本發(fā)明涉及一種OsSAPK7蛋白及其編碼基因在提高水稻白葉枯病抗性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由稻黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的白葉枯病是全球稻作栽培中重要的細(xì)菌性病害之一，在我國華南和東南亞稻區(qū)危害嚴(yán)重。水稻白葉枯病一般可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10％左右，嚴(yán)重時可減產(chǎn)50％-60％。利用抗性基因，培育抗病品種是防治水稻白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。采用表型鑒定、遺傳分析和基因定位等方法相結(jié)合，目前，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)報道40個水稻抗白葉枯病基因。然而，在已報道的水稻白葉枯病抗性基因中，由于來源于野生稻的抗病基因難以利用、部分抗病基因的抗性僅在水稻成株期以后表達(dá)以及大多抗性基因的抗譜較窄等原因，長期以來，僅Xa3、Xa4、Xa7、Xa21和Xa23等幾個基因在生產(chǎn)中得以應(yīng)用。水稻白葉枯病菌具有復(fù)雜的多樣性和高度的變異性，攜帶單一主效基因的抗病品種大面積推廣種植后，潛在的毒性小種上升為優(yōu)勢小種或由于病菌變異出現(xiàn)新的毒性小種，品種迅速抗性喪失，這是長期困擾育種家和植物病理學(xué)家的一個難題。因此，發(fā)掘和利用新基因，提高水稻對白葉枯病的抗性，對于水稻穩(wěn)產(chǎn)具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種OsSAPK7蛋白及其編碼基因在提高水稻白葉枯病抗性中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟：將編碼OsSAPK7蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)水稻，得到對白葉枯病的抗性提高的轉(zhuǎn)基因水稻。

所述OsSAPK7蛋白，獲自水稻，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物白葉枯病抗性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

為了使(a)中的OsSAPK7蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1標(biāo)簽的序列

上述(b)中的OsSAPK7可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的OsSAPK7蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

所述“編碼OsSAPK7蛋白的基因(簡稱OsSAPK7基因)”為如下(1)或(2)或(3)：

(1)編碼區(qū)如序列表的序列1自5’末端第1-1080位核苷酸所示的DNA分子；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有抗白葉枯病功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；

(3)與(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有抗白葉枯病功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

所述方法中，所述OsSAPK7基因可以通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)水稻。所述重組表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞或組織中。

所述重組表達(dá)載體具體可為將載體pMDC43中插入了序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)所述OsSAPK7蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)或(c2)：

(c1)調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性；

(c2)提高水稻對白葉枯病的抗性。

本發(fā)明還保護(hù)所述OsSAPK7基因的應(yīng)用，為如下(c1)或(c2)：

(c1)調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性；

(c2)提高水稻對白葉枯病的抗性。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在水稻育種中的應(yīng)用。

所述水稻育種的目的是選育對白葉枯病抗性高的水稻。

本發(fā)明還保護(hù)一種水稻育種方法，包括如下步驟：增加水稻中所述OsSAPK7蛋白的表達(dá)量和/或活性，從而促使水稻對白葉枯病的抗性提高。

本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟：抑制目的水稻中所述OsSAPK7基因的表達(dá)，得到對白葉枯病的抗性降低的轉(zhuǎn)基因水稻。

所述“抑制目的水稻中所述OsSAPK7基因的表達(dá)”是通過導(dǎo)入RNAi載體實現(xiàn)的。

所述RNAi載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞或組織中。

所述RNAi載體具體可為含有干擾片段的重組載體；所述干擾片段如序列表的序列3所示。

所述RNAi載體具體可為將載體pH7GWIWG2(II)中插入了序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

所述序列3為OsSAPK7基因編碼區(qū)終止密碼子后第56位-第253位核苷酸對應(yīng)的區(qū)段。

本發(fā)明還保護(hù)一種特異DNA分子或所述特異DNA分子轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子或所述特異DNA分子編碼的siRNA；所述DNA分子如序列表中序列3所示。

本發(fā)明還保護(hù)一種降低水稻對白葉枯病的抗性的方法，包括如下步驟：減少目的水稻中所述OsSAPK7蛋白的表達(dá)量和/或活性，得到對白葉枯病的抗性降低的水稻。

以上任一所述水稻具體可為水稻品系9804。

以上任一所述白葉枯病是由白葉枯病致病菌引起的。所述白葉枯病致病菌具體可為水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xoo)，更具體可為生理小種ZHE173。

本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，水稻植株接種水稻白葉枯病菌(水稻黃單胞菌水稻致病變種)后OsSAPK7基因上調(diào)表達(dá)，表明該基因可能參與調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制OsSAPK7表達(dá)，水稻對白葉枯病的感病性提高；OsSAPK7過表達(dá)的水稻植株對白葉枯病的抗性顯著增強(qiáng)，表明該基因可以用于改良水稻對白葉枯病的抗性。本發(fā)明對于培育抗白葉枯病水稻新品種具有重要的意義，適合于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實施例1中水稻品系9804接種Xoo菌株ZHE173后OsSAPK7的表達(dá)情況。

圖2為實施例2中部分RNAi轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果。

圖3為實施例2中野生型植株和RNAi轉(zhuǎn)基因植株中OsSAPK7的表達(dá)情況。

圖4為實施例2中野生型植株和RNAi轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果。

圖5為實施例2中野生型植株和RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片的病斑長度。

圖6為實施例3中部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果。

圖7為實施例3中野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株中OsSAPK7的表達(dá)情況。

圖8為實施例3中野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的Western blot結(jié)果。

圖9為實施例3中野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株葉片的病斑長度。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

OsSAPK7基因的編碼區(qū)序列如序列表的序列1所示，編碼序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)(OsSAPK7蛋白)。

水稻品系9804(簡稱9804水稻)：參考文獻(xiàn)：謝學(xué)文，于晶，徐建龍，周永力，黎志康.玉米細(xì)菌性條斑病非寄主抗性基因Rxol轉(zhuǎn)化水稻的研究.生物工程學(xué)報，2007，23(4)：607-611.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

Xoo菌株ZHE173：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。參考文獻(xiàn)：李欣，于慧春，龐新躍，等.水稻白葉枯病菌內(nèi)源過氧化氫的產(chǎn)生及定位[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，32(3)：160-163.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

載體pDONR201：Invitrogen公司，貨號：11798-014。

載體pH7GWIWG2(II)：參考文獻(xiàn)：徐品三，白建芳，劉紀(jì)文，等.Gateway技術(shù)快速構(gòu)建百合雙價抗病毒RNAi表達(dá)載體[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(4)：144-147.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

載體pMDC43：BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心。

根癌農(nóng)桿菌EHA105：BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，煙酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麥芽糖30g，瓊脂3g，去離子水加至1L。

侵染培養(yǎng)基：配制方法參見參考文獻(xiàn)：Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al.Efficient transformation of rice(Oryza sativa，L.)mediated by Agrobacterium，andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant Journal，1994，6(2)：271-282.。將參考文獻(xiàn)中乙酰丁香酮的濃度替換為200μM。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培養(yǎng)基中的終濃度為200μM，葡萄糖在培養(yǎng)基中的終濃度為10g/L。

抑菌培養(yǎng)基：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中頭孢霉素，使頭孢霉素在培養(yǎng)基中的終濃度為500mg/L。

篩選培養(yǎng)基：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入潮霉素和頭孢霉素，使潮霉素在培養(yǎng)基中的終濃度為65mg/L，頭孢霉素在培養(yǎng)基中的終濃度為500mg/L。

預(yù)再生培養(yǎng)基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8mg，VR1 0.1mg，VB6 0.5mg，煙酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麥芽糖30g，瓊脂3g，激動素2mg，萘乙酸1mg，去離子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其濃度為50mg/L。

再生培養(yǎng)基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8mg，VR1 0.1mg，VB6 0.5mg，煙酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麥芽糖30g，瓊脂6g，激動素2mg，萘乙酸1mg，去離子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其濃度為50mg/L。

DNA Maker：Biomed，貨號：MD102。

實施例1、OsSAPK7基因表達(dá)分析

1、將9804水稻的種子播于盛有滅菌土壤的育秧盤中，在溫室中培養(yǎng)25天后移栽到網(wǎng)室中，單株種植。

2、在步驟1水稻植株的分蘗盛期，用Xoo菌株ZHE173，采用剪葉法對水稻植株進(jìn)行人工接種，每株接種5張葉片。

3、完成步驟2人工接種的0、2、4、6、9、11、48、72、96h，剪取接種的葉片，迅速放入液氮中速凍，每樣品各取三個生物學(xué)重復(fù)。所有樣品液氮速凍后置-70℃保存。

4、取步驟3得到的樣品，提取樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

5、以步驟4得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用引物F和引物R檢測OsSAPK7基因的表達(dá)水平，采用引物Actin-F和引物Actin-R檢測內(nèi)參基因(Actin基因)的表達(dá)水平。

F：5′-AGCAGGTGAAACAAGTCCA-3′；

R：5′-AGAAAAAATGAAACTGAAAAAAG-3′；

Actin-F：5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′；

Actin-R：5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′。

qRT-PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5μL，dNTP 10mM(Mg²⁺，25mM)0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板cDNA 2μL(200-400ng)，引物F1μL，引物R1μL，ddH₂O 17.5μL。在反應(yīng)體系中，引物F和引物R的濃度均為10μM。

qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃10min。

qRT-PCR分析結(jié)果顯示溶解曲線均為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，熒光曲線可以很好地反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果。對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在接種Xoo菌株ZHE173后，9804水稻葉片中OsSAPK7的表達(dá)量隨著接種時間的推移逐漸升高，接種6h后達(dá)到峰值，隨后又逐漸下降，在72h后，又達(dá)到另一峰值。

實施例2、OsSAPK7基因功能分析

一、OsSAPK7基因RNAi載體構(gòu)建

1、提取9804水稻葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟1得到cDNA為模板，采用引物attB-F和引物attB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

attB-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGCAGCTGATGGTCACACT-3′：

attB-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGATGCTCAATGAGATGGTTTT-3′。

3、通過BP反應(yīng)，將步驟2得到的擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入載體pDONR201，得到含有序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子的陽性入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK7i(已經(jīng)測序驗證)。

BP反應(yīng)體系：擴(kuò)增產(chǎn)物2.7μL(50-100ng)，載體pDONR2011.0μL(30-50ng)，5×BP Reaction Buffer 1.0μL，BP Enzyme mix 0.3μL。

BP反應(yīng)條件：25℃溫浴1h。

4、取步驟3得到的陽性入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK7i，與載體pH7GWIWG2(II)進(jìn)行LR反應(yīng)，得到含有序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子的RNAi表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i。

LR反應(yīng)體系：入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK7i1μL(50-100ng)，載體pH7GWIWG2(II)1μL(50-100ng)，LR enzyme mix 0.5μL。

LR反應(yīng)條件：25℃溫浴1h。

二、RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

1、取9804水稻的成熟種子，機(jī)械脫殼，挑取飽滿光潔無菌斑的種子進(jìn)行消毒。

2、將步驟1消毒后的種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基28℃、暗培養(yǎng)14天左右，選取外觀良好，生長力好的愈傷組織。

3、取步驟一構(gòu)建的表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到重組菌EHA105/0sSAPK7i。

4、取步驟3得到的重組菌EHA105/OsSAPK7i，用侵染培養(yǎng)基重懸菌體，得到菌懸液。

5、將完成步驟2的愈傷組織浸泡于步驟4制備的菌懸液中，侵染20min。侵染后將菌懸液倒掉，取愈傷組織，用無菌濾紙吸干水分，然后置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)28℃暗培養(yǎng)50-55h。

6、完成步驟5后，挑選表面沒有明顯農(nóng)桿菌的愈傷組織移至抑菌培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)3-4天。

7、完成步驟6后，將愈傷組織移至篩選培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)培養(yǎng)30天，每10天繼代一次。

8、完成步驟7后，取新鮮潮霉素抗性的愈傷組織，接于預(yù)再生培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)7天，然后置于光照培養(yǎng)間(12h光照/12h黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基上，繼續(xù)光照培養(yǎng)，直至生長出再生植株，得到T0代植株。T0代植株自交，得到T1代植株。T1代植株自交，得到T2代植株。T2代植株自交，得到T3代植株。

三、RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

1、取步驟二獲得的各個株系的T2代植株，提取植株葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用引物Hyg-F和Hyg-R進(jìn)行PCR鑒定。采用RNAi表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i作為陽性對照，采用9804水稻的cDNA作為陰性對照。

Hyg-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’；

Hyg-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’。

如果對于某一T0代植株，其抽樣檢測的T2代植株的PCR鑒定結(jié)果均為陽性，該T0代植株及其自交后代為一個純合的RNAi轉(zhuǎn)基因株系。

部分植株的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。圖2中，M為DNA Maker，+為陽性對照，-為陰性對照，泳道1-10依次對應(yīng)10個不同株系的T2代植株。結(jié)果表明，10個株系的植株均能擴(kuò)增出與質(zhì)粒載體潮霉素基因一致的特異條帶，表明了帶hpt/hyg標(biāo)記基因的T-DNA已經(jīng)插入并整合到受體基因組中，10個株系均為純合的RNAi轉(zhuǎn)基因株系。

2、選取步驟1RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的4個RNAi轉(zhuǎn)基因株系(命名為Ri-1、Ri-2、Ri-3、Ri-4)的T2代植株，采用qRT-PCR分析各株系中OsSAPK7基因的表達(dá)量的變化，鑒定轉(zhuǎn)基因株系的RNAi效率。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示：RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-2和Ri-3植株中OsSAPK7基因顯著下調(diào)表達(dá)。

3、為檢測外源基因OsSAPK7在水稻基因組中的整合情況，根據(jù)目的基因表達(dá)量選取RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-2和Ri-3的T2代植株，對其基因組DNA進(jìn)行HindIII單酶切，以Hyg基因標(biāo)記探針進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果如圖4所示，雜交結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系Ri-2是雙拷貝整合，Ri-3是三拷貝整合。

四、轉(zhuǎn)空載體株系的獲得

采用表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)替代表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i按照步驟二的1-8進(jìn)行操作，得到轉(zhuǎn)空載體株系。

五、RNAi轉(zhuǎn)基因株系的白葉枯病抗性鑒定

待測植株為：9804水稻(野生型)、RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-2的T3代植株、RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-3的T3代植株、轉(zhuǎn)空載體株系的T3代植株。

1、將待測植株的種子播于裝有淋過土壤殺菌劑的營養(yǎng)土壤的育秧盤中，在溫室中培養(yǎng)約25天后移栽至網(wǎng)室中進(jìn)行種植，單株種植，每個株系種植20株。

2、在步驟1水稻植株的分蘗盛期，用Xoo菌株ZHE173，采用剪葉法對水稻植株進(jìn)行人工接種，每株接種5張葉片(菌液濃度為1×10⁹cfu/mL)。

3、完成步驟2后繼續(xù)培養(yǎng)14天，14天后測量各植株葉片的病斑長度，每個葉片沿葉脈有一個病斑，每個植株測量3張接種葉片的病斑長度，計算平均值。

結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，野生型植株的病斑長度為14.7cm，RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-2植株的病斑長度為22.5cm，顯著長于野生型的病斑長度；RNAi轉(zhuǎn)基因株系Ri-3植株的病斑長度為16.7cm，長于野生型的病斑長度。轉(zhuǎn)空載體水稻的病斑長度與野生型的病斑長度無顯著差異。結(jié)果表明抑制OsSAPK7基因表達(dá)，能夠提高水稻對白葉枯病的感病性。

實施例3、OsSAPK7基因在提高水稻白葉枯病中的應(yīng)用

一、OsSAPK7基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

1、提取9804水稻葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟1得到cDNA為模板，采用引物attB-F1和引物attB-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

attB-F1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGAGAGGTACGAGCTGCTC-3′：

attB-R1∶5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGCTGAGCTGAAACTCACCA-3′。

3、通過BP反應(yīng)，將步驟2得到的擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入載體pDONR201，得到含有序列表序列1所示的雙鏈DNA分子的陽性入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK7。

BP反應(yīng)體系：擴(kuò)增產(chǎn)物2.7μL(50-100ng)，載體pDONR201 1.0μL(30-50ng)，5×BP Reaction Buffer 1.0μL，BP Enzyme mix 0.3μL。

BP反應(yīng)條件：25℃溫浴1h。

4、取步驟3得到的陽性入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK7，與載體pMDC43進(jìn)行LR反應(yīng)，得到含有序列表序列1所示的雙鏈DNA分子的35S：：GFP-OsSAPK7表達(dá)載體(已經(jīng)測序驗證)。

LR反應(yīng)體系：入門克隆質(zhì)粒pDONR201-OsSAPK71μL(50-100ng)，載體pMDC431μL(50-100ng)，LR enzyme mix 0.5μL。

LR反應(yīng)條件：25℃溫浴1h。

二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定

1、采用35S：：GFP-OsSAPK7表達(dá)載體替代表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i按照實施例2步驟二的1-8進(jìn)行操作，得到T2代植株。

2、取步驟1獲得的各個株系的T2代植株，提取植株葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以eDNA為模板，采用引物Hyg-F和Hyg-R進(jìn)行PCR鑒定。采用35S：：GFP-OsSAPK7表達(dá)載體作為陽性對照，采用9804水稻的cDNA作為陰性對照。

Hyg-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’：

Hyg-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’。

如果對于某一T0代植株，其抽樣檢測的T2代植株的PCR鑒定結(jié)果均為陽性，該T0代植株及其自交后代為一個純合的轉(zhuǎn)基因株系。

部分植株的PCR鑒定結(jié)果如圖6所示。圖6中，M為DNA Maker，+為陽性對照，-為陰性對照，泳道1-27依次對應(yīng)27個不同株系的T2代植株。結(jié)果表明，除第20個泳道(OE20)和第22個泳道(OE22)中沒有擴(kuò)增出明顯的陽性條帶，其余植株均能擴(kuò)增出與質(zhì)粒載體潮霉素基因一致的特異條帶，表明了第20和第22泳道對應(yīng)的植株為假陽性植株，其余株系的植株中帶hpt/hyg標(biāo)記基因的T-DNA均已經(jīng)插入并整合到受體基因組中，均為純合的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

3、選取步驟2鑒定正確的3個轉(zhuǎn)基因株系(命名為OF1、OE2、OE3)，采用qRT-PCR分析各株系T2代植株中OsSAPK7基因的表達(dá)量的變化，鑒定轉(zhuǎn)基因株系的過表達(dá)效率。

結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示：OsSAPK7轉(zhuǎn)基因株系0E1、OE2和OE3的植株中OsSAPK7基因的表達(dá)量相較于野生型9804水稻均顯著上調(diào)表達(dá)，其中轉(zhuǎn)基因株系OE2的植株中OsSAPK7基因的表達(dá)上調(diào)6.5倍。

4、待測植株為：OsSAPK7轉(zhuǎn)基因株系OE1的T2代植株、OE2的T2代植株、OE3的T2代植株、9804水稻、OE20假陽性植株。

取500mg待測植株的葉片，提取植物總蛋白，用標(biāo)簽抗體GFP進(jìn)行Western blot檢測。

檢測結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明：野生型9804水稻、陰性對照OE20假陽性植株中均未檢測到目的條帶，轉(zhuǎn)基因株系中均檢測到目的條帶，在總蛋白上樣量一致的前提下，轉(zhuǎn)基因株系OE2的植株中OsSAPK7的蛋白積累量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE3的植株中OsSAPK7的蛋白量，與qRT-PCR結(jié)果相一致。

三、轉(zhuǎn)空載水稻的獲得

采用表達(dá)載體pMDC43替代表達(dá)載體pH7GWIWG2(II)-OsSAPK7i按照實施例2步驟二的1-8進(jìn)行操作，得到轉(zhuǎn)空載體株系。

四、對照轉(zhuǎn)基因株系的獲得

采用序列表的序列4所示DNA分子代替步驟一、二中的序列表的序列1所示DNA分子，得到轉(zhuǎn)基因株系I(所述序列4編碼序列5所示的蛋白質(zhì)，序列5所示的蛋白質(zhì)為OsSAPK7蛋白同家族中同源性最高的蛋白)。

采用序列表的序列6所示DNA分子代替步驟一、二中的序列表的序列1所示DNA分子，得到轉(zhuǎn)基因株系II(所述序列6編碼序列7所示的蛋白質(zhì)，序列7所示的蛋白質(zhì)為OsSAPK7蛋白同源性最高的蛋白)。

五、白葉枯病抗性檢測

待測植株為：野生型9804水稻、步驟二得到的OsSAPK7轉(zhuǎn)基因株系OE1的T3代植株、OE2的T3代植株、OE3的T3代植株、步驟三得到的轉(zhuǎn)空載體株系的T3代植株、步驟四得到的轉(zhuǎn)基因株系I的T3代植株、轉(zhuǎn)基因株系II的T3代植株。

1、將待測植株的種子播于裝有淋過土壤殺菌劑的營養(yǎng)土壤的育秧盤中，在溫室中培養(yǎng)約25天后移栽至網(wǎng)室中進(jìn)行種植，單株種植，每個株系種植20株。

2、在步驟1水稻植株的分蘗盛期，用Xoo菌株ZHE173，采用剪葉法對水稻植株進(jìn)行人工接種，每株接種5張葉片(菌液濃度為1×10⁹cfu/mL)。

3、完成步驟2后繼續(xù)培養(yǎng)14天，14天后測量各植株葉片的病斑長度，每個葉片沿葉脈有一個病斑，每個植株測量3張接種葉片的病斑長度，計算平均值。

檢測結(jié)果如圖9所示。野生型9804水稻的病斑長度為15.7cm，轉(zhuǎn)空載體水稻的病斑長度與野生型9804水稻的病斑長度無顯著差異。OsSAPK7轉(zhuǎn)基因株系OE1的植株的病斑長度為11.3cm，略短于野生型9804水稻的病斑長度；OsSAPK7轉(zhuǎn)基因株系OE2和OE3的植株的病斑長度分別為8.7cm和9.7cm，均顯著短于野生型9804水稻的病斑長度。轉(zhuǎn)基因株系I植株的病斑長度與野生型9804水稻的病斑長度無顯著差異，轉(zhuǎn)基因株系II植株的病斑長度與野生型9804水稻的病斑長度無顯著差異。上述結(jié)果表明OsSAPK7基因過表達(dá)可以提高水稻對白葉枯病的抗性。