本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞株及其瘤苗的制備方法，具體涉及一種攜帶GFAP基因的腫瘤細(xì)胞株及其瘤苗的制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，隨著對腫瘤免疫逃逸機(jī)理的認(rèn)識以及對腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)及鑒定，以樹突狀細(xì)胞(DC)抗腫瘤疫苗為代表的主動免疫治療成為腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。DC是人體內(nèi)抗原遞呈能力最強(qiáng)、唯一能在體內(nèi)活化靜息T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者。DC是以主要組織相容性復(fù)合物MHC I、II類肽復(fù)合物的形式遞呈抗原，具有促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。因此被廣泛應(yīng)用于腫瘤疾病疫苗研究。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞功能缺陷有關(guān)，特別是晚期腫瘤患者，其體內(nèi)往往存在體液免疫和細(xì)胞免疫功能的普遍低下，導(dǎo)致免疫功能低下的原因之一是人體內(nèi)DC功能的下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從外周血分離出的淋巴細(xì)胞仍對多種抗原刺激保持很好的反應(yīng)能力。因此，通過體外制備DC瘤苗有望成為治療腫瘤的理想療法。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞漿8-10nm的中間絲，是構(gòu)成膠質(zhì)細(xì)胞的骨架成分。Lawrence等人肯定了GFAP在膠質(zhì)瘤診斷中的重要價(jià)值，尤其認(rèn)為當(dāng)對于顱內(nèi)腫瘤的來源診斷具有困難時(shí)，GFAP陽性對于判斷腫瘤的膠質(zhì)細(xì)胞來源具有重要的參考意義?？梢哉J(rèn)為GFAP是膠質(zhì)瘤區(qū)別于其他惡性腫瘤的重要特異性標(biāo)志物。GFAP也作為鑒定神經(jīng)膠質(zhì)瘤的特異性抗原，因而選擇GFAP作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療DC疫苗的抗原具有重要價(jià)值。

近來，腫瘤疫苗已發(fā)展成為一種重要的腫瘤生物治療手段。與手術(shù)治療、放射治療相比，生物治療毒副作用小，特異性高，作用范圍更廣泛，在腫瘤治療研究中越來越引起重視。

目前，針對各種腫瘤設(shè)計(jì)了多種轉(zhuǎn)基因瘤苗，如將各種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染相關(guān)的腫瘤細(xì)胞以改善腫瘤細(xì)胞的遺傳背景，提高免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。將DC和腫瘤細(xì)胞融合，可以獲得既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原的雜合子，使DC攝取腫瘤抗原誘導(dǎo)免疫激活，從而增強(qiáng)對腫瘤的殺傷力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶GFAP基因的腫瘤細(xì)胞株及其瘤苗的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種腫瘤細(xì)胞株，其特征在于，該腫瘤細(xì)胞株為攜帶GFAP基因的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6。

制備前述的腫瘤細(xì)胞株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)GFAP質(zhì)粒；

Step2：將過表達(dá)GFAP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6；

Step3：篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

前述的方法，其特征在于，在Step1中，構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)GFAP質(zhì)粒的方法為：

(1)通過RT-PCR技術(shù)獲取一段鼠源性的GFAP基因；

(2)將GFAP基因克隆與pGEM-T載體連接；

(3)取適量pGEM-GFAP基因和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，分別用EcoR Ⅰ和XHo Ⅰ雙酶切，再進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系為：

(4)用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選，小量擴(kuò)增后抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFAP。

前述的方法，其特征在于，在Step2中，將過表達(dá)GFAP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的方法為：

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6常規(guī)培養(yǎng)傳代，當(dāng)細(xì)胞生長至60％-70％融合時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFAP轉(zhuǎn)染到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6。

一種瘤苗，其特征在于，含有前述的攜帶GFAP基因的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6。

制備前述的瘤苗的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：取健康的6-8周齡SD大鼠，斷頸法處死，浸入75％的乙醇中消毒3-5min，無菌手術(shù)取出股骨和脛骨，剔去肌肉組織之后用70％酒精消毒5min，再用PBS洗滌3次，剪去股骨和脛骨兩端，用PBS洗滌2次，用滅菌注射器抽取無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，自股骨和脛骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓，直至股骨和脛骨變白，過200目的鋼網(wǎng)，收集骨髓細(xì)胞，1000g離心5min之后棄上清，加入3-10ml Tris-NH₄Cl處理2-3min后去除紅細(xì)胞，用PBS洗滌2次，獲得DC細(xì)胞；

Step2：將DC細(xì)胞濃度調(diào)整至10⁶個(gè)/ml，重懸于含10ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4和10％FBS的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2天半量換液一次；

Step3：培養(yǎng)至第5d時(shí)，向完全培養(yǎng)液中加入經(jīng)GFAP基因修飾的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6共培養(yǎng)，經(jīng)GFAP基因修飾的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的濃度為100μg/ml；

Step4：培養(yǎng)至第6d時(shí)，向完全培養(yǎng)液中加入LPS刺激DC細(xì)胞成熟，培養(yǎng)48h，收集懸浮和輕微貼壁的細(xì)胞，此細(xì)胞即為培養(yǎng)成熟的DC細(xì)胞。

本發(fā)明的有益之處在于：通過基因轉(zhuǎn)染獲得轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞，使用共培養(yǎng)法獲得DC疫苗，該DC疫苗具有誘導(dǎo)作用強(qiáng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床應(yīng)用，具有很大的潛在價(jià)值。

附圖說明

圖1是PCR產(chǎn)物的電泳EB染色圖；

圖2是凝膠電泳圖；

圖3是凝膠攝像圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作具體的介紹。

一、制備攜帶GFAP基因的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6

1、構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)GFAP質(zhì)粒

(1)通過RT-PCR技術(shù)獲取一段鼠源性的GFAP基因。

(2)將GFAP基因克隆與pGEM-T載體連接。

鑒定獲取的基因：GFAP基因克隆與pGEM-T載體連接后，先轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，然后篩選白色菌落過夜培養(yǎng)，再進(jìn)行質(zhì)粒抽提，酶切鑒定。

參見圖1，鑒定結(jié)果為：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳EB染色顯示在1300bp左右有一條特異性條帶，其與預(yù)期的GFAP基因大小一致。

(3)取適量pGEM-GFAP基因和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，分別用EcoR Ⅰ和XHo Ⅰ雙酶切，再進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系為：

以水代替目的基因片段作為對照。

(4)用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選，小量擴(kuò)增后抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFAP。

鑒定是否成功克隆GFAP基因：用EcoR Ⅰ和XHo Ⅰ雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFAP，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定并測序。

結(jié)果：(1)參見圖2，凝膠電泳結(jié)果可見有兩條特異性條帶，分子量大于2000bp左右的片段為pcD-NA3.1(+)載體片段，分子量1300bp左右的片段為目的條帶GFAP基因片段；(2)測序結(jié)果與Gen Bank的GFAP序列一致。

表明：pcDNA3.1(+)質(zhì)粒已成功克隆GFAP基因。

2、培養(yǎng)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6

將大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長至80-90％融合時(shí)，用含EDTA的胰酶消化后經(jīng)行傳代。

3、將過表達(dá)GFAP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6常規(guī)培養(yǎng)傳代，當(dāng)細(xì)胞生長至60％-70％融合時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFAP轉(zhuǎn)染到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6。

將pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C6做對照。

鑒定是否轉(zhuǎn)染成功：參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作，常規(guī)抽提轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-GFAP質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中的總RNA，分別取上述總RNA2μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，判斷PCR產(chǎn)物大小。

SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)：用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒的C6細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)離心后提取上清，與加樣緩沖液混合，分別用沸水煮5min，各取20μL電泳，同時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照，電泳結(jié)束，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后凝膠攝像(圖3)。將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-GFAP質(zhì)粒的C6細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，分子量大小為70-90KD，符合預(yù)期大小，空質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中無此條帶。

4、篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

采用常規(guī)手段篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株，用于制備瘤苗。

二、制備瘤苗

1、獲得DC細(xì)胞

取健康的6-8周齡SD大鼠，斷頸法處死，浸入75％的乙醇中消毒3-5min，無菌手術(shù)取出股骨和脛骨，剔去肌肉組織之后用70％酒精消毒5min，再用PBS洗滌3次，剪去股骨和脛骨兩端，用PBS洗滌2次，用滅菌注射器抽取無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，自股骨和脛骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓，直至股骨和脛骨變白，過200目的鋼網(wǎng)，收集骨髓細(xì)胞，1000g離心5min之后棄上清，加入3-10ml Tris-NH₄Cl處理2-3min后去除紅細(xì)胞，用PBS洗滌2次，獲得DC細(xì)胞。

2、培養(yǎng)DC細(xì)胞

將DC細(xì)胞濃度調(diào)整至10⁶個(gè)/ml，重懸于含10ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4和10％FBS的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2天半量換液一次。

3、共培養(yǎng)

培養(yǎng)至第5d時(shí)，向完全培養(yǎng)液中加入經(jīng)GFAP基因修飾的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6共培養(yǎng)，經(jīng)GFAP基因修飾的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的濃度為100μg/ml。

4、刺激DC細(xì)胞成熟

培養(yǎng)至第6d時(shí)，向完全培養(yǎng)液中加入LPS刺激DC細(xì)胞成熟，培養(yǎng)48h，收集懸浮和輕微貼壁的細(xì)胞，此細(xì)胞即為培養(yǎng)成熟的DC細(xì)胞。

用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)至第8天的DC，可見DC表面高表達(dá)共刺激分子CD80(83.8％)、CD86(84.8％)、CD40(85.6％)、CD11c(82.2％)等成熟DC細(xì)胞所具有的表型分子。

三、DC激活的GFAP抗原特異CTL抗腫瘤活性檢測

獲得成熟的DC細(xì)胞后，取凍存的T細(xì)胞與培養(yǎng)所得的DC細(xì)胞按DC：T＝1：20比例混合，以1640為培養(yǎng)基，同時(shí)加入GM-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)共培養(yǎng)。

激活的CTL細(xì)胞表面標(biāo)志分析：培養(yǎng)第13天，流式細(xì)胞儀檢測CTL群體中CD8/CD4的值和CD/CD56的值，檢測結(jié)果如下：

轉(zhuǎn)染組的CD8/CD4的值為3.25，CD/CD56的值為5.35，二者均明顯高于對照組DC細(xì)胞激活的CTL細(xì)胞的1.4和0.89。

激活的CTL細(xì)胞因子表達(dá)分析：培養(yǎng)第14天，收集CTL，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況，與對照組IFN-γ表達(dá)(17.6％)、IL-4表達(dá)(12.5％)相比，轉(zhuǎn)染組IFN-γ明顯高表達(dá)(26.3％)、IL-4明顯低表達(dá)(1.3％)。

四、CTL的腫瘤特異性殺傷活性檢測

DC細(xì)胞與經(jīng)GFAP基因修飾的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6共培養(yǎng)，混合培養(yǎng)至第4天，將其加入處于對數(shù)生長期的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中，效：靶細(xì)胞比分別為1：20和1：40，每組各設(shè)3個(gè)平行孔，另設(shè)C6細(xì)胞組、DC組、淋巴細(xì)胞組做基礎(chǔ)對照。放入培養(yǎng)箱內(nèi)37C、5％CO₂下溫育24h，MTT比色法計(jì)數(shù)測定CTL殺傷活性。

經(jīng)測定，結(jié)果顯示：GFAP轉(zhuǎn)染修飾腫瘤抗原進(jìn)一步提高了DC的CTL對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性，并且明顯高于對照組。

需要說明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。