本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因及其在抗低溫及抗真菌活性方面的潛在應(yīng)用的專利申請(qǐng)。

背景技術(shù)：

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我國傳統(tǒng)名花，被廣泛應(yīng)用于切花、盆栽以及園林綠化，也是世界四大切花之首，在世界各地廣為栽培。而隨著人們生活水平的提高，菊花的消費(fèi)需求越來越大。為了滿足市場(chǎng)的需求，在生產(chǎn)上已經(jīng)通過花期調(diào)控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了菊花市場(chǎng)的周年供應(yīng)。然而，菊花作為一種多年生草本植物，傳統(tǒng)上以分株、扦插繁殖為主，而由于連作或溫室培養(yǎng)等多種因素的影響，菊花病害危害逐年加重，如斑點(diǎn)病、銹病、白粉病、病毒病等，嚴(yán)重降低了菊花的質(zhì)量和品質(zhì)，影響了菊花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，成為了生產(chǎn)中一個(gè)突出的問題。同時(shí)菊花的周年供應(yīng)需要冬季在溫室栽培，極大提高了生產(chǎn)成本。因而為了降低冬季溫室中菊花切花生產(chǎn)成本，提高菊花陸地越冬的安全性，提高菊花的耐寒性就顯得非常重要，也因此，培育出具有抗病且耐寒性的菊花新品種對(duì)菊花的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義及應(yīng)用前景。

幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，一般認(rèn)為其是植物中一種主要的病程相關(guān)蛋白。已有研究認(rèn)為，通過生物工程技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入不同植物后，植株抗病能力能夠得到一定增強(qiáng)。例如，轉(zhuǎn)馬鈴薯幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)入茶樹后增強(qiáng)了抗皰狀疫病的能力（Singh et.al.，Enhanced resistance to blister blight in transgenic tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) by overexpression of class I chitinase gene from potato (Solanum tuberosum) ，F(xiàn)unct Integr Genomics，2015，15(4): 461-480）；再如，將水稻幾丁質(zhì)酶基因在轉(zhuǎn)基因番茄中進(jìn)行表達(dá)增強(qiáng)了番茄對(duì)枯萎病和早疫病的抗性（Jabeen et al.，Expression of Rice Chitinase Gene in Genetically Engineered Tomato Confers Enhanced Resistance to Fusarium Wilt and Early Blight ，Plant Pathol J. ，2015，31(3):252-258）。還有部分研究表明，部分植物中的幾丁質(zhì)酶不但參與了植物的抗病防御反應(yīng)，還一定程度參與了植物的高鹽、干旱、重金屬脅迫等多種非生物脅迫的調(diào)控。研究顯示，黑麥中有2個(gè)冷誘導(dǎo)基因CHT9和CHT46的蛋白分別屬于Class I和II幾丁質(zhì)酶，具有抗凍活性（Yeh, et al. Chitinase genes responsive to cold encode antifreeze proteins in wheat cereals. 2000, Plant Physiol, 124:1251-1263），無芒雀麥中冷誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因BiCHT1與黑麥中的CHT9同源，其在4 °C具有抗凍活性，在10 °C具有輕微的抗凍活性（Nakamura, et al. Characterization of cold-responsive extracellular chitinase in bromegrass cell cultures and its relationship to antifreeze activity. Plant Physiol. 2008, 147(1): 391-401.），甘蔗的Class III、I、IV和VII幾丁質(zhì)酶基因能響應(yīng)多種生物脅迫和非生物脅迫，其中包括4 °C低溫脅迫（Su, et al. ScChi, encoding an acidic class III chitinase of sugarcane, confers positive responses to biotic and abiotic stresses in sugarcane. Int J Mol Sci. 2014, 15(2):2738-2760.；Su, et al. Identification, phylogeny, and transcript of chitinase family genes in sugarcane. Sci Rep. 2015, 5:10708.）。因此，通過幾丁質(zhì)酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化提高抗逆能力為作物抗性育種提供了一條新途徑。

就幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)而言，幾丁質(zhì)酶有第19和第18兩個(gè)家族。已有研究認(rèn)為：Class I幾丁質(zhì)酶包含N-端信號(hào)區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，有的Class I幾丁質(zhì)酶在C端還有一個(gè)液泡定位區(qū)（Araki T et.al.，Structural classification of plant chitinases: two subclasses in class I and class II chitinases ，Biosci Biotechnol Biochem，1995，59(2):336-338）；Class II幾丁質(zhì)酶有信號(hào)肽和催化區(qū)（Kikuchi et.al.，Class II chitinase accumulated in the bark tissue involves with the cold hardiness of shoot stems in highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.)，Scientia Horticulturae，2009，120(2):230–236）；Class III幾丁質(zhì)酶與Class I和Class II沒有同源性，Class IV與Class I的結(jié)構(gòu)域相似，但催化區(qū)較短，Class V幾丁質(zhì)酶在氨基酸結(jié)構(gòu)上與Class I相似，但其序列與小蕁麻凝結(jié)素蛋白前體序列相似性高，在N-端有2個(gè)凝結(jié)素保守域，Class VI與前5類無相似性，有信號(hào)肽，2個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和催化區(qū)，與某些細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶具有較高的相似性，Class VII幾丁質(zhì)酶N-端有信號(hào)區(qū)和催化區(qū)，不含幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，其催化區(qū)不含19家族幾丁質(zhì)酶特異的序列標(biāo)簽。還有一些幾丁質(zhì)酶類似蛋白，其序列與18和19家族幾丁質(zhì)酶蛋白同源，但不包含幾丁質(zhì)結(jié)合或者催化活性，具有幾丁質(zhì)酶相似的抗病原體活性，具有幾丁質(zhì)酶的功能。例如，在桑樹、水稻和擬南芥等植物中均克隆出幾丁質(zhì)酶類似基因。

綜上所述，盡管已有研究表明了幾丁質(zhì)酶具有較為重要的潛在用途，但是由于植物中各類幾丁質(zhì)酶的基因序列、亞細(xì)胞定位及酶活性存在較大差異，因而對(duì)于不同植物中的幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)及其與抗病或非生物脅迫間的關(guān)系，尚需進(jìn)一步的具體分析才能確定。而關(guān)于菊花的幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用的研究尚未見到較為詳細(xì)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因，由于該基因的表達(dá)與低溫脅迫和病菌侵染相關(guān)，因而潛在性的可用于培育新的具有抗低溫且抗真菌感染的菊花新品種。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因，包含1385個(gè)堿基，具體序列如SEQ ID NO.1所示。

所述菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因所編碼的菊花幾丁質(zhì)酶，序列如SEQ ID NO.2所示；包括319個(gè)氨基酸，屬第19家族糖苷水解酶，具有溶菌酶活性，屬分泌途徑蛋白的可能性是97.6%，其中第1~23位氨基酸為信號(hào)肽，23和24位氨基酸之間為切割位點(diǎn)。

所述菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因在菊花抗性育種中的應(yīng)用，該基因在低溫脅迫或白粉病的誘導(dǎo)下，基因表達(dá)量明顯升高。

所述菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因在菊花抗性育種中的應(yīng)用，用于培育抗性菊花品種時(shí)，可將菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因連接于pCAMBIA super 1300-GFP載體上，然后通過農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化方法制備菊花新品種（也即菊花抗性新品種的培育方法），所制備的菊花新品種，由于菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的超表達(dá)，使其具有較好的耐低溫（低溫抗性）、耐白粉菌感染（白粉病抗性）特性。

在構(gòu)建超表達(dá)菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的轉(zhuǎn)基因菊花新品種過程中，發(fā)明人對(duì)菊花的組培體系做了進(jìn)一步優(yōu)化，構(gòu)建了一種菊花高效再生體系，具體操作步驟如下：

（1）外植體消毒

在晴天選健康、無病蟲害的嫩芽，取前端3~5 cm處的嫩葉，置于流水下沖洗1 h；

然后，在超凈臺(tái)中依次采用75%酒精滅菌30 S、無菌水洗3~5次、2%NaClO 中添加1/1000的吐溫-20 滅菌 25 min、無菌水洗3-5次；

（2）愈傷組織的誘導(dǎo)及分化：

將步驟（1）中滅菌后葉片用無菌濾紙吸干水分，放在無菌培養(yǎng)皿中，將葉片的邊緣切下，剩下的中間部分切成0.5×0.5 cm的小塊，并在小塊中間劃一刀傷口，接種在MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2200 lx，光暗周期為12 h:12 h；

2 周左右可見葉片外植體膨大，并出現(xiàn)綠色小芽，1 個(gè)月后不定芽平均高約2 cm左右；

（3）生根培養(yǎng)

將高度大于3 cm的芽接種在1/2MS+ NAA 0.1 mg/L生根培養(yǎng)基中，1 個(gè)月后不定芽生根率可達(dá)100%，根長(zhǎng)12~15 cm左右；

將生根后菊花幼苗煉化后，即可室外栽培。

本發(fā)明通過RT-PCR及RACE技術(shù)克隆獲得了菊花幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)序列，并進(jìn)一步對(duì)該基因所編碼的菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI的特性進(jìn)行了初步研究。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)果表明，在受低溫脅迫或白粉病誘導(dǎo)時(shí)，菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的表達(dá)量均有明顯提升；基于此結(jié)果，發(fā)明人認(rèn)為，通過構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，結(jié)合農(nóng)桿菌侵染技術(shù)應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)手段，在將菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI轉(zhuǎn)染其他植株尤其是相應(yīng)菊花植株后，可獲得新的具有一定抗性的菊花植株新品種，從而為新的菊花品種的培育提供借鑒和參考。

附圖說明

圖1為所克隆菊花幾丁質(zhì)酶基因的電泳圖，其中1：5’RACE擴(kuò)增片段，2：3’RACE擴(kuò)增片段，3：保守區(qū)片段，4：ORF擴(kuò)增片段，M：DL2000 marker；

圖2為菊花幾丁質(zhì)酶基因所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域；

圖3為菊花幾丁質(zhì)酶基因在低溫誘導(dǎo)和白粉病侵染誘導(dǎo)情況下的表達(dá)情況；

圖4為構(gòu)建含有菊花幾丁質(zhì)酶基因重組表達(dá)載體過程中部分電泳圖，其中1：pCAMBIA super 1300-GFP質(zhì)粒雙酶切片段，2：pCAMBIA super 1300-GFP質(zhì)粒，3： pGEM-CmCHI質(zhì)粒雙酶切片段，4：pGEM-CmCHI質(zhì)粒，5：重組質(zhì)粒雙酶切片段，6：重組質(zhì)粒，M：DL2000 marker；

圖5為外植體在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況；

圖6為培養(yǎng)基中菊花不定芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況；

圖7為轉(zhuǎn)基因菊花陽性植株的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中1~8為陽性植株，CK為對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，對(duì)本發(fā)明中涉及部分物料情況簡(jiǎn)要介紹如下。

生物材料：

貢菊（Chrysanthemum morifolium ‘Gongju’）和白粉病菊花植株來自鄭州順達(dá)高新農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司菊花種植基地；

大腸桿菌DH5α菌株來自Takara公司、pGEM-T easy載體來自Promega公司、pCAMBIA super1300-GFP表達(dá)載體來自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心；引物合成及測(cè)序由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成提供。

實(shí)驗(yàn)試劑：

M-MLV試劑、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBRPremix Ex Taq來自日本Takara 公司，Trizol試劑來自美國Invitrogen公司；

主要儀器：

電泳儀來自北京六一儀器廠、PCR儀來自德國Biometra公司、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來自德國Eppendorf 公司。

實(shí)施例1

本實(shí)施例主要介紹一下對(duì)于菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的獲得過程，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要介紹如下。

（1）原料預(yù)處理，提取總RNA，具體為：

將菊花幼苗（地上部分高20 cm左右）放入冰箱中，4℃冷藏處理4~8h，然后取葉片，按照Trizol試劑說明書，提取菊花葉片的總RNA；

取1 μL所提取的總RNA樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，分析純度，結(jié)果顯示總RNA的28S和18S條帶清晰，其OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.98，表明所提取的RNA 完整性好、純度高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

（2）反轉(zhuǎn)錄獲得菊花的cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得菊花幾丁質(zhì)酶的保守區(qū)域，具體為：

參考M-MLV試劑說明書，對(duì)步驟（1）中所獲得的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所獲得的cDNA作為后續(xù)菊花幾丁質(zhì)酶保守域擴(kuò)增的模板；

PCR擴(kuò)增時(shí)，參考已知其他植物的幾丁質(zhì)酶序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物序列如下：

JH-CHI-F1：5'-TGTGATCARGGWTGGGAATGT-3’，

JH-CHI-R1: 5'-AGATTGCRGCTTGGAARGCTA-3’。

以上述所獲得的cDNA作為模板，設(shè)計(jì)20 μL擴(kuò)增體系如下：

cDNA模板，1 μL（1000～2000 ng）；

10×buffer，2 μL；

TaqDNA聚合酶，0.2 μL （1 U）；

4種dNTP， 1.6 μL（各150 μmol/L）；

每條引物，各1 μL （0.5 μmol/L）；

ddH₂O 加至20μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5 min；95℃、40 s，58℃、40 s，72℃、40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果顯示在500 bp處有一條帶（圖1c），將這一條帶凝膠回收，提純后，連接到pGEM-T easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)過PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，得到菊花幾丁質(zhì)酶的保守域片段。

（3）根據(jù)菊花幾丁質(zhì)酶的保守域片段，進(jìn)行RACE擴(kuò)增，具體為：

根據(jù)步驟（2）中所獲得的菊花幾丁質(zhì)酶的保守域片段，分別設(shè)計(jì)3'和5'端特異引物，進(jìn)行RACE擴(kuò)增，引物序列具體如下：

3'端引物為：

JH-CHI-246F：5'-CGTTGGGAGTCAAACTTCGT-3'，

JH-CHI-434F：5'-ACTATGGCTACCTTGGCGACT-3'；

5'端引物為：

JH-CHI-176R：5'-GGTAAATGGCAGCAGCAGTAAT-3'

JH-CHI-430R：5'-AGTTCCAGAAGACGGGCAAAG-3'；

參考SMART^TM RACE Amplification kit（Clontech公司）說明書，進(jìn)行RACE擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，可分別得到361 bp的5’端（圖1b）和768 bp的3’端（圖1a）片段。

對(duì)相應(yīng)凝膠片段回收、純化后，與pGEM-T EASY載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，提取鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

（4）對(duì)基因序列進(jìn)行拼接，獲得菊花幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)，具體為：

將步驟（2）、步驟（3）中所獲得的菊花幾丁質(zhì)酶相關(guān)序列進(jìn)行拼接，即可獲得菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因全長(zhǎng)， 測(cè)序后表明所獲得的CmCHI基因具體序列如SEQ ID NO.1所示。

為對(duì)菊花幾丁質(zhì)酶有進(jìn)一步的驗(yàn)證，首先需對(duì)菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因中的開放閱讀框（ORF）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，為此，發(fā)明人設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，序列如下：

JHCH-ORFF: 5'-CAA AGA AGA ATG GGG ACA AAA C-3'，

JHCH-ORFR: 5'-AGG TTA ACT CGA AGC CGA TTC-3'；

以步驟（2）中獲得的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，獲得了約1000bp的目的條帶（圖1d），對(duì)所獲得的目的條帶回收，純化，連接到pGEM-T easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)PCR檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證了ORF序列，將測(cè)序的菌液提取質(zhì)粒，以備用后續(xù)試驗(yàn)。

結(jié)合所獲得的ORF序列，對(duì)菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因全長(zhǎng)序列分析可知，其序列中包括72 bp的5'UTR、960 bp的ORF和 353 bp 的3'UTR，共編碼319個(gè)氨基酸；進(jìn)一步通過Blastx分析顯示，菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因編碼蛋白包含糖苷水解酶19家族的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，具有3個(gè)催化位點(diǎn)，7個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)，并屬于溶菌酶超家族（如圖2所示），為分泌途徑蛋白，在第1~23位氨基酸有信號(hào)肽，23和24位氨基酸之間為切割位點(diǎn)；比對(duì)結(jié)果表明，菊花幾丁質(zhì)酶與薇甘菊（Mikania micrantha）的幾丁質(zhì)酶蛋白一致性最高，達(dá)87%。

實(shí)施例2

本實(shí)施例主要介紹一下菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因表達(dá)量與低溫脅迫誘導(dǎo)或白粉病誘導(dǎo)間的關(guān)系，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)要介紹如下。

低溫誘導(dǎo)處理：

將“貢菊”幼苗放在冰箱中4℃低溫誘導(dǎo)處理2~8 h，以未低溫處理菊花葉片作為對(duì)照，分別取成熟葉片組織。

病菌侵染誘導(dǎo)處理：

用菊花白粉菌活體接種正常菊花葉片，具體方法為：將具有白粉菌的菊花植株與正常的菊花植株放于大棚，并列排放，使枝葉能夠相互接觸，接種15~30 d后，取成熟葉片組織，以不接種菊花葉片為對(duì)照。

分別提取各處理組葉片組織總RNA（每組處理和對(duì)照3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），RNA經(jīng)過純度測(cè)定，其OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.9~2.05之間，表明純度較好。

利用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，然后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR），以分析菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因在不同誘導(dǎo)方式下的表達(dá)量。

熒光定量PCR時(shí)，首先，通過溶解曲線和擴(kuò)增曲線確定引物的特異性，特異引物設(shè)計(jì)為：

qCHI-F：5'-GGT TGG GAA TGT AAA GGA TGG TC-3'，

qCHI-R：5'-GTT GGT AAA TGG CAG CAG CAG TA-3'；

同時(shí)，熒光定量PCR時(shí)，以菊花Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為：

qACT-F：5'-ACT CAG CAC CTT CCA ACA GA-3'，

qACT-R：5'-CTC TGG CAA CAA TCG ACA A-3'。

其次，參考SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ kit（TaKaRa）說明書，進(jìn)行熒光定量PCR（Eppendorf Mastercycler熒光定量PCR儀），

反應(yīng)體系設(shè)計(jì)為25 μL，具體為：

SYBR Premix Ex Taq ，12.5 μL，

正反向引物，各1 μL；

cDNA模板，2 μL；

超純水，8.5 μL；

反應(yīng)條件為：95℃、15 s，56℃、15 s，72℃、15 s（40個(gè)循環(huán)）。

上述實(shí)驗(yàn)過程中，相關(guān)操作參考實(shí)施例1及現(xiàn)有技術(shù)操作，不再過于重復(fù)描述。

對(duì)qRT-PCR輸出的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行分析處理。結(jié)果顯示，在低溫處理4 h和8 h后，菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的表達(dá)水平明顯升高（圖3A）；在接種白粉菌10 d和15 d后，該基因的表達(dá)也表現(xiàn)出明顯的升高趨勢(shì)（圖3B）。這表明菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因能夠響應(yīng)低溫誘導(dǎo)和白粉菌誘導(dǎo)，參與低溫脅迫和白粉病抗性的分子調(diào)控，可以作為外源基因用于基因工程創(chuàng)造菊花抗低溫及抗白粉病的分子育種。

實(shí)施例3

為便于菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因在育種工作中的應(yīng)用，發(fā)明人構(gòu)建了含有該基因的重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmCHI，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)要介紹如下。

（1）設(shè)計(jì)引物，以獲得編碼序列，具體為：

根據(jù)實(shí)施例1中所獲得的菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的全長(zhǎng)序列，在ORF兩端設(shè)計(jì)帶Xbal和SmaI雙酶切位點(diǎn)的引物，具體為：

GJ-CHIF：5'-TCT AGA CAA AGA AGA ATG GGG ACA AAA C-3'，

GJ-CHIR：5'-CCC CGG GGT AAC TCG AAG CCG ATT CCT-3'；

以實(shí)施例1中得到的含ORF序列的陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，回收純化獲得970bp處凝膠片段，并與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，PCR驗(yàn)證并測(cè)序驗(yàn)證，獲得含有目的基因的質(zhì)粒pGEM-CmCHI。

（2）雙酶切，并分別回收酶切產(chǎn)物，具體為：

對(duì)pCAMBIA super 1300-GFP表達(dá)載體和步驟（1）中所獲得的質(zhì)粒pGEM-CmCHI分別進(jìn)行Xbal酶和Smal酶的雙酶切，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳分析，并回收目的片段；

針對(duì)pCAMBIA super 1300-GFP表達(dá)載體其雙酶切后可得到一條片段，為目的片段，電泳圖如圖4a所示；

針對(duì)質(zhì)粒pGEM-CmCHI，其雙酶切后可產(chǎn)生3000 bp和970 bp的兩個(gè)酶切片段，其中970 bp為目的片段，電泳圖如圖4b所示。

（3）連接，轉(zhuǎn)化，并篩選獲得構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒，具體為：

將步驟（2）中所回收的雙酶切產(chǎn)物，在16℃條件下進(jìn)行連接過夜，連接體系設(shè)計(jì)為20 μL：

T4連接酶，1 μL；

緩沖液，2 μL；

CmCHI目的片段，12 μL；

pCAMBIA super1300-GFP 載體片段，5 μL。

第二天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株，菌液PCR驗(yàn)證正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)行Xbal和SmaI雙酶切驗(yàn)證，得到預(yù)期約10000 bp和970 bp的片段（圖4c）。

這一結(jié)果表明，已成功將菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因插入到pCAMBIA super 1300-GFP植物表達(dá)載體中，即重組質(zhì)粒表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmCHI構(gòu)建成功，可以用于構(gòu)建具有抗低溫及抗白粉病的菊花新品種，或用于構(gòu)建具有抗低溫及抗白粉病的其他植物新品種。

實(shí)施例4

針對(duì)菊花，為將菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要構(gòu)建一種菊花高效再生體系。具體方法構(gòu)建方法如下：

（1）外植體消毒

在晴天選健康、無病蟲害的嫩芽，取前端3~5 cm處的嫩葉，置于流水下沖洗1 h；

然后，在超凈臺(tái)中依次采用75%酒精滅菌30 S、無菌水洗3~5次、2%NaClO 中添加1/1000的吐溫-20 滅菌25 min、無菌水洗3-5次。

（2）愈傷組織的誘導(dǎo)及分化：

將步驟（1）中滅菌后葉片用無菌濾紙吸干水分，放在無菌培養(yǎng)皿中，將葉片的邊緣切下，剩下的中間部分切成0.5×0.5 cm的小塊，并在小塊中間劃一刀傷口，接種在MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2200 lx，光暗周期為12 h:12 h。

2 周后可見葉片外植體膨大，并出現(xiàn)綠色小芽（如圖5所示），1 個(gè)月后不定芽平均高約2 cm（如圖6所示）。

（3）生根培養(yǎng)

將高大于3 cm的芽接種在1/2MS+ NAA 0.1 mg/L生根培養(yǎng)基中，1 個(gè)月后不定芽生根率可達(dá)100%，根長(zhǎng)10~12 cm左右。

將生根后菊花幼苗經(jīng)煉化后，即可室外栽培，從而構(gòu)建成功一種菊花高效再生體系，為相關(guān)轉(zhuǎn)基因品種的篩選奠定基礎(chǔ)。

實(shí)施例5

在上述實(shí)施例4所構(gòu)建的菊花高效再生體系及實(shí)施例3所構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmCHI基礎(chǔ)上，發(fā)明人采用農(nóng)桿菌侵染的方法構(gòu)建了新的轉(zhuǎn)基因菊花（即，在菊花上進(jìn)行了菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的超表達(dá)），相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)要介紹如下。

（1） pCAMBIA1300-CmCHI重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

取實(shí)施例3中所構(gòu)建的10 μL pCAMBIA1300-CmCHI重組質(zhì)粒，加入至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，冰上孵育30 min；然后放于液氮中1 min，接著37 ℃孵育5 min，冰中孵育5 min；

孵育結(jié)束后，加入800 μL YEB液體培養(yǎng)基，28℃、140 rpm橫搖1 h；

3600轉(zhuǎn)/分、離心5 min，棄上清后，將剩下的菌液混勻，用涂布器在含有卡那霉素100 mg·L^-1和利福平50 mg·L^-1的YEB固體培養(yǎng)基平板上涂勻， 37℃下培養(yǎng)48 h進(jìn)行抗性篩選；

針對(duì)長(zhǎng)出的單菌落，進(jìn)行陽性克隆篩選鑒定。

（2）根癌農(nóng)桿菌的活化

取步驟（1）中鑒定正確的含pCAMBIA1300-CmCHI重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液50 μL，加入至50 mL 含卡那霉素100 mg·L^-1和利福平50 mg·L^-1的YEB培養(yǎng)基中，28℃、220 轉(zhuǎn)/分，搖液培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀=0.5左右；

將菌液 4℃、3600 轉(zhuǎn)/分、離心10min，收集菌體，以離心前菌液2倍體積的1/2MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，搖床上220 轉(zhuǎn)/分、28℃，搖液培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.2～0.4左右，此時(shí)作為農(nóng)桿菌浸染液備用。

（3）侵染菊花葉片，洗脫農(nóng)桿菌

在超凈工作臺(tái)，取實(shí)施例4中的再生苗葉片，將其切成0.5×0.5 cm的小塊，并在小塊中間劃一刀傷口，接種在MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2~3 d；

將預(yù)培養(yǎng)的菊花葉片放入步驟（2）中所制備的浸染液中侵染10~20min，侵染過程中不斷搖動(dòng)以確保侵染均勻；侵染結(jié)束后倒掉菌液，并將葉片轉(zhuǎn)移至無菌濾紙上，以將殘余的菌液吸干，隨即轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2～3 d；

暗培養(yǎng)結(jié)束后，挑取愈傷組織置于無菌的三角瓶中，用無菌水沖洗5次，每次沖洗時(shí)輕輕搖動(dòng)以便沖洗干凈，最后一次沖洗結(jié)束后靜止30 min，以便讓讓粘附于愈傷組織上的農(nóng)桿菌擴(kuò)散到無菌水中；

最后加入含美羅培南（50mg/L）的無菌水，靜止30 min，靜置期間輕輕振蕩幾次；最后倒掉液體，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至無菌濾紙上晾干。

（4）轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選與轉(zhuǎn)基因植株的再生

將步驟（3）中洗脫農(nóng)桿菌并晾干后愈傷組織轉(zhuǎn)移至含潮霉素40 mg·L^-1的MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 d，進(jìn)行篩選及成苗誘導(dǎo)培養(yǎng)；

當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)移至1/2MS+ NAA 0.1 mg/L的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，最終篩選獲得8株轉(zhuǎn)基因再生植株。

（5）轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

對(duì)步驟（4）中篩選所獲得的8株再生菊花，取其葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，設(shè)計(jì)如下特異引物序列，進(jìn)行PCR檢測(cè)（檢測(cè)結(jié)果如圖7所示），對(duì)能擴(kuò)增到615 bp片段樣品，即可認(rèn)為其為轉(zhuǎn)基因陽性植株，即，該植株的基因組中成功整合進(jìn)了菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因；

具體引物序列為：

PROF: 5'-TCG TTT ATT TCG GCG TGT AGG AC-3'，

CHIR: 5'-GTT GGT AAA TGG CAG CAG CAG TA-3'。

（6）轉(zhuǎn)基因陽性植株的快速繁殖

在超凈臺(tái)上，取步驟（5）中鑒定為陽性植株的菊花葉片，切割為0.5×0.5 cm的小塊，接種于含潮霉素40 mg·L^-1的MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，大約30 d 時(shí)可見不定芽被誘導(dǎo)，當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3 cm時(shí)將不定芽分為單株，分別接種于1/2MS+ NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，以穩(wěn)定保存和擴(kuò)增所獲得的轉(zhuǎn)基因植株。

實(shí)施例6

對(duì)實(shí)施例（5）中篩選所獲得的含CmCHI基因的轉(zhuǎn)基因菊花，發(fā)明人對(duì)其耐低溫和耐白粉菌的抗性進(jìn)行了進(jìn)一步檢測(cè)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要介紹如下。

（1）低溫誘導(dǎo)處理

在實(shí)施例5中獲得的轉(zhuǎn)基因陽性菊花苗長(zhǎng)至5~7 cm時(shí)，取部分樣品連培養(yǎng)瓶置入4℃冰箱冷藏處理2~4d，以未轉(zhuǎn)基因幼苗作為對(duì)照（部分未轉(zhuǎn)基因幼苗同樣置于冰箱冷藏處理作為陽性對(duì)照，部分未冷藏處理作為空白對(duì)照）。

處理結(jié)束后，觀察幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)，并分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組葉片，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

結(jié)果表明，低溫處理情況下，轉(zhuǎn)基因菊花植株與空白對(duì)照組相比，植株形態(tài)基本正常，未表現(xiàn)出明顯差異，而陽性對(duì)照組（冷藏處理）與空白對(duì)照組（未冷藏處理）相比，植株形態(tài)表現(xiàn)出較為明顯的凍傷害表型。進(jìn)一步的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株葉片中幾丁質(zhì)酶表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)基因菊花植株（包括陽性對(duì)照和空白對(duì)照），這一結(jié)果表明，菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的超表達(dá)，有助于植株抵抗低溫，即可用于提高植株的耐低溫抗性。

（2）白粉病抗性試驗(yàn)

在實(shí)施例5中所獲得的轉(zhuǎn)基因菊花幼苗和未轉(zhuǎn)基因菊花幼苗的培養(yǎng)瓶中，同時(shí)接種白粉菌，觀察白粉菌接種后菊花葉片感染白粉菌的情況。

結(jié)果表明，在白粉菌接種20d時(shí)，未轉(zhuǎn)基因菊花幼苗葉片（對(duì)照組）中已可檢測(cè)出現(xiàn)白粉菌，并表現(xiàn)出輕微的白粉菌感染的早期癥狀，而此時(shí)轉(zhuǎn)基因菊花幼苗葉片中尚未檢測(cè)出明顯的白粉菌，且植株形態(tài)正常；

在白粉菌接種35d時(shí)，未轉(zhuǎn)基因菊花幼苗葉片（對(duì)照組）已表現(xiàn)出典型的白粉菌菌斑，而此時(shí)轉(zhuǎn)基因菊花葉片中僅檢測(cè)出少量白粉菌存在，植株表現(xiàn)出輕微的白粉菌感染的早期癥狀。綜合此結(jié)果可以認(rèn)為，菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因的超表達(dá)，有助于植株抵抗白粉菌的侵染，延緩植物發(fā)病，即，可提高植物的抗白粉病的抗性。

需要說明的是，為保持說明書文本的簡(jiǎn)要，便于體現(xiàn)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路，上述實(shí)施例中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作做了適當(dāng)簡(jiǎn)略，未詳細(xì)描述部分內(nèi)容參考現(xiàn)有技術(shù)即可，不再詳細(xì)介紹說明。

SEQUENCE LISTING

<110> 鄭州師范學(xué)院

<120> 菊花幾丁質(zhì)酶CmCHI基因及其應(yīng)用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1385

<212> DNA

<213> Chrysanthemum morifolium

<400> 1

acatggggaa aaaccagttg tgttttattt tcattcacat aaacattttg gtctccactc 60

tttcaaagaa gaatggggac aaaacatatg tgtcttctgg tgataactgt tctatttgta 120

gcagtttcaa ttgtggatgc cgacacatcg cctgtaactg tgaagaaagt taagggaaag 180

aaactttgtg atcaaggttg ggaatgtaaa ggatggtcgg agtattgttg taacctcaca 240

atatctcagt atttcgatta ttaccaattt gaggagcttt tcccaaagag aaacacacca 300

gtggcaaaag ctgtcggttt ctgggattat aagtctttta ttactgctgc tgccatttac 360

caaccaaaag ggtttggtac cacaggcaac aagaccacac aaatgttgga acttgctgct 420

tttcttgctc acgttgggag tcaaacttcg tgtggatatg gagtagcaac cggtgggccc 480

acagcatggg gactgtgcta caacaaagaa gagagccctc agcaagatta ttgtgacgag 540

aactacaaat acacttaccc ttgtgcccct ggagctatct attttggtcg tggtgctttg 600

cccgtcttct ggaactacaa ctatggatac cttggcgact gcttgaaagc tgatcttttg 660

caccaccccg aataccttga acaaaacgcc actttagcct tccaggctgc aatcttccaa 720

tggatcacac cattaaagaa gggtcaacca tcagcccatg attgtatggt cggatcctac 780

aaaccaacca aaaacgacac tttgtcttta agatatcctg gattcggttg caccatgaac 840

atcctctatg gtgaacgtac atgtggacaa ggcgatattg atgacatgaa caccatcatc 900

acacattact tgtactatct tgacttgatg ggtgtcggta gagaaacagc tggtacccac 960

gacgtgctca cttgtgctga acagaaagcg tttaacccaa cacccaagaa aaaggaatcg 1020

gcttcgagtt aaccttggag taaaactgta aaagtcagcg ctatgtcaat gtcgcttgaa 1080

tctttgtctc tacagaaata aaaagtgcac cctttggaat gtttgtaggt tgtgaagctg 1140

ggttggggtc tatcatgtct taagtttata gattcagaat cattttgttc ctaaatatat 1200

ttattttgtg aattttgttt ttgttttttt aattggaatt acagacacaa gccttatata 1260

aaatttgttc agattatgtt ttttgagttt gctttttgta ttgtaaaaat tgtaataaac 1320

atgtttcatg aaaattgtaa aactacttat gtgtcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaa 1385

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> Chrysanthemum morifolium

<400> 2

Met Gly Thr Lys His Met Cys Leu Leu Val Ile Thr Val Leu Phe Val

1 5 10 15

Ala Val Ser Ile Val Asp Ala Asp Thr Ser Pro Val Thr Val Lys Lys

20 25 30

Val Lys Gly Lys Lys Leu Cys Asp Gln Gly Trp Glu Cys Lys Gly Trp

35 40 45

Ser Glu Tyr Cys Cys Asn Leu Thr Ile Ser Gln Tyr Phe Asp Tyr Tyr

50 55 60

Gln Phe Glu Glu Leu Phe Pro Lys Arg Asn Thr Pro Val Ala Lys Ala

65 70 75 80

Val Gly Phe Trp Asp Tyr Lys Ser Phe Ile Thr Ala Ala Ala Ile Tyr

85 90 95

Gln Pro Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gly Asn Lys Thr Thr Gln Met Leu

100 105 110

Glu Leu Ala Ala Phe Leu Ala His Val Gly Ser Gln Thr Ser Cys Gly

115 120 125

Tyr Gly Val Ala Thr Gly Gly Pro Thr Ala Trp Gly Leu Cys Tyr Asn

130 135 140

Lys Glu Glu Ser Pro Gln Gln Asp Tyr Cys Asp Glu Asn Tyr Lys Tyr

145 150 155 160

Thr Tyr Pro Cys Ala Pro Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Arg Gly Ala Leu

165 170 175

Pro Val Phe Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly Tyr Leu Gly Asp Cys Leu Lys

180 185 190

Ala Asp Leu Leu His His Pro Glu Tyr Leu Glu Gln Asn Ala Thr Leu

195 200 205

Ala Phe Gln Ala Ala Ile Phe Gln Trp Ile Thr Pro Leu Lys Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Ser Ala His Asp Cys Met Val Gly Ser Tyr Lys Pro Thr Lys

225 230 235 240

Asn Asp Thr Leu Ser Leu Arg Tyr Pro Gly Phe Gly Cys Thr Met Asn

245 250 255

Ile Leu Tyr Gly Glu Arg Thr Cys Gly Gln Gly Asp Ile Asp Asp Met

260 265 270

Asn Thr Ile Ile Thr His Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asp Leu Met Gly Val

275 280 285

Gly Arg Glu Thr Ala Gly Thr His Asp Val Leu Thr Cys Ala Glu Gln

290 295 300

Lys Ala Phe Asn Pro Thr Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Ser Ser

305 310 315