本發(fā)明屬于有機光電材料領(lǐng)域,涉及一種溫敏探針,具體為一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
近年來,隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展,人們對細胞內(nèi)的溫度變化的研究越來越深入。細胞內(nèi)溫度與細胞中的每個生物反應(yīng)息息相關(guān),如酶反應(yīng)、基因表達、細胞分裂、新陳代謝等。每一個生物反應(yīng)都是吸熱或者放熱的,因此,不同部位的細胞因發(fā)生不同的生物反應(yīng)而有所差異。在病理研究中,發(fā)現(xiàn)一些惡性細胞組織由于異常的代謝率使其溫度高于健康細胞組織。因此,活細胞內(nèi)溫度的精確檢測和實時溫度檢測有助于診斷和治療方法的發(fā)展。目前用于細胞溫度檢測的熒光探針大多是有機熒光染料,它們?yōu)榧毎麥囟葯z測提供了有效地?zé)晒馓结槨H欢?,這些有機分子由于光穩(wěn)定性差,背景熒光干擾大,細胞毒性大等缺點限制了其在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用。
發(fā)光稀土配合物具有獨特的光學(xué)性能,如發(fā)光壽命長、色純度高、斯托克斯位移大、量子效率高等,使其在生物成像、醫(yī)學(xué)分析等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。稀土離子的敏化發(fā)光研究一直是有機稀土發(fā)光領(lǐng)域研究的熱點問題,因為在生物成像和檢測領(lǐng)域,與紫外光激發(fā)相比,可見光激發(fā)可降低對生物組織的損傷、降低背景光干擾等優(yōu)點。稀土離子的敏化發(fā)光的研究難點主要集中在如何制備高效發(fā)光、且在水溶液中能夠穩(wěn)定存在的配合物,近年來,關(guān)于制備敏化銪離子發(fā)光的化合物的報道層出不窮,但從目前研究來看,能夠在可見光激發(fā)下高效敏化三價銪離子發(fā)光的過渡金屬配合物還是非常有限的。因此,選擇合適的過渡金屬配合物作為“天線分子”來敏化銪離子發(fā)光并引入溫敏基團制備比率熒光溫敏探針對生物成像及可視化溫度檢測具有重要意義。
目前,實現(xiàn)細胞內(nèi)溫度檢測的探針主要是單發(fā)射的有機染料作為熒光發(fā)色團,但是該檢測探針具有溫度分辨率低、細胞毒性大等缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
解決的技術(shù)問題:為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,獲得一種細胞毒性小、具有良好可逆性、對溫度響應(yīng)靈敏的溫敏探針,且該探針可適用于水溶液、細胞及活體的溫度檢測,本發(fā)明提供了一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)方案:
一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針,所述探針的結(jié)構(gòu)通式如下:
其中O^O配體的結(jié)構(gòu)為:
a、b、c、d分別表示各物質(zhì)的摩爾百分含量,且a+b+c+d=100%。
優(yōu)選的,所述a<1%,b≥95%,c<5%,d<2%。
一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針的制備方法,包含以下步驟:
第1步、銪配合物的合成
(1)采用濃硫酸(AR)和濃硝酸(AR)(v:v=9:5)在160~170℃條件下硝化1,10-鄰菲啰啉得到5-硝基-1,10菲啰啉;
(2)采用水合肼和催化劑還原5-硝基-1,10菲啰啉,再與丙烯酰氯在乙腈或其他有機溶劑中酰胺化反應(yīng)得到N^N配體;
(3)將O^O配體和EuCl3·6H2O置于甲醇或乙醇中,調(diào)節(jié)溶液pH至6~8,60℃條件下回流反應(yīng),再加入步驟(2)獲得的N^N配體繼續(xù)反應(yīng),即可合成銪配合物,銪配合物的結(jié)構(gòu)通式為:
第2步、銥配合物的合成
(1)氮氣保護條件下,將2,4-二氟苯硼酸和2-溴吡啶加入甲苯、乙醇、飽和K2CO3溶液的混合溶液中,80℃條件下避光密閉反應(yīng)12h,其中甲苯、乙醇、飽和K2CO3溶液三者的體積比為3:1:1,柱層析得主配體dfppy;
(2)氮氣保護條件下,將IrCl3·3H2O和dfppy加入乙二醇乙醚、水的混合溶液中,110℃條件下密閉反應(yīng)24h,其中乙二醇乙醚與水的體積比為3:1,得到[Ir(dfpp)2Cl2]2;
(3)氮氣保護條件下,將[Ir(dfpp)2Cl2]2和1-羥基-2-吡啶羧酸加入乙二醇乙醚中,110℃條件下下密閉反應(yīng)12h,柱層析得到[Ir(dfpp)2(hpa)];
(4)將[Ir(dfpp)2(hpa)]和3-溴丙烯置于N,N-二甲基甲酰胺或其他有機溶劑中,常溫條件反應(yīng),反應(yīng)完成后,經(jīng)萃取、薄層層析得到[Ir(dfpp)2(apa)],銥配合物的結(jié)構(gòu)式為:
第3步、聚合物的合成
在氮氣保護條件下,將NIPAM(N-isopropylacrylamide,N-異丙基丙烯酰胺)、ATPMA(3-acrylamido-N,N,N-trimethylpropan-1-aminium chloride)、銥配合物、銪配合物在四氫呋喃或其他有機溶劑中由AIBN(azodiisobutyronitrile,偶氮二異丁腈)做引發(fā)劑,80℃條件下密閉反應(yīng),反應(yīng)完成后,在乙醚或其他有機溶劑中沉降得到聚合物。
優(yōu)選的,當NIPAM、ATPMA、銥配合物、銪配合物投料摩爾百分數(shù)分別為94%,4.8%,0.8%,0.4%,AIBN為總物質(zhì)的量的2%時,所制得的探針性能較佳。
一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針在對水溶液、細胞或活體內(nèi)溫度檢測中的應(yīng)用。
一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針在細胞成像、活體成像中的應(yīng)用。
一種基于銪配合物的可見光可激發(fā)的比率熒光溫敏探針在生物標記中的應(yīng)用。
優(yōu)選的,所述細胞及活體內(nèi)溫度檢測采用比率法或比色法。
有益效果:(1)所述探針隨著溫度的變化銥和銪的發(fā)射強度比率發(fā)生明顯變化,對溫度響應(yīng)十分靈敏;(2)所述探針具有良好的可逆性;(3)所述探針具有良好的穩(wěn)定性和水溶性;(4)所述探針具有良好的生物相容性,可用于水溶液、細胞或活體的溫度檢測,在生物溫度檢測、生物成像、生物標記領(lǐng)域具有重要意義。
附圖說明
圖1是銪配合物和銥配合物的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射歸一化光譜圖;
圖2是銥配合物敏化銪配合物發(fā)射光譜圖;
圖3是聚合物探針在水溶液中的熒光發(fā)射強度對溫度的響應(yīng)性圖;
圖4是聚合物探針在水溶液中溫度與Ir/Eu熒光比率曲線圖;
圖5是聚合物探針在水溶液中Ir/Eu熒光比率的可逆性圖;
圖6是聚合物探針對細胞溫度變化檢測的共聚焦成像圖。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容,但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下,對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換,均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例1探針合成
第1步、銪配合物制備
化合物1:5-硝基-1,10-菲咯啉的制備
在圓底燒瓶中加入5.0g 1,10-鄰菲咯啉,加入45.0mL濃硫酸將其溶解,然后逐滴加入25.0mL濃硝酸,165℃回流反應(yīng)2h,冷卻至室溫,將反應(yīng)液逐滴滴到冰水中。用10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至弱酸性。析出的黃色沉淀為產(chǎn)物,抽濾,清水洗滌并真空干燥。得5.1g(82%)淡黃色固體。GC-MS(EI-m/z):225(M+)。
化合物2:5-氨基-1,10-菲咯啉的制備
將5.0g 5-硝基-1,10-菲咯啉,0.9g Pd/C加入圓底燒瓶中,鼓氮排氧,加入150.0mL無水乙醇將其溶解,然后逐滴加入N2H4·H2O,氮氣保護下,70℃回流反應(yīng)12h,反應(yīng)完趁熱過濾掉Pd/C催化劑,用乙醇洗滌,將濾液蒸干,得黃色固體,用乙醇重結(jié)晶,得黃色針狀固體(3.2g,74%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)9.21(d,1H),8.95(d,1H),8.28(d,1H),7.99(d,1H),7.66(dd,1H),7.52(dd,1H),6.9(s,1H),4.3(s,2H)。
化合物3:N^N配體的制備:
將0.3g 5-氨基-1,10-菲咯啉,0.3g K2CO3加入圓底燒瓶,加入80.0mL乙腈將其溶解,冰水浴下加入0.2mL丙烯酰氯,常溫攪拌10h,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液加入適量硅膠粉蒸干,柱層析,得紅色固體(0.22g,58%)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):9.06(dd,J=1.6Hz,4.4Hz,1H),8.99(dd,J=1.6Hz,4.4Hz,1H),8.54(dd,J=1.6Hz,8.4Hz,1H),8.41(dd,J=1.6Hz,8.0Hz,1H),8.14(s,1H),7.76(m,2H),6.69(dd,J=10.4Hz,16.8Hz,1H),6.50(dd,J=1.6Hz,16.8Hz,1H),5.92(dd,J=1.6Hz,10.4Hz,1H)。
化合物4:銪配合物的制備:
將100.0mg EuCl3·6H2O和182.0mg TTA溶解在EtOH中(用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至7),60℃下回流1h,然后加入N^N配體回流5h,過濾,重結(jié)晶即可得銪配合物。
第2步、銥配合物制備
化合物1:主配體dfppy的制備:
稱取2.0g 2,4-二氟苯硼酸,2.0g 2-溴吡啶于圓底燒瓶,鼓氮排氧,加入100.0mL的甲苯、乙醇、飽和K2CO3(v:v:v=3:1:1)混合液,氮氣保護下,80℃避光密閉反應(yīng)12h,反應(yīng)完成后,萃取,柱層析(石油醚/二氯甲烷)分離得主配體dfppy(1.52g,63%)。
化合物2:銥二氯橋[Ir(dfpp)2Cl2]2的制備:
稱取420.0mg IrCl3·3H2O,500.0mg dfppy于圓底燒瓶中,鼓氮排氧,加入12.0mL乙二醇乙醚、水(v:v=3:1)混合液,氮氣保護下,110℃密閉反應(yīng)24h,反應(yīng)完成后,抽濾,收集沉淀,用水洗滌,真空干燥,得黃色固體(636.7mg,86%)。
化合物3:銥配合物[Ir(dfpp)2(hpa)]的制備:
稱取500.0mg[Ir(dfpp)2Cl2]2,125.3mg 1-羥基-2-吡啶羧酸,1.1333g K2CO3于圓底燒瓶中,鼓氮排氧,加入15.0mL乙二醇乙醚將其溶解,氮氣保護下,110℃密閉反應(yīng)12h,反應(yīng)完成后,在水中沉降,抽濾,將濾渣柱層析(石油醚/二氯甲烷),得黃色固體(520.0mg,87%)。
化合物4:銥配合物[Ir(dfpp)2(apa)]的制備:
稱取100.0mg[Ir(dfpp)2(hpa)]于圓底燒瓶,加入5.0mL DMF將其溶解,然后加入16.9mg3-溴丙烯,25℃下攪拌12h,反應(yīng)完成后,萃取,濃縮,薄層層析,得黃色固體(73.0mg,69%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.60(d,J=5.6Hz,1H),8.26(dd,J=8.4Hz,18.8Hz,2H),8.09-8.00(m,2H),7.81(d,J=8.8Hz,1H),7.68(d,J=6.0Hz,1H),7.56-7.49(m,2H),7.36-7.30(m,2H),6.86-6.75(m,2H),6.09-6.00(m,1H),5.70-5.60(m,2H),5.46(dd,J=2.4Hz,8.8Hz,1H),5.29(dd,J=2.4Hz,10.8Hz,1H),4.71(dd,J=1.6Hz,4.4Hz,2H)。
第3步、聚合物合成
化合物1:聚合物探針的制備:
稱取347.3mg NIPAM、32.3mg ATPMA、20.0mg銥配合物、13.9mg銪配合物、10.7mgAIBN(2%),鼓氮排氧,加入2.0mL THF將其溶解,氮氣保護下,80℃密閉反應(yīng)12h,在乙醚中沉降3次得到聚合物。
實施例2 P1發(fā)射光譜測試
配置實施例1獲得的P1的稀溶液,以水為溶劑,移取2.0mL溶液于熒光比色皿中,然后37℃下使用不同的激發(fā)波長測試,如圖2所示,波長分別為405nm、413nm、418nm、428nm、438nm、448nm、458nm、468nm、478nm、488nm,測試數(shù)據(jù)表明銥配合物作為“天線分子”可將銪的激發(fā)窗口擴展到468nm的可見光范圍。
不同溫度下發(fā)射光譜測試:如圖3所示,激發(fā)波長為405nm,測試溫度范圍為20~42℃,分別為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃,測試數(shù)據(jù)表明隨著溫度的升高,銥的發(fā)射強度逐漸增強,銪的發(fā)射強度變化不大。
如圖4所示,銥和銪的發(fā)射強度比率與溫度呈線性關(guān)系。
如圖5所示,測試數(shù)據(jù)表明該探針具有良好的可逆性。
實施例3聚合物探針在活細胞中檢測溫度的共聚焦成像實驗
本實施例采用的細胞為人宮頸癌HeLa細胞,在37℃,5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時使之貼壁,加入聚合物探針(5μM),孵育一小時后進行共聚焦實驗,用活細胞工作站控制溫度。如圖6所示,不同溫度下銥的發(fā)射強度有明顯變化,說明該探針可以很好的檢測活細胞的溫度。
本發(fā)明的基于銥配合物敏化銪配合物的比率熒光溫敏探針可以實現(xiàn)雙發(fā)射,兩個熒光峰比值與溫度變化成線性關(guān)系,如圖3所示。該探針具備溫度探測能力,可以實現(xiàn)可視化溫度探測,此外該探針水溶性好,光物理性質(zhì)優(yōu)異,對溫度響應(yīng)靈敏,在生物成像和溫度檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。