā)熒光的雜合體F₂代雌雄魚進(jìn)行自交，其后代F₃中，有1/4概率得到Tg(I-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP)和Tg(I-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF)的純合體F₃。為驗(yàn)證純合子F₃，將轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₃代繼續(xù)與野生型魚雜交，如果后代胚胎發(fā)綠色熒光比例為100％，則可以將親本F₃作為純系來養(yǎng)殖。

如圖4所示，通過熒光強(qiáng)度測(cè)定，通過TALE-TF放大的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚，在相同TCDD暴露濃度下，其熒光強(qiáng)度是沒有放大的16～200倍，尤其是在較低濃度下，其放大效應(yīng)更敏感。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。