本發(fā)明屬于檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種用BSA等電點(diǎn)封閉液構(gòu)建可再生DNA雜交界面的方法。

背景技術(shù)：

在生物傳感方法中，生物元件之間的(親和)識(shí)別構(gòu)成了傳感的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的生物識(shí)別對包括經(jīng)典的免疫識(shí)別對(抗原抗體)與生物體內(nèi)的親和識(shí)別對(如親和素和生物素)。一般地，傳統(tǒng)識(shí)別對中的一方屬于蛋白質(zhì)。而具備生物識(shí)別力的蛋白質(zhì)(如抗體)通常具備較高的獲取及保存成本；另外，涉及活體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)也存在批次間性質(zhì)不穩(wěn)定的問題。這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了傳統(tǒng)生物識(shí)別材料在傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。

自上世紀(jì)末，以功能核酸作為新型生物識(shí)別元件的傳感分析方法也取得了迅猛的發(fā)展。功能核酸是具有親和識(shí)別、催化等特定功能的寡聚核苷酸片段，以核酸適配體(aptamer)與DNA酶(DNAzyme)兩種核酸材料為代表。相較于抗體等傳統(tǒng)生物識(shí)別材料而言，可人工合成的功能核酸具備生產(chǎn)及運(yùn)輸成本低、易保存、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢。目前已有百余種功能核酸見諸報(bào)道，其識(shí)別對象涵蓋生物毒素、金屬離子、細(xì)胞代謝物、大分子蛋白、全細(xì)胞等上百種物質(zhì)，其應(yīng)用領(lǐng)域集中于生物傳感及活細(xì)胞診療等方面。

隨著功能核酸領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，生物傳感領(lǐng)域內(nèi)也有一大批以功能核酸作識(shí)別材料的檢測方案應(yīng)運(yùn)而生。其中多數(shù)方案類屬于均相檢測——即檢測中不存在固相界面，單純利用液相DNA分子和目標(biāo)物(互補(bǔ)鏈或靶分子)之間的相互識(shí)別，結(jié)合熒光標(biāo)記或染色、納米材料輔助的比色、酶促反應(yīng)等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)物的定量分析。雖然均相檢測具有對硬件要求低、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但相較于基于界面結(jié)構(gòu)(如光纖、光波導(dǎo)芯片、電極等)的生物傳感器，均相策略無法實(shí)現(xiàn)探針固載化，因而難以構(gòu)建穩(wěn)定、高集成化、可再生(可反復(fù)利用，單次檢測成本低)的傳感器件。而應(yīng)用功能核酸的界面型傳感器可細(xì)分為兩類：1)直接將DNA共價(jià)固載于傳感界面(后稱為DNA界面)；2)依托均相反應(yīng)進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)一次信號(hào)轉(zhuǎn)換，將靶標(biāo)物濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橹修D(zhuǎn)物質(zhì)濃度，再利用界面識(shí)別中轉(zhuǎn)信號(hào)(稱為間接界面)。顯然，相較于DNA界面，間接界面涉及多次信號(hào)轉(zhuǎn)換，不僅在操作層面具有更高的復(fù)雜度，更有可能引入信號(hào)偏倚、損失，甚至湮沒。綜上所述，從提升用戶操作體驗(yàn)、降低檢測成本、推廣生物傳感檢測應(yīng)用范圍層面考慮，構(gòu)建可再生的DNA界面意義重大。

一般地，人工修飾的生物傳感界面上會(huì)存在一些活性吸附位點(diǎn)，此類位點(diǎn)易通過親疏水、靜電以及氫鍵等作用吸附待測液中的特定組分。對于DNA界面而言，無論吸附目標(biāo)鏈段或非目標(biāo)鏈段，均有可能降低傳感的質(zhì)量、影響分析結(jié)果。因此，在構(gòu)建DNA傳感界面時(shí)，需要規(guī)避核酸分子對傳感界面的“非特異性吸附”。

在基于DNA界面的傳感系統(tǒng)中，存在兩條檢驗(yàn)封閉質(zhì)量的基本標(biāo)準(zhǔn)：1)封閉后的傳感界面較之于無封閉或其他封閉材料封閉的傳感界面對非特異性鏈的響應(yīng)信號(hào)應(yīng)大幅降低；2)封閉后的傳感界面應(yīng)能保證對目標(biāo)雜交鏈的高信號(hào)響應(yīng)。然而，在現(xiàn)有的基于DNA界面的傳感系統(tǒng)中，少有能同時(shí)滿足上述兩條標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)質(zhì)封閉劑見諸報(bào)道。采用低質(zhì)量的封閉，往往不能有效降低非特異性吸附，或在降低非特異性吸附的同時(shí)也破壞了DNA界面的生物活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種封閉液。

本發(fā)明提供的封閉液是將BSA與pH為4.4-4.8的緩沖液混勻后得到的溶液。

所述BSA在所述封閉液中的濃度為1-3mg/mL。

上述封閉液中，所述pH為4.6。

上述封閉液中，所述BSA在所述封閉液中的濃度為2mg/mL。

上述封閉液中，所述緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液。所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；所述乙酸-乙酸鈉緩沖液0.2M乙酸-乙酸鈉緩沖液。

上述0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的配置方法如下：將0.1mol/L的檸檬酸水溶液(檸檬酸C₆H₈O₇·H₂O：分子質(zhì)量210.14，0.1mol/L，溶液為21.01克/升)與0.1mol/L的檸檬酸鈉水溶液(檸檬酸鈉Na₃C₆H₅O₇·2H₂O：分子質(zhì)量294.12，0.1mol/L溶液為29.41克/毫升)按照體積比為103：97的比例混勻，即可得到0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

上述0.2M乙酸-乙酸鈉緩沖液的配置方法如下：將0.2M的乙酸鈉水溶液(Na₂Ac·3H₂O分子質(zhì)量＝136.09，0.2mol/L溶液為27.22克/升)與0.2M的乙酸水溶液按照體積比為49：51的比例混勻，即可得到0.2M乙酸-乙酸鈉緩沖液。

上述封閉液中，所述緩沖液具體為0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述封閉液的新用途。

本發(fā)明提供了上述封閉液在如下(1)-(8)中任一種中的應(yīng)用：

(1)構(gòu)建DNA界面和/或構(gòu)建可再生DNA界面；

(2)封閉DNA界面的活性吸附位點(diǎn)；

(3)提高DNA界面對目標(biāo)核酸鏈的特異性吸附和/或識(shí)別；

(4)降低DNA界面對非目標(biāo)核酸鏈的非特異性吸附和/或識(shí)別；

(5)提高DNA界面對目標(biāo)核酸鏈的信號(hào)響應(yīng)值；

(6)降低DNA界面對非目標(biāo)核酸鏈的信號(hào)響應(yīng)值；

(7)促進(jìn)目標(biāo)核酸鏈與DNA界面的雜交；

(8)抑制非目標(biāo)核酸鏈與DNA界面的雜交。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種DNA界面的構(gòu)建方法。

本發(fā)明提供的DNA界面的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)采用共價(jià)法將末端修飾氨基的DNA分子與表面活化有醛基的光纖連接，得到DNA修飾的光纖；

2)用上述封閉液封閉所述DNA修飾的光纖，得到封閉處理后的光纖，即得到DNA雜交界面。

上述方法中，若所述DNA分子為雙鏈DNA分子，還包括將所述封閉處理后的光纖的雙鏈DNA分子變性，恢復(fù)單鏈DNA界面的步驟。本發(fā)明的方法中的DNA分子為雙鏈DNA分子，需要進(jìn)行變性處理，使其成為單鏈，但此處的DNA分子也可以是單鏈DNA分子，如果是單鏈DNA分子，則不需要變性處理的步驟。

上述方法中，所述變性的方法為用DNA變性液浸泡所述封閉處理后的光纖，所述DNA變性液為尿素溶液；所述尿素溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為尿素和NaCl，溶質(zhì)及在尿素溶液中的濃度為：尿素4M，NaCl 50mM。

上述方法中，所述封閉的條件為37℃，100rpm震蕩4小時(shí)。

上述方法中，所述步驟1)包括如下步驟：

A1)用Piranha溶液浸泡光導(dǎo)纖維，得到Piranha溶液處理后光纖；

A2)用三乙氧基硅烷溶液浸泡所述Piranha溶液處理后光纖，得到三乙氧基硅烷處理后的光纖；

A3)用戊二醛水溶液浸泡所述三乙氧基硅烷處理后的光纖，得到戊二醛處理后的光纖；

A4)用所述末端修飾氨基的DNA分子的溶液浸泡所述戊二醛處理后的光纖，得到DNA修飾的光纖。

上述方法中，

所述步驟A2)和所述步驟A3)之間還包括將所述三乙氧基硅烷處理后的光纖進(jìn)行超聲清洗的步驟；

所述步驟A4)后還包括將所述DNA修飾的光纖依次經(jīng)過甘氨酸水溶液和氰基硼氫化鈉水溶液處理的步驟。

上述方法中，

所述Piranha溶液是將濃H₂SO₄與30％(質(zhì)量百分比濃度)H₂O₂水溶液混勻后得到的溶液，其中，濃H₂SO₄與30％H₂O₂水溶液的體積比為3:1；

所述三乙氧基硅烷溶液是將APTS與無水甲苯混勻后得到的溶液，其中，APTS的體積分?jǐn)?shù)為1％；

所述戊二醛水溶液中戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為1％；

所述末端修飾氨基的DNA分子的溶液中的DNA分子的濃度為300nM。

上述方法中，所述超聲清洗的方法為將三乙氧基硅烷處理后的光纖浸泡于無水甲苯中進(jìn)行超聲處理，得到超聲處理后的光纖，再用無水甲苯清洗所述超聲處理后的光纖，得到清洗后的光纖；最后用氮?dú)獯蹈伤銮逑春蟮墓饫w，并將其進(jìn)行烘烤。所述超聲處理的時(shí)間為3分鐘，超聲處理的次數(shù)為3次；所述清洗的次數(shù)為5次；所述烘烤的條件為200℃烘箱中烘烤1小時(shí)。

上述方法中，所述甘氨酸水溶液的濃度為1M；所述氰基硼氫化鈉水溶液的濃度為20mg/mL。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述方法的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法在如下(B1)-(B6)中任一種中的應(yīng)用：

(B1)提高DNA界面對目標(biāo)核酸鏈的特異性吸附和/或識(shí)別；

(B2)降低DNA界面對非目標(biāo)核酸鏈的非特異性吸附和/或識(shí)別；

(B3)提高DNA界面對目標(biāo)核酸鏈的信號(hào)響應(yīng)值；

(B4)降低DNA界面對非目標(biāo)核酸鏈的信號(hào)響應(yīng)值；

(B5)促進(jìn)目標(biāo)核酸鏈與DNA界面的雜交；

(B6)抑制非目標(biāo)核酸鏈與DNA界面的雜交。

本發(fā)明利用等電點(diǎn)緩沖液中BSA對傳感界面吸附量大的特點(diǎn)，將BSA等電點(diǎn)溶液(pH 4.6)作為封閉液來封閉傳感界面對DNA光纖進(jìn)行封閉處理，并提出了一種用BSA等電點(diǎn)封閉液構(gòu)建可再生DNA界面的方法，實(shí)現(xiàn)對傳感界面活性吸附位點(diǎn)的高效率封閉，抑制生物功能化的傳感界面對非特異性核酸鏈的吸附作用，同時(shí)保證目標(biāo)鏈段向傳感界面的雜交，從而提高傳感設(shè)計(jì)的信噪比，提升器件靈敏度。本發(fā)明的方法在減少活性吸附位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)確保了目標(biāo)核酸鏈向DNA界面的雜交，且該方法具有經(jīng)濟(jì)、簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是DNA雜交前后紫外吸收光譜的變化情況。

圖2是本發(fā)明的DNA修飾的光纖的制備方法。

圖3是非目標(biāo)鏈在經(jīng)不同封閉液處理后的對照組光纖上的信號(hào)。

圖4是本發(fā)明中目標(biāo)雜交鏈和非目標(biāo)鏈在未經(jīng)封閉液處理的DNA光纖上所產(chǎn)生的信號(hào)。

圖5是本發(fā)明中目標(biāo)雜交鏈和非目標(biāo)鏈在經(jīng)BSA等電點(diǎn)封閉液處理的DNA光纖上所產(chǎn)生的信號(hào)。

圖6是本發(fā)明的DNA光纖連續(xù)兩天的信號(hào)變化情況。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

本發(fā)明以倏逝波傳感器為檢測平臺(tái)(倏逝波光纖傳感平臺(tái)為中國專利申請?zhí)枮?00610089497.4的全光纖倏逝波生物傳感器)，以光纖為傳感元件，Cy 5.5為熒光標(biāo)記基團(tuán)，但本發(fā)明不受以下實(shí)施方式的限制，凡基于本發(fā)明的思想做出的改進(jìn)或變形應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下述實(shí)施例中的超聲波清洗器KQ218是昆山市超聲儀器有限公司的產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的Piranha溶液是將濃H₂SO₄與30％(質(zhì)量百分比濃度)H₂O₂水溶液混勻后得到的溶液，其中，濃H₂SO₄(北京化工廠生產(chǎn)的98％的濃硫酸)與30％H₂O₂水溶液的體積比為3:1。

下述實(shí)施例中的光導(dǎo)纖維(簡稱光纖，600μM芯徑)是南京春輝科技實(shí)業(yè)有限公司的產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的三乙氧基硅烷(APTS)溶液為將APTS(Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為440140)與無水甲苯(北京化工廠的產(chǎn)品)混勻后得到的溶液，其中，APTS的體積分?jǐn)?shù)為1％。

下述實(shí)施例中的BSA是Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為V900933。

下述實(shí)施例中的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的配置方法如下：將0.1mol/L的檸檬酸水溶液(檸檬酸C₆H₈O₇·H₂O：分子質(zhì)量210.14，0.1mol/L，溶液為21.01克/升)與0.1mol/L的檸檬酸鈉水溶液(檸檬酸鈉Na₃C₆H₅O₇·2H₂O：分子質(zhì)量294.12，0.1mol/L溶液為29.41克/毫升)按照體積比為103：97的比例混勻，即可得到0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

下述實(shí)施例中的雜交液是Thermo Scientific公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品名稱為Pierce BupH Dry Blend Buffers Phosphate Buffered Saline(PBS)，產(chǎn)品目錄號(hào)為28372。

下述實(shí)施例中的尿素溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為尿素和NaCl，溶質(zhì)及在尿素溶液中的濃度為：尿素4M，NaCl 50mM。

實(shí)施例1、一種用BSA等電點(diǎn)封閉液構(gòu)建可再生DNA雜交界面的方法

一、DNA光纖界面的制備

1、DNA修飾的光纖(DNA光纖)的制備

在DNA末端修飾氨基，經(jīng)過多步驟活化使光纖表面帶有醛基，將DNA末端的氨基和經(jīng)初步修飾的光纖表面的醛基連接，得到DNA光纖。DNA光纖的具體制備過程如圖2所示，具體步驟如下：

(1)DNA雜交制備dsDNA

將單鏈DNA分子NH₂-AG(終濃度為300nM)、與單鏈DNA分子NH₂-AG互補(bǔ)的單鏈DNA分子CT-Cy5.5(終濃度為300nM)和50mM NaCl水溶液混勻，得到ssDNA混合液；將ssDNA混合液于90℃熱水浴中加熱10分鐘，后緩慢冷至室溫，得到dsDNA溶液(dsDNA濃度為300nM)，并放入4℃中過夜保存，直至使用。單鏈DNA分子NH₂-AG和單鏈DNA分子CT-Cy5.5的核酸序列如表1所示。表1中的A20-Cy5.5、CT-Cy5.5和NH₂-AG均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1本實(shí)例所涉及具體核酸名稱與序列

將上述得到的ssDNA混合液和dsDNA溶液在日立U-3900紫外/可見分光光度計(jì)上進(jìn)行吸光度測試(采用光程1cm的玻璃比色皿)。ssDNA混合液和dsDNA溶液紫外吸收光譜的變化情況如圖1所示，從圖中可以看出：和ssDNA混合液相比(雜交前的單鏈DNA溶液)，dsDNA溶液(雜交后的雙鏈DNA溶液)中，位于258nm處的特征紫外峰峰位紅移、峰值增大，符合預(yù)期，表明兩條互補(bǔ)的DNA鏈段已雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。

(2)用Piranha溶液浸泡光導(dǎo)纖維(目的是清潔光纖，并使光纖表面發(fā)生羥基化)，于110℃烘箱中加熱1小時(shí)，加熱后冷卻至室溫，然后用超純水充分洗滌光纖至洗液中性，并用氮?dú)獯蹈晒饫w，放于110℃烘箱中烘烤至少1個(gè)小時(shí)，得到Piranha溶液處理后的光纖；

(3)用三乙氧基硅烷(APTS)溶液(ATPS可與光纖表面羥基反應(yīng)，并暴露出氨基官能團(tuán))浸泡Piranha溶液處理后的光纖2小時(shí)，然后將其浸于無水甲苯中超聲清潔3分鐘(超聲清潔的儀器：超聲波清洗器KQ218)，共超聲清潔3次，再用無水甲苯溶液清洗光纖5次，后用氮?dú)獯蹈?，并將吹干后的光纖放入200℃烘箱中烘烤1小時(shí)，冷卻，得到APTS處理后的光纖。

(4)將APTS處理后的光纖浸入體積分?jǐn)?shù)為1％的戊二醛水溶液(醛基與APTS的氨基反應(yīng))中，在室溫，50-100rpm的搖床中過夜反應(yīng)，次日，用超純水清洗5次，得到戊二醛處理后的光纖。

(5)將戊二醛處理后的光纖浸入1mL上述步驟(1)中制備的dsDNA溶液(醛基與dsDNA分子的氨基反應(yīng))中，在室溫，50-100rpm的搖床中反應(yīng)2小時(shí)，得到修飾dsDNA的光纖。

(6)向修飾dsDNA的光纖浸入20μL 1M甘氨酸水溶液(與光纖表面多余的醛基反應(yīng)，以封閉醛基位點(diǎn))中，在室溫，50-100rpm的搖床中反應(yīng)1小時(shí)，得到甘氨酸處理后的光纖。

(7)將甘氨酸處理后的光纖浸入20mg/mL的氰基硼氫化鈉水溶液(將上述氨基和醛基形成的希夫堿結(jié)構(gòu)還原為穩(wěn)定的酰胺鍵)中，在室溫，50-100rpm的搖床中反應(yīng)1小時(shí)，然后用超純水清潔光纖，并浸沒在50mM NaCl水溶液中，得到修飾有DNA的光纖，于4℃保存。

2、對照組光纖的制備

將上述步驟1的(4)中的dsDNA溶液替換成50mM NaCl水溶液，其他步驟不變，得到對照組光纖。

二、檢測BSA等電點(diǎn)封閉液對于對照組光纖的封閉效果

對傳感界面進(jìn)行封閉處理，從而保證非目標(biāo)鏈段不會(huì)在界面產(chǎn)生過高的干擾信號(hào)，是實(shí)現(xiàn)DNA雜交的基礎(chǔ)。利用步驟一的2制備的對照組光纖以及對照組核酸A₂₀-Cy5.5考察不封閉以及封閉液的不同對在光纖上引起的信號(hào)大小。具體步驟如下：

1、待測液的配制

將A20-Cy5.5溶解于雜交液中，得到A20-Cy5.5待測液，A20-Cy5.5的濃度為10nM。

2、對照組光纖的處理

根據(jù)是否用封閉液封閉和封閉液的不同分為如下各組：

(1)不封閉組：將對照組光纖作為不封閉組的光纖。

(2)BSA等電點(diǎn)封閉液組：將對照組光纖浸沒于BSA等電點(diǎn)封閉液(BSA溶于0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液得到的溶液，BSA的濃度為2mg/mL，pH 4.6)中，于搖床中震蕩搖勻4小時(shí)(37℃，rpm＝100)，得到BSA等電點(diǎn)封閉液組的光纖。

(3)BSA水溶液組：將對照組光纖浸沒于BSA水溶液(BSA的濃度為2mg/mL，pH 6.75)中，于搖床中震蕩搖勻4小時(shí)(37℃，rpm＝100)，得到BSA水溶液組的光纖。

(4)PSS組：將對照組光纖浸沒于PSS水溶液(PSS的體積分?jǐn)?shù)2％，PSS(MW500,000，Alfa Aesar，lot D09Z004))水溶液中，于搖床中震蕩搖勻4小時(shí)(37℃，rpm＝100)，得到PSS水溶液組的光纖。

(5)PAA組：將對照組光纖浸沒于PAA水溶液(PAA的體積分?jǐn)?shù)2％，PAA(MW 3,000，MACKLIN))水溶液中，于搖床中震蕩搖勻4小時(shí)(37℃，rpm＝100)，得到PAA水溶液組的光纖。

3、光纖檢測

分別將步驟2中的不封閉組的光纖、BSA等電點(diǎn)封閉液組的光纖、BSA水溶液組的光纖、PSS水溶液處理后的光纖和PAA水溶液組的光纖裝入倏逝波傳感平臺(tái)所配套的流動(dòng)池內(nèi)。在光纖檢測過程中，首先用PBS緩沖液(用水將雜交液稀釋10倍后得到的溶液)沖洗光纖直至基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，開啟蠕動(dòng)泵，分別將A20-Cy5.5待測液泵入樣品槽(進(jìn)樣15s，泵速為10)；之后停止蠕動(dòng)泵，使A20-Cy5.5待測液在反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)240s；再次開啟蠕動(dòng)泵，通入洗脫液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％SDS，pH 1.9)60s；最后通入PBS緩沖液，至基線平穩(wěn)后停止采樣，保存數(shù)據(jù)。

檢測結(jié)果如圖3所示。由圖3中的信號(hào)可見，BSA等電點(diǎn)封閉液組的信號(hào)值明顯低于其他組，本發(fā)明的BSA等電點(diǎn)封閉液可有效降低非特異性鏈在光纖傳感界面所引起的信號(hào)，其凈信號(hào)僅為其他材料的6％～14％。可見BSA等電點(diǎn)封閉液可以有效抑制傳感界面對非特異性鏈的非特異性吸附。

三、檢測BSA等電點(diǎn)封閉液處理后的DNA界面對目標(biāo)鏈段的雜交信號(hào)

除了保證非特異性鏈對傳感界面的低程度吸附外，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)雜交鏈在傳感界面引起的信號(hào)高低。選用修飾有DNA的光纖、以CT-Cy5.5為目標(biāo)雜交核酸(CT-Cy5.5與修飾有DNA的光纖表面的核酸呈堿基互補(bǔ)，序列如表1所示)，以A₂₀-Cy5.5為對照組核酸(A₂₀-Cy5.5與修飾有DNA的光纖表面的核酸不互補(bǔ)，序列如表1所示)。具體步驟如下：

1、待測液的配制

(1)A20-Cy5.5待測液

將A20-Cy5.5溶解于雜交液中，得到A20-Cy5.5待測液，A20-Cy5.5的濃度為10nM。

(2)CT-Cy5.5待測液

將CT-Cy5.5溶解于雜交液中，得到CT-Cy5.5待測液，CT-Cy5.5的濃度為10nM。

2、光纖的處理

根據(jù)是否用BSA等電點(diǎn)封閉液進(jìn)行封閉，分為如下兩組：

(1)封閉組：將步驟一的1中的(6)獲得的修飾有DNA的光纖浸沒于BSA等電點(diǎn)封閉液(BSA溶于0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液得到的溶液，BSA的濃度為2mg/mL，pH 4.6)中，于搖床中震蕩搖勻4小時(shí)(37℃，rpm＝100)，得到封閉液處理后的光纖。

將封閉液處理后的光纖浸沒于DNA變性液(尿素溶液)，在室溫，50-100rpm的搖床中反應(yīng)1小時(shí)，得到封閉組的光纖。

(2)不封閉組：將步驟一的1中的(6)獲得的修飾有DNA的光纖浸沒于DNA變性液中，在室溫，50-100rpm的搖床中反應(yīng)1小時(shí)，得到不封閉組的光纖。

3、光纖檢測

分別將步驟2中的封閉組的光纖和不封閉組的光纖裝入倏逝波傳感平臺(tái)所配套的流動(dòng)池內(nèi)。在光纖檢測過程中，首先用PBS緩沖液沖洗光纖直至基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，開啟蠕動(dòng)泵，分別將A20-Cy5.5待測液和CT-Cy5.5待測液泵入樣品槽(進(jìn)樣15s，泵速為10)；之后停止蠕動(dòng)泵，使A20-Cy5.5待測液在反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)240s；再次開啟蠕動(dòng)泵，通入洗脫液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％SDS，pH 1.9)60s；最后通入PBS緩沖液，至基線平穩(wěn)后停止采樣，保存數(shù)據(jù)。

目標(biāo)雜交鏈和非目標(biāo)鏈在不封閉組的光纖上所產(chǎn)生的信號(hào)結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出：目標(biāo)雜交鏈和非目標(biāo)鏈的信號(hào)值沒有顯著差異。目標(biāo)雜交鏈和非目標(biāo)鏈在封閉組的光纖上所產(chǎn)生的信號(hào)結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出：目標(biāo)雜交鏈的信號(hào)值明顯高于非目標(biāo)鏈的信號(hào)值，其中目標(biāo)雜交鏈所引起的凈信號(hào)是非特異性鏈所引起凈信號(hào)的28倍。可見BSA等電點(diǎn)封閉液可以有效促進(jìn)目標(biāo)核酸鏈與傳感界面的雜交，提高傳感界面對目標(biāo)核酸鏈的特異性吸附。

四、DNA界面的可重復(fù)利用能力的檢測

檢測使用后，將步驟三中的封閉組的光纖在室溫條件下保存于充滿10mM PBS緩沖液的流動(dòng)池內(nèi)，保存一天后，按照上述步驟三中的方法用保存一天后的封閉組的光纖再次對CT-Cy5.5待測液進(jìn)行檢測。

結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出：和保存前的雜交信號(hào)值相比，用保存一天后的封閉組的光纖得到的雜交信號(hào)值僅有4％下降，說明按照本發(fā)明的方法構(gòu)建及封閉的DNA界面具備可再生(可重復(fù)利用)的能力。