本發(fā)明一般涉及乙型病毒性肝炎的診斷和治療，以及感染病學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種血液中乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)DNA和RNA的雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染呈世界流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。我國(guó)屬于中高流行區(qū)。在2006年全國(guó)乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查中，我國(guó)1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18％。據(jù)此推算，我國(guó)慢性HBV感染者約為9300萬人，其中慢性乙型肝炎(慢性乙肝)患者約2000萬例。在我國(guó)，慢性HBV感染與肝硬化、肝癌等終末期肝病的發(fā)生密切相關(guān)。目前治療慢乙肝的藥物主要為干擾素和核苷(酸)類似物兩類。兩類藥物均可高效抑制HBV復(fù)制，但由于肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的持續(xù)存在，使得目前慢乙肝治療的臨床治愈率很低(<5％)，停藥后慢乙肝復(fù)發(fā)率較高，因此慢乙肝患者需要長(zhǎng)期甚至終身服藥。長(zhǎng)期服藥會(huì)給患者甚至社會(huì)帶來極大的負(fù)擔(dān)，并且在治療過程中有可能會(huì)導(dǎo)致HBV耐藥株的出現(xiàn)。而且，目前臨床上檢測(cè)的HBV核酸只是HBVDNA。血清中HBVDNA水平能反映HBV的復(fù)制水平，可作為一個(gè)抗病毒療效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，且有較好的預(yù)后監(jiān)測(cè)價(jià)值(Martinot-PeignouxM,MarcellinP.VirologicalandserologicaltoolstooptimizethemanagementofpatientswithchronichepatitisB[J].LiverInternational,2016,36Suppl1(SupplementS1):78–84.)。在《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中提到，HBVDNA定量檢測(cè)主要用于判斷慢性HBV感染的病毒復(fù)制水平，可用于抗病毒治療適應(yīng)癥的選擇及療效的判斷，并建議采用靈敏度和精確度高的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。目前在臨床上，治療終點(diǎn)分為理想的終點(diǎn)，滿意的終點(diǎn)和基本的終點(diǎn)：理想的終點(diǎn)即為慢性乙肝患者停藥后獲得持久的HBsAg消失；滿意的終點(diǎn)根據(jù)慢性乙肝患者的HBeAg狀態(tài)有所區(qū)別，最終狀態(tài)是HBeAg陰性，有持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答和ALT復(fù)常；基本的終點(diǎn)是抗病毒期間長(zhǎng)期維持病毒學(xué)應(yīng)答。目前HBsAg轉(zhuǎn)陰做為臨床治愈的指標(biāo)，當(dāng)HBsAg轉(zhuǎn)陰時(shí)可安全停藥，但HBsAg轉(zhuǎn)陰率過低，使其臨床應(yīng)用有著很大的限制。因此，基于此，目前迫切需要一種更加靈敏、精確、更加有效的血液學(xué)指標(biāo)，用于監(jiān)測(cè)慢乙肝治療的療效和監(jiān)測(cè)安全停藥(中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J].中華肝臟病雜志(電子版),2015,7(3):1-18.)。根據(jù)我們的前期研究結(jié)果并結(jié)合相關(guān)報(bào)道，已經(jīng)證實(shí)血清中存在HBVRNA，并且其水平動(dòng)態(tài)變化與慢性乙肝治療的療效和預(yù)后密切相關(guān)。我們?cè)谇捌谘芯恐忻鞔_了血清中HBVRNA的存在形式和產(chǎn)生機(jī)制，證實(shí)了血清中的HBVRNA為3.5kb長(zhǎng)的HBVPregenomeRNA(pgRNA)，存在于類似丹氏顆粒的病毒顆粒的核衣殼內(nèi)，其來源為未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄或不完全逆轉(zhuǎn)錄的情況下，獲得病毒外包膜并分泌至細(xì)胞外(JieW,TaoS,HuangX,etal.SerumhepatitisBvirusRNAisencapsidatedpregenomeRNAthatmaybeassociatedwithpersistenceofviralinfectionandrebound[J].JournalofHepatology,2016.)。由此可見，血清中的HBV病毒核酸既有存在于丹氏顆粒內(nèi)的HBVDNA，也有存在于RNA病毒樣顆粒內(nèi)的pgRNA。由于核苷(酸)類似物作用于乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄和DNA合成過程，能夠抑制HBVDNA的產(chǎn)生，但對(duì)pgRNA病毒樣顆粒的產(chǎn)生則無直接抑制作用。因此HBVDNA和HBVRNA的動(dòng)態(tài)變化能夠和好反映抗病毒治療的療效。乙肝病毒的基因組全長(zhǎng)為3.2kb，而pgRNA是為病毒逆轉(zhuǎn)錄合成子代病毒DNA的模板，其大小則為3.5kb。其是以被感染肝細(xì)胞核內(nèi)的HBVcccDNA為模板，部分重復(fù)轉(zhuǎn)錄形成的，而整合的HBV基因組則不能產(chǎn)生。因此，定量檢測(cè)血清HBVpgRNA的水平可更好地監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的水平和轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，不失為一種良好的檢測(cè)慢性乙肝治療療效和安全停藥的預(yù)測(cè)指標(biāo)。另外本室之前的研究表明HBVRNA的水平和停藥后患者的復(fù)發(fā)有關(guān)，因此，HBVRNA可做為一個(gè)潛在的判斷核苷(酸)類似物治療過程中安全停藥的監(jiān)測(cè)指標(biāo)(JieW,TaoS,HuangX,etal.SerumhepatitisBvirusRNAisencapsidatedpregenomeRNAthatmaybeassociatedwithpersistenceofviralinfectionandrebound[J].JournalofHepatology,2016.)。因此，本發(fā)明旨在建立一種高度靈敏和特異的可同時(shí)檢測(cè)血液中HBVDNA和HBVRNA的雙通道熒光定量PCR方法，用于臨床上評(píng)價(jià)慢性乙肝抗病毒治療的療效并指導(dǎo)其安全停藥。開發(fā)靈敏、精確、更加有效的定量檢測(cè)血液中RNA和DNA雙通道的診斷試劑或試劑盒對(duì)于臨床上慢乙肝的有效治療和安全停藥具有重要的指導(dǎo)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，本發(fā)明提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)體液HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR的寡核苷酸組，其特征在于，所述寡核苷酸組包括用于體液HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性地?cái)U(kuò)增的專用引物以及反向錨定引物。在一些實(shí)施例中，如前所述寡核苷酸組還包括與所述專用引物配合使用的特異性地?cái)U(kuò)增的專用探針。在一些具體實(shí)施例中，特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVDNA的專用引物選自SEQIDNOs﹕1、2、3和4的上游引物與選自SEQIDNOs﹕5和6的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸；特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVRNA的專用引物選自SEQIDNO﹕8的上游引物與選自SEQIDNOs﹕9、10和16的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸；反向錨定引物選自SEQIDNOs﹕11和12。在一些具體實(shí)施例中，特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVDNA的專用引物選自SEQIDNO﹕1的上游引物與選自SEQIDNO﹕6的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸；特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVRNA的專用引物選自SEQIDNO﹕8的上游引物與選自SEQIDNOs﹕9的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸；反向錨定引物選自SEQIDNO﹕11。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，擴(kuò)增RNA正向引物SEQIDNO﹕8為AGACCACCAAATGCCCCT；反向引物SEQIDNO﹕16為(N)16-30。(N)16-30是指作為隨機(jī)錨定序列的核苷酸序列，N可為A、T、C或G，且下角標(biāo)處16-30表示堿基數(shù)目。反向錨定引物SEQIDNO﹕17為(N)16-30-AGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA。SEQIDNO﹕16和SEQIDNO﹕17中的(N)16-30表示相同的隨機(jī)錨定序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，雖然(N)16-30為隨機(jī)序列，但為了保證擴(kuò)增的效率，其應(yīng)避免設(shè)計(jì)成為與HR-F或Probe-HR形成引物二聚體。此外，為了增加擴(kuò)增的效率，在引物兩端添加隨機(jī)堿基后形成的引物序列也涵蓋在本發(fā)明中。在一些具體實(shí)施例中，特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVDNA的專用探針選自SEQIDNO﹕7所示的核苷酸序列；特異性地?cái)U(kuò)增體液HBVRNA的專用探針選自SEQIDNO﹕13所示的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施例中，所述探針為TaqMan探針、MGB探針、雜交探針中的一種。在一些具體實(shí)施例中，連接所述探針5’端的是一種熒光報(bào)告基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的任意一種，且擴(kuò)增DNA的專用探針和擴(kuò)增RNA的專用探針具有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)；并且，連接所述探針3’端的是一種熒光猝滅基團(tuán)，所述熒光猝滅基團(tuán)選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse中的任意一種。另一方面，本發(fā)明還提供了一種同時(shí)檢測(cè)體液HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，其特征在于，所述體系包括前述任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸組。本發(fā)明還提供了如前任一項(xiàng)所述的寡核苷酸組或如前所述的檢測(cè)體系在制備HBV診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了如前任一項(xiàng)所述的寡核苷酸組或如前所述的檢測(cè)體系在制備用于慢性乙肝抗病毒治療的療效評(píng)價(jià)和/或安全停藥、治療終點(diǎn)監(jiān)測(cè)的HBV診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。血清中HBVDNA水平能反映HBV的復(fù)制水平，可作為一個(gè)抗病毒療效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，且有較好的預(yù)后監(jiān)測(cè)價(jià)值。因此，本發(fā)明中所述的寡核苷酸組或所述檢測(cè)體系在制備HBV診斷試劑或試劑盒的應(yīng)用中，用于慢性乙肝抗病毒治療的療效評(píng)價(jià)和/或安全停藥、治療終點(diǎn)監(jiān)測(cè)的HBV診斷試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另一方面，本發(fā)明還提供了一種同時(shí)檢測(cè)體液HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如前任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸組。本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述試劑盒還包括DNA標(biāo)準(zhǔn)品、RNA標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品為包含SEQIDNO:14所示的核苷酸序列的pESAY-Blunt質(zhì)粒；所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增引物是由SEQIDNO﹕1所示的上游引物與SEQIDNO﹕6所示的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸；所述RNA標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增引物是由SEQIDNO﹕8所示的上游引物與SEQIDNO﹕9所示的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸。再一方面，本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的同時(shí)檢測(cè)體液中HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法使用如前任一項(xiàng)所述的寡核苷酸組或如前所述的檢測(cè)體系或如前任一項(xiàng)所述的試劑盒。在一些具體實(shí)施例中，所述雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的退火溫度為58-60℃。在一些具體實(shí)施例中，所述雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為：50℃，5分鐘；95℃，10分鐘；94℃，15秒；50℃，45秒，共45個(gè)循環(huán)。在一些具體實(shí)施例中，所述檢測(cè)方法的步驟包括：步驟1.提取體液中HBV核酸(包括HBVDNA和RNA)，其中用反向錨定引物將HBVRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以及步驟2.以HBVDNA和逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性地?cái)U(kuò)增的專用引物、專用探針擴(kuò)增DNA和RNA；或者以HBVDNA和逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性地?cái)U(kuò)增的專用引物擴(kuò)增，并摻入熒光染料，以SYBRGreen法定量檢測(cè)體液中的HBVDNA和RNA。在本發(fā)明中，所述的體液包括血液、尿液和唾液。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次在一個(gè)體系中通過雙通道同時(shí)檢測(cè)血液HBVDNA和RNA，在保持了良好的靈敏度和特異性重復(fù)性的基礎(chǔ)上，使得檢測(cè)時(shí)間大幅度減少，實(shí)際操作簡(jiǎn)便、快捷。除此之外，本發(fā)明還在逆轉(zhuǎn)錄引物上加上了一段人工設(shè)計(jì)的錨定序列用來排除在檢測(cè)過程中HBVDNA帶來的可能干擾，確保了血液HBVRNA檢測(cè)的特異性。本發(fā)明的特異性引物和探針可檢測(cè)A-H所有基因型HBV，包括我國(guó)主要存在A-D型HBV。本發(fā)明的引物、探針和錨定序列是在最初設(shè)計(jì)的多條序列的基礎(chǔ)上，通過多輪篩選和優(yōu)化后確定的特異性和靈敏度最優(yōu)的序列。附圖說明圖1示出MegAlign軟件分析針對(duì)不同基因型HBVDNA檢測(cè)的上下游引物和探針序列的保守性。圖2示出利用本發(fā)明實(shí)施的血清HBVDNA和RNA雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)血液HBVDNA和RNA進(jìn)行檢測(cè)的流程圖。圖3示出利用SYBRGreen方法評(píng)價(jià)8對(duì)HBVDNA定量檢測(cè)引物(HD-F+HD-R、HD-F1+HD-R、HD-F2+HD-R、HD-F3+HD-R、HD-F+HD-R1、HD-F1+HD-R1、HD-F2+HD-R1、HD-F3+HD-R1)的擴(kuò)增效率。圖4示出HBVRNA和HBVDNA引物的擴(kuò)增效率。(A)和(B)是將HBVRNA樣品分別進(jìn)行10，100，1000，10000倍梯度稀釋后的檢測(cè)結(jié)果，最終算得擴(kuò)增效率為：0.88665；(C)和(D)是將HBVDNA樣品分別進(jìn)行10，100，1000，10000倍梯度稀釋后的檢測(cè)結(jié)果，最終算得擴(kuò)增效率為：0.88665。圖5示出雙通道體系中HBVDNA檢測(cè)探針的含量。雙通道體系中，在分別加入1.0μL濃度為10μM的HBVDNA和RNA檢測(cè)引物的情況下，分別加入0.4μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL濃度為10μM的用于檢測(cè)HBVDNA的探針以及之前已確定的0.6μL濃度為10μM的用于檢測(cè)HBVRNA的探針時(shí)的擴(kuò)增曲線。圖6示出雙通道體系中HBVDNA檢測(cè)引物的含量。雙通道體系中，在分別加入0.6μL濃度為10μM的HBVDNA和RNA檢測(cè)探針的情況下，分別加入0.5μL、1.0μL、1.5μL濃度為10μM的HBVDNA檢測(cè)引物(HD-F和HD-R1)以及之前已經(jīng)確定的1.0μL濃度為10μM的HBVRNA檢測(cè)引物時(shí)的擴(kuò)增曲線。。圖7示出雙通道定量擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度。(A)分別利用56、58、60、62℃的退火溫度進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線；(B)分別利用54、56、58、60℃的溫度進(jìn)行定量PCR反應(yīng)得到的Ct值。圖8示出標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序結(jié)果。(A)DNA標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)序結(jié)果；(B)RNA標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)序結(jié)果。圖9示出雙通道熒光定量PCR法檢測(cè)HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度。(A)不同終濃度HBVDNA質(zhì)粒經(jīng)過檢測(cè)后的Ct值；(B)利用濃度和Ct值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(C)熒光定量PCR最終得到的擴(kuò)增曲線。圖10示出雙通道熒光定量PCR法檢測(cè)HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度。(A)不同終濃度HBVRNA質(zhì)粒經(jīng)過檢測(cè)后的Ct值；(B)利用濃度和Ct值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(C)熒光定量PCR最終得到的擴(kuò)增曲線。圖11示出單通道熒光定量PCR法檢測(cè)HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度。(A)不同終濃度HBVDNA質(zhì)粒經(jīng)過檢測(cè)后的Ct值；(B)利用濃度和Ct值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(C)熒光定量PCR最終得到的擴(kuò)增曲線。圖12示出單通道熒光定量PCR法檢測(cè)HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度。(A)不同終濃度HBVRNA質(zhì)粒經(jīng)過檢測(cè)后的Ct值；(B)利用濃度和Ct值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(C)熒光定量PCR最終得到的擴(kuò)增曲線。圖13示出利用雙通道檢測(cè)未經(jīng)DnaseI處理的逆轉(zhuǎn)錄樣本。(A)同時(shí)顯示DNA和RNA的擴(kuò)增曲線。(B)經(jīng)VIC通道檢測(cè)的HBVDNA擴(kuò)增曲線。(C)經(jīng)FAM通道檢測(cè)的HBVRNA擴(kuò)增曲線(*表示HBVDNA的擴(kuò)增曲線▲表示HBVRNA的擴(kuò)增曲線)。圖14示出利用雙通道檢測(cè)未經(jīng)DnaseI處理的逆轉(zhuǎn)錄樣本的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式除非特別說明，本發(fā)明的術(shù)語具有本領(lǐng)域通常使用的含義。術(shù)語“核苷酸”旨在包括那些不僅含有已知的嘌呤和嘧啶堿基還含有經(jīng)修飾的其他雜環(huán)堿基的部分。此類修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他雜環(huán)化合物。此外，術(shù)語“核苷酸”包括那些含有半抗原或熒光標(biāo)記以及可以不僅含有常規(guī)核糖和脫氧核糖還含有其他糖的部分。修飾的核苷或核苷酸還可以在糖部分上包含修飾，例如，其中一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素原子或脂族基團(tuán)取代，被官能化為醚、胺等等。術(shù)語“引物”是指長(zhǎng)度通常為約20至30個(gè)堿基的、短的、化學(xué)合成的寡核苷酸。它們與靶DNA雜交，然后靶DNA通過DNA聚合酶復(fù)制產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA鏈。“正向引物”和“反向引物”構(gòu)成PCR中所用的“PCR引物組”，其中它們與互補(bǔ)的DNA鏈雜交，并指導(dǎo)向著彼此復(fù)制，分別產(chǎn)生上鏈和下鏈，導(dǎo)致靶DNA片段以指數(shù)增長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的方法包含對(duì)RNA的(優(yōu)選地3'聚腺苷酸)尾和用于反轉(zhuǎn)錄的(聚腺苷酸)尾上游的最近的1到10個(gè)核苷酸，優(yōu)選地1到5個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地3到5個(gè)核苷酸特異的引物和/或一個(gè)對(duì)cDNA的相應(yīng)的(5'聚胸苷酸)序列特異的擴(kuò)增引物，該序列對(duì)RNA尾(3'聚腺苷酸)尾和cDNA的相應(yīng)的(5'聚胸苷酸)序列下游的最近的的1到10個(gè)核苷酸，優(yōu)選1到5個(gè)核苷酸，更優(yōu)選3到5個(gè)核苷酸互補(bǔ)。相應(yīng)地，除前述公開的引物外，可增加引物對(duì)的選擇能力并因而增加被最接近末端序列錨點(diǎn)的特定核苷酸所確定的cDNA群的數(shù)目。術(shù)語“錨定引物”是指在基因特異性引物的5’末端加入一段修飾序列(包括酶切位點(diǎn)、標(biāo)簽序列和人工設(shè)計(jì)的隨機(jī)序列等)，然后通過逆轉(zhuǎn)錄或PCR擴(kuò)增將該修飾序列錨定在目的基因上，最終以該錨定序列作為引物進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。在一定程度上可提高特定基因檢測(cè)的特異性。術(shù)語“探針”是指用捕獲標(biāo)記或檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記引物，檢測(cè)引物產(chǎn)物。探針序列用于與引物序列所產(chǎn)生的序列進(jìn)行雜交，并且通常與不包括引物序列的序列雜交。與引物序列類似，探針序列也用捕獲標(biāo)記或檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記，需說明的是當(dāng)引物用捕獲標(biāo)記來標(biāo)記時(shí)，用檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記探針，反之亦然。在本發(fā)明中探針可以為TaqMan探針、MGB探針、雜交探針中的一種。比如，所述探針為TaqMan探針，標(biāo)記探針5’端的為一種熒光發(fā)光基團(tuán)，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一種；標(biāo)記探針3’端為一種熒光猝滅基團(tuán)，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一種。下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不在于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)目前，HBV分為至少10種基因型，在我國(guó)存在A～D4種基因型。根據(jù)我國(guó)存在的HBV基因型和國(guó)外常見基因型，發(fā)明人從GenBank中下載多條A～H基因型HBV參考序列，通過MegAlign軟件分析不同基因型HBV基因組的保守序列。遵循引物和探針的設(shè)計(jì)原則，在這些保守區(qū)域中通過PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)了針對(duì)HBVDNA檢測(cè)的多對(duì)引物(表1)。這些序列均為不同基因型HBV的保守序列(圖1)。同時(shí)，設(shè)計(jì)了針對(duì)HBVRNA檢測(cè)的特異性引物和探針序列(表2)。為排除HBVDNA的干擾，發(fā)明人在逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端加入了一段隨機(jī)錨定序列。在上述引物、探針和隨機(jī)錨定序列設(shè)計(jì)過程中，盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯(cuò)配的形成。此外，發(fā)明人通過NCBIBlast在線數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)上述設(shè)計(jì)的HBV特異性引物和探針序列以及隨機(jī)錨定序列進(jìn)行比對(duì)分析避免與其它病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。通過多輪篩選和優(yōu)化，最終確定一套靈敏度和特異度最優(yōu)的引物、探針和隨機(jī)錨定序列，序列如表2所示。表1.針對(duì)HBVDNA檢測(cè)的引物和探針序列序列名稱SEQIDNO序列HD-F1CGGCGTTTTATCATMTTCCTCTHD-F12CGGCGTTTTATCATMTTCCTCHD-F23GCGGCGTTTTATCATMTTCCTHD-F34TGTCTGCGGCGTTTTATCATHD-R5GAGGACAAACGGGCAACATACHD-R16GACAAACGGGCAACATACCTTProbe-HD7CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT其中，Probe-HD的5’端熒光探針為VIC，3’端熒光探針為BHQ1。表2.針對(duì)HBVRNA檢測(cè)的引物和探針序列其中，Probe-HR的5’端熒光探針為FAM，3’端熒光探針為BHQ1。HR-R1、HR-RT1序列的下劃線部分為相同的隨機(jī)錨定序列，HR-R2、HR-RT2序列的下劃線部分為相同的隨機(jī)錨定序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，隨機(jī)錨定序列不影響檢測(cè)的效率，只要盡量不與HR-F或Probe-HR形成引物二聚體即可。實(shí)施例2、檢測(cè)方法的建立提取血液中HBV核酸(包括HBVDNA和RNA)，其中利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物HR-RT將提取出的HBVRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用定量PCR的方法同時(shí)檢測(cè)HBVDNA和RNA的水平(圖2)。HBVRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的具體操作如下，通過RevertAidFirstStrandDNASynthesisKit(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)將血液中提出的HBVRNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)為：反應(yīng)條件為：25℃5分鐘，42℃60分鐘，70℃5分鐘。然后利用HBVDNA和RNA正向和反向引物以及探針序列進(jìn)行定量PCR檢測(cè)擴(kuò)增，利用SYBRGreen方法評(píng)價(jià)了針對(duì)HBVDNA檢測(cè)的不同引物組合的擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示，不同引物組合擴(kuò)增效率無明顯差異(圖3)。隨后，我們比較分析了HBVDNA檢測(cè)引物(HD-F和HD-R1)與HBVRNA檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率，發(fā)現(xiàn)兩組引物擴(kuò)增效率無明顯差異(圖4)?；贖BVRNA檢測(cè)體系為之前優(yōu)化的體系，下面主要探索雙通道檢測(cè)方法中HBVDNA的檢測(cè)體系，確定了用于HBVDNA定量檢測(cè)的探針濃度和引物濃度，并確定了雙通道擴(kuò)增反應(yīng)的溫度。結(jié)果顯示，在確定探針濃度時(shí)，箭頭指示的曲線為加入0.6μL濃度為10μM的探針時(shí)的擴(kuò)增曲線，表明體系中加入0.6μL濃度為10μM的探針時(shí)HBVDNA擴(kuò)增效率最佳(圖5)；在確定引物濃度時(shí)，箭頭指示的曲線為加入1μL濃度為10μM引物時(shí)的擴(kuò)增曲線，表明體系中加入1.0μL濃度為10μM的引物時(shí)HBVDNA的擴(kuò)增效率最佳(圖6)；在確定雙通道擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為58℃和60℃時(shí)的擴(kuò)增效率優(yōu)于其他溫度(圖7)。最終確定的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如下：在ABIStepOnePlus熒光定量PCR儀中的擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為50℃，5分鐘，94℃，10分鐘；然后94℃，15秒，58℃，45秒，45個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的延伸階段(58℃)同步多次采集熒光(FAM和VIC信號(hào)均要采集)。實(shí)施例3、HBVDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建提取HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系HepAD38細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBVDNA，用HD-F和HD-R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的目的片段切膠回收后連接至pEASY-Blunt克隆載體上。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為裝入的目的片段后，作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部檢測(cè)血清HBVDNA的標(biāo)準(zhǔn)品使用。最終目的片段序列為：CGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTC(SEQIDNO﹕14)測(cè)序驗(yàn)證的峰圖如圖8A所示。提取HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系HepAD38細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBVRNA，利用HR-RT逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用HR-F和HR-R進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的目的片段切膠回收后連接至pEASY-Blunt克隆載體上。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為裝入的目的片段后，作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部檢測(cè)血液HBVRNA的標(biāo)準(zhǔn)品使用。最終目的片段序列為：AGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTGTGTCGTGTGTTACGGTGTGA(SEQIDNO﹕15)測(cè)序驗(yàn)證的峰圖如圖8B所示。實(shí)施例4、靈敏度檢測(cè)將構(gòu)建好的HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品和HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，濃度分別為3.00E+09、3.00E+08、3.00E+07、3.00E+06、3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02copies/mL。用上述確定的檢測(cè)體系和循環(huán)參數(shù)分別對(duì)倍比稀釋的HBVDNA和HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，在檢測(cè)HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，線性范圍可低至3.00E+03copies/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝-3.3589x+50.371，相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.9929(圖9)。在檢測(cè)HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，線性范圍可低至3.00E+02copies/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝-3.3431x+48.671，相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.999(圖10)。除此之外，還利用單通道的檢測(cè)方法分別對(duì)倍比稀釋的HBVDNA和HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在檢測(cè)HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，線性范圍可低至3.00E+03copies/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝-3.0297x+47.853，相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.9974(圖11)。在檢測(cè)HBVRNA標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，線性范圍可低至3.00E+03copies/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝-3.4843x+42.71，相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.9992(圖12)。上述結(jié)果表明，在雙通道檢測(cè)過程中，其靈敏度與單通道檢測(cè)相比無明顯差異。上述結(jié)果表明，HBVDNA和RNA雙通道定量檢測(cè)方法具有較高的靈敏性。盡管雙通道檢測(cè)過程中，其靈敏度與單通道檢測(cè)相比無明顯差異，但由于在一個(gè)體系中經(jīng)過一次檢測(cè)即可獲得與單通道檢測(cè)同樣的高靈敏度，使得檢測(cè)時(shí)間大為縮短，因此雙通道檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)實(shí)施例5、特異性的檢測(cè)利用雙通道檢測(cè)未經(jīng)DnaseI處理的逆轉(zhuǎn)錄樣本，此時(shí)樣本中含有HBVDNA和HBVRNA逆轉(zhuǎn)后形成的cDNA。當(dāng)雙通道檢測(cè)后，經(jīng)FAM通道只能檢測(cè)到HBVRNA的擴(kuò)增曲線；經(jīng)VIC通道只能檢測(cè)到HBVDNA的擴(kuò)增曲線。由此可見，兩個(gè)通道之間無擴(kuò)增信號(hào)干擾現(xiàn)象，具有較高的特異性。(圖13)實(shí)施例6、重復(fù)性的檢測(cè)選取未經(jīng)DnaseI處理的逆轉(zhuǎn)錄樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)20次。結(jié)果顯示，20次重復(fù)檢測(cè)的曲線基本重合，重復(fù)檢測(cè)的ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD值)為0.16466，重復(fù)性較好(圖14)。以上，基于本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說明，但本發(fā)明不限定于此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)能夠以進(jìn)行變形和變更的方式實(shí)施，這樣的變形和變更的方式，理應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3