本發(fā)明涉及分子標記技術，具體地指一種快速鑒定黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的引物及其鑒定方法。

背景技術：

黃顙魚在分類上隸屬于鯰形目，鲿科，黃顙魚屬，該屬中主要有黃顙魚、瓦氏黃顙魚(江黃顙魚)、岔尾黃顙魚和光澤黃顙魚等4種。黃顙魚是我國淡水養(yǎng)殖中非常重要的一種經(jīng)濟魚類，對生態(tài)環(huán)境適應性較強，廣泛分布于我國淡水水體中，2014年養(yǎng)殖產(chǎn)量高達34萬噸。因其具有肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，含肉率高，除脊刺外沒有肌間刺等優(yōu)點，頗受廣大消費者歡迎。

瓦氏黃顙魚，是該屬中個體最大、生長最快的種類，2齡魚體重最高可達600g左右。瓦氏黃顙魚的仔稚魚和幼魚的生長和成活率顯著高于黃顙魚(甘煉,2008)，以黃顙魚為母本，以瓦氏黃顙魚為父本雜交獲得的子一代雜交黃顙魚，從形態(tài)特征上比較接近黃顙魚，但其在受精率和生長速度上比普通黃顙魚有明顯的優(yōu)勢(王衛(wèi)民,2002；王明寶，2012)。因此，雜交黃顙魚作為近年來嶄露頭角的一種養(yǎng)殖新品種，市場前景非?？春茫邳S顙魚養(yǎng)殖中占有相當大的比例。但是雜交黃顙魚后代一般是不可育的，不能用于后期的苗種制備。

目前，從形態(tài)學上很難區(qū)分雜交黃顙魚和普通黃顙魚的苗種和成魚。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種快速鑒定黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的引物及其鑒定方法。該方法利用DNA標記進行種間鑒定成為可能。我們在黃顙魚中克隆得到一個新基因Inad-like，并在瓦氏黃顙魚中得到其基因組序列。通過Inad-like基因在黃顙魚和瓦氏黃顙魚基因組中的序列差異，我們篩選得到了一對可以將黃顙魚、瓦式黃顙魚以及其雜交種準確鑒定出來的標記，為黃顙魚下一步的育種研究奠定了基礎。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種黃顙魚inad-like蛋白的氨基酸序列為：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或

(2)與序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在90-100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個或多個氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

編碼上述蛋白的黃顙魚inad-like基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明提供了一種鑒定黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的引物對，其引物對序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示所示。

利用上述引物對鑒定黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的方法，包括以下步驟：

1)提取黃顙魚、瓦式黃顙魚及其雜交種黃顙魚基因組DNA

選取1齡的黃顙魚、瓦式黃顙魚及其雜交種魚各10條，剪取尾鰭，保存在100％的酒精中，使用醋酸銨提取法提取基因組DNA。

2)分子標記的選擇

通過對黃顙魚和瓦氏黃顙魚Inad-like基因序列進行比對分析，并設計上述引物對，并以黃顙魚、瓦式黃顙魚及其雜交種黃顙魚基因組DNA為模板分別進行PCR擴增；得到三個不同PCR產(chǎn)物；

3)黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種魚的鑒定

以上述三個不同PCR產(chǎn)物PCR擴增的凝膠電泳結果來判斷其種類，只擴增出一條1908bp條帶的為黃顙魚；只擴增出一條1178bp條帶的為瓦氏黃顙魚；同時擴增出1178bp、1908bp兩條條帶的為瓦氏黃顙魚與黃顙魚雜交種黃顙魚。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)本發(fā)明首次在黃顙魚中克隆一個新的基因，命名為inad-like。

2)本發(fā)明首次在黃顙魚屬，開發(fā)可以鑒定區(qū)分黃顙魚、瓦式黃顙魚以及雜交種的DNA分子標記。

3)本發(fā)明可以應用到實踐中，區(qū)分市場上的三種類型的黃顙魚，規(guī)范黃顙魚市場，為黃顙魚分子育種提供優(yōu)良基礎。

附圖說明

圖1為DNAMAN對兩種魚該基因的序列進行比對圖；

圖2為PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結果圖。

具體實施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實施例。

鑒定黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的方法

1)取黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種黃顙魚各10尾，取樣于武漢市江夏區(qū)上涉湖養(yǎng)殖基地。

2)黃顙魚、瓦式黃顙魚及其雜交種黃顙魚基因組DNA提取

取0.2g鰭條組織到1.5ml離心管中，加入600μl細胞裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mm/L，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM)和15μl蛋白酶K(10mg/ml)，將鰭條于離心管中剪碎，放置離心管于水浴鍋中62℃水浴2-4h，每隔半小時輕搖離心管，直至充分裂解。取出離心管冷卻至室溫后，加入200μl 7.5M醋酸銨，上下?lián)u勻，冰上放置5min，之后1,2000rpm 4℃離心10min，取上清液于新管中，1,2000rpm 4℃離心10min，取上清液500μl于新管中。加入600μl異丙醇，輕搖，析出沉淀，室溫下靜置1-2min，1,2000rpm 4℃離心5min，棄上清液。加入1ml 70％乙醇，輕搖混勻，1,2000rpm4℃離心10min，棄上清液，加入1ml無水乙醇，輕搖混勻，1,2000rpm4℃離心5min，棄上清液。

室溫下干燥10-20min，加入100μl ddH₂O，靜置20-30min完全溶解，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，將各DNA樣品稀釋至100ng/μL。

3)inad-like基因的克隆

采用特異引物設計合成和染色體步移技術，得到黃顙魚inad-like基因的全長。

4)序列比對分析

根據(jù)黃顙魚Inad-like基因的外顯子序列設計引物進行PCR擴增，并進行切膠回收以及TA克隆，經(jīng)測序得到瓦氏黃顙魚該基因序列，用DNAMAN對兩種魚該基因的序列進行比對，可發(fā)現(xiàn)在第六段及第七段外顯子之間序列黃顙魚較瓦氏黃顙魚多出730bp(圖1)。

5)分子標記的開發(fā)

根據(jù)上述片段大小差異，設計一對引物(表1)，

上游引物位于第6段外顯子序列，下游引物位于第7段外顯子序列，使用該對引物分別在三種黃顙魚基因組DNA上進行PCR擴增。PCR反應體系為10μl：5.0μl MasterMix，上下游引物各0.5μl(10μm/L)，0.5μl DNA模版，加ddH₂O至10μl。PCR程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min50s，反應進行34個循環(huán)；最后再延伸7min。

表1.用于鑒定黃顙魚和瓦氏黃顙魚的引物序列信息

其中：F：上游引物R：下游引物

6)黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種魚的鑒定結果

PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結果見圖2，第一組為黃顙魚，擴增條帶大小為1908bp；第二組為瓦氏黃顙魚，擴增條帶大小為1178bp；第三組為黃顙魚于瓦氏黃顙魚雜交種黃顙魚，擴增出兩條條帶，條帶大小分別為1908bp、1178bp。鑒定成功率為100％，可以準確鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種黃顙魚。

其它未詳細說明的部分均為現(xiàn)有技術。盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據(jù)本實施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護范圍。