本發(fā)明涉及藥學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，特別涉及糖尿病(包括1型及2型糖尿病)及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療；具體地說，本發(fā)明涉及一種新型肽和其用途，以及含有該新型肽及其衍生物和類似物的藥物制劑，能用于預(yù)防和治療人糖尿病及其并發(fā)癥。

背景

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征，目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境的相互作用是主要誘因，但是其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確。糖尿病可分為4型：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他類型糖尿病。1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種自身免疫性疾病，由于對自身抗體耐受性的喪失使胰島β細(xì)胞損傷，機(jī)體無法產(chǎn)生足夠的胰島素，胰島素絕對缺乏，引起血糖升高，故患者一旦發(fā)病需終生注射胰島素。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)，又被稱之為非胰島素依賴糖尿病，緣于β細(xì)胞功能低下，胰島素相對缺乏和胰島素抵抗。近年來，2型糖尿病的患病率逐漸增加，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，2030年，全球?qū)⒂?億2型糖尿病患者。目前，針對2型糖尿病的治療藥物主要是口服降糖藥和胰島素。雖然該類藥物能有效降低血糖，并改善患者癥狀，但仍然存在低血糖和體重增加等缺陷。此外，隨著糖尿病病程的延長，該類藥物均不能阻止患者β細(xì)胞的惡化。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由胰高血糖素原基因編碼，后經(jīng)加工修飾得到的30個氨基酸的腸降血糖素(incretin)。主要由小腸黏膜的L細(xì)胞合成并分泌，在胰島的α細(xì)胞也有表達(dá)。GLP-1具有兩種生物活性形式，GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，血液循環(huán)中主要以GLP-1(7-36)酰胺的活性形式存在，兩者具有共同的生物學(xué)活性。

天然人GLP-1的穩(wěn)定性較差，易被二肽基肽酶IV(DPPIV)降解，并快速被腎臟清除，其半衰期t1/2≤2min。GLP-1經(jīng)DPPIV切割掉N末端His-Ala，生成GLP-1(9-36)氨基多肽，最初研究認(rèn)為，GLP-1(9-36)氨基多肽不具有生物學(xué)活性，而且對GLP-1受體(GLP-1R)還具有一定的拮抗作用，近些年發(fā)現(xiàn)GLP-1(9-36)氨基多肽具有類胰島素的作用。

GLP-1的生理作用主要包括三個部分，一是通過與GLP-1R結(jié)合，發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)，包括：①葡萄糖依賴性促胰島素分泌；②抑制胰高血糖素分泌；③延遲胃排空，降低食欲，減少飲食，控制體重；④抑制β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)β細(xì)胞增值和分化。二是，GLP-1經(jīng)過DPPIV降解，生成GLP-1(9-36)氨基多肽，能夠抑制肝臟糖異生酶和脂肪酸合酶的表達(dá)，抑制糖異生和肝臟脂肪合成，發(fā)揮類胰島素作用。三是GLP-1(9-36)氨基多肽經(jīng)過肽鏈內(nèi)切酶(NEP 24.11)切割成GLP-1(32-36)氨基5肽，在肥胖型小鼠上增加能量消耗，抑制體重增長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：

本發(fā)明的目的是設(shè)計一條新的降糖肽，有效治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥。

技術(shù)方案：

本降糖調(diào)脂肽P8根據(jù)GLP-1的野生型進(jìn)行改造，第2位的氨基酸由Ala替換成Gly，在GLP-1的末尾添加Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，延長其半衰期，能夠降低1型糖尿病和2型糖尿病小鼠的血糖。序列如下：

GLP-1：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

P8：HEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

P8肽在治療或預(yù)防I型糖尿病藥物中的應(yīng)用。

P8肽在治療或預(yù)防II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。

有益效果：

臨床證實，GLP-1類似物能夠明顯的降低II型糖尿病病人的血糖，抑制進(jìn)食，降低糖化血紅蛋白等，同時，GLP-1及其類似物能夠降低I型糖尿病病人的血糖，降低糖化血紅蛋白，但是有些個體存在體重減輕的不利因素。本發(fā)明中，將GLP-1的第2位的氨基酸由Ala替換成Gly，在GLP-1的末尾添加Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，起到了降低I型糖尿病和II型糖尿病小鼠血糖的作用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于通過氨基酸替換和末尾添加小肽，構(gòu)建了一種降糖肽。實驗結(jié)果證明P8肽能夠有效地發(fā)揮糖依賴性促胰島素分泌作用(IPTGG)，降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的進(jìn)食，保持良好的胰島形態(tài)(HE染色)，增加STZ糖尿病模型小鼠的胰島面積(免疫染色，并累計面積)，增加STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平，其降糖作用明顯優(yōu)于艾塞那肽和GLP-1，P8肽能夠有效地降低db/db小鼠的空腹血糖，作用明顯優(yōu)于GLP-1。

附圖說明

圖1 P8的糖依賴性的促胰島素分泌作用(IPTGG)；

圖2 P8對STZ糖尿病模型小鼠累計進(jìn)食的影響；

圖3 P8對STZ糖尿病模型小鼠血糖的影響；

圖4 P8對STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游離脂肪酸的影響

圖5 P8對STZ糖尿病模型小鼠胰島形態(tài)(HE染色)的影響

圖6 P8對STZ糖尿病模型小鼠胰島面積的影響

圖7 P8對STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平的影響

圖8 P8對db/db糖尿病模型小鼠的血糖的影響

圖9 P8對db/db糖尿病模型小鼠的胰島素耐量的影響

具體實施方式

下面結(jié)合一些實例對發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：P8的糖依賴性的促胰島素分泌作用

1、糖依賴性的促胰島素分泌作用(IPTGG)

40只8周齡的雄性c57小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)實比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004)。隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為溶劑對照組(陰性對照組)、Exendin-4組(陽性對照組)、GLP-1組(陽性對照組)、P8組(實驗組)。腹腔糖耐量過程如下：c57小鼠空腹12小時，測空腹血糖，分別注射肽或者溶劑，30分鐘注射葡萄糖(1.5g/kg)，之后分別在注射糖之后15、30、60、120分鐘檢測血糖，并分別計算曲線下面積。結(jié)果P8具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌功能，與溶劑組和GLP-1組均具有顯著性差異，與Exendin-4組效果一樣。結(jié)果如圖1所示。

實施例2：P8的藥效學(xué)評價一

1、STZ糖尿病模型小鼠造模，及分組

80只6周齡的雄性c57小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)實比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗前空腹12小時，按50mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的檸檬酸緩沖液)，連續(xù)注射5天，注射后1周、2周分別檢測空腹血糖，血糖值均超過11.0mmol/L，為造模成功。將成模小鼠隨機(jī)分成4組，每組12只，分別為溶劑對照組(陰性對照組)、Exendin-4組(陽性對照組)、GLP-1組(陽性對照組)、P8組(實驗組)。給藥劑量為25nmol/kg，每天2次，溶劑為生理鹽水，皮下注射0.1ml，固定時間點給藥，AM 9：00-10：00，PM 8：00-9：00。陰性對照組，皮下注射0.1ml生理鹽水。

2、對STZ糖尿病模型小鼠累計進(jìn)食的影響

從給藥開始，每組分別記錄初始添食量，隔1天或2天檢測剩食量，并繼續(xù)添加新的鼠糧，并記錄，依次類推，到5周給藥結(jié)束，記錄小鼠的總進(jìn)食量，并繪制累計進(jìn)食曲線，結(jié)果如圖2，P8組累計進(jìn)食明顯少于溶劑組、GLP-1組和Exendin-4，具有相同的抑制進(jìn)食的效果。

3、對STZ糖尿病模型小鼠血糖的影響

小鼠空腹8小時，AM 8：00開始禁食，PM 4：00，尾靜脈檢測空腹血糖，檢測用血糖檢測儀(歐姆龍血糖儀HEA-231型)，作為給藥0周血糖。之后分別在給藥1、2、3、4、5周，檢測空腹血糖，禁食時間和檢測時間同0周方法，結(jié)果如圖3，P8組能夠顯著降低STZ糖尿病模型小鼠的空腹血糖，明顯優(yōu)于GLP-1組和Exendin-4組，到第5周，與模型組比較，p≤0.01，具有顯著性差異。

4、對STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游離脂肪酸的影響

給藥5周后，眼眶取血，靜置收集血清，試劑盒分別檢測甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平，結(jié)果如圖4。結(jié)果顯示，血清甘油三酯水平，P8組與模型組比較，p≤0.001，具有極顯著性差異，Exendin-4組與模型組比較，p≤0.01，GLP-1與模型組比較，無明顯差異性；血清游離脂肪酸水平，P8組與模型組比較具有顯著性差異，p≤0.01，GLP-1組、Exendin-4組與模型組比較，無顯性著差異。結(jié)果說明，P8處理后能夠明顯降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游離脂肪酸水平，優(yōu)于GLP-1組、Exendin-4組。

5、對STZ糖尿病模型小鼠胰島形態(tài)(HE染色)的影響

給藥5周后，處死小鼠，取胰腺，用福爾馬林固定，經(jīng)HE染色后，觀察胰島形態(tài)，結(jié)果如圖6。模型組胰島損傷嚴(yán)重，幾乎看不到完整的胰島結(jié)構(gòu)，GLP-1組、Exendin-4組和P8組胰島形態(tài)得到明顯改善，可以觀察到細(xì)胞著色淺、排列呈團(tuán)索狀的胰島結(jié)構(gòu)。說明GLP-1組、Exendin-4組和P8組均能改善胰島形態(tài)。

6、對STZ糖尿病模型小鼠胰島面積的影響

給藥5周后，處死小鼠，取胰腺，福爾馬林固定，免疫染色(insulin、ki67)，結(jié)果如圖7。免疫染色圖片顯示，模型組胰島β細(xì)胞很少(STZ損傷誘導(dǎo)β-細(xì)胞死亡)，而GLP-1組、Exendin-4組和P8組胰島β細(xì)胞增多，說明P8組能夠明顯增加胰島β細(xì)胞量，增加胰島β細(xì)胞面積。

7、對STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平的影響

給藥5周后，眼眶取血，靜置收集血清，試劑盒檢測C肽水平，結(jié)果如圖8。結(jié)果顯示，P8組與模型組存在顯著差異，p≤0.05，GLP-1組、Exendin-4組與模型組比較，無明顯差異，說明P8處理后能夠明顯降低STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平，優(yōu)于GLP-1組、Exendin-4組。

實施例3：P8的藥效學(xué)評價二

1、對db/db糖尿病模型小鼠血糖的影響

24只6周齡的雄性db/db小鼠(購自南京大學(xué)，許可證號：SCXK(蘇)2015-00001)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。，從第7周開始檢查血糖，AM 8：00開始禁食，AM 12：00，尾靜脈檢測血糖，檢測用血糖檢測儀(歐姆龍血糖儀HEA-231型)。第9周時，開始給藥，并檢測血糖，第10周時，與模型組、GLP-1組比較，血糖顯著降低，分別為p≤0.001和p≤0.05，并持續(xù)維持較低的血糖水平，與模型組存在顯著差異，降糖明顯優(yōu)于GLP-1組，與Exendin-4組基本持平。

2、對db/db糖尿病模型小鼠胰島素耐量的影響

第16周，小鼠空腹8小時，AM 8：00開始禁食，PM 4：00，尾靜脈檢測空腹血糖，檢測用血糖檢測儀(歐姆龍血糖儀HEA-231型)，檢測空腹血糖，作為胰島素耐量的0點血糖，按1IU/kg的劑量皮下注射胰島素，之后分別在注射胰島素之后15、30、60、90、120分鐘檢測血糖，并分別計算曲線下面積。結(jié)果P8顯著改善胰島素耐量，與溶劑組和GLP-1組均具有顯著性差異，與Exendin-4組效果一樣。