本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥用高分子聚合物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

腫瘤(癌癥)是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長的正常調(diào)控導(dǎo)致異常增生與分化而形成的。腫瘤一旦形成，不因病因消除而停止生長，他的生長不受機(jī)體正常生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常組織與器官，尤其是惡性腫瘤，與良性腫瘤相比，其生長速度快，呈浸潤性生長，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。

目前，在全球癌癥每年奪去700多萬人的生命，癌癥已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是繼心血管疾病的“第二號(hào)殺手”。目前已有的治療方法，主要分為手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療三種，效果最好的當(dāng)屬化學(xué)藥物療法。但是化療藥物療法同樣存在一些弊端，雖然其在腫瘤治療上具有良好的治療效果，但是臨床證明其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒副作用。況且，現(xiàn)有抗癌類化學(xué)藥物(例如紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等)大部分存在水溶性差、療效低、毒副作用大、腫瘤存在耐藥性等缺陷，因而對(duì)于化學(xué)藥物療法臨床上的廣泛應(yīng)用仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

針對(duì)上述化學(xué)藥物療法的不足和缺陷，為了滿足抗癌藥物在腫瘤細(xì)胞組織處能達(dá)到有效劑量，同時(shí)降低藥物對(duì)正常組織器官的毒副作用，藥物遞送體系應(yīng)運(yùn)而生，并得到越來越多的關(guān)注和研究，特別是最近幾十年，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，藥物遞送體系得到了更加深入和全面的研究，作為藥物載體的多功能型生物納米材料(有機(jī)或無機(jī)材料)層出不窮。藥物遞送載體可以有效的提高疏水性藥物的水溶性，延長藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，提高藥物在病灶區(qū)域的累積量，降低毒副作用與其他不良反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，從而達(dá)到提高藥物治療效果的目的。在眾多藥物遞送體系中，由兩親性高分子共聚物材料制備而成的藥物載體成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

所謂共聚物相較均聚物(一種單體聚合而成)而言是由兩種或兩種以上單體聚合所形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)中具有至少兩種以化學(xué)鍵連接的結(jié)構(gòu)單元，可以通過靈活調(diào)控結(jié)構(gòu)單元的種類和含量，從而實(shí)現(xiàn)了性能上的拓展和改進(jìn)。迄今，共聚物在化工、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。兩親性共聚物在水溶液中可自組裝形成具有特殊核/殼結(jié)構(gòu)的膠束體系，膠束內(nèi)核可通過疏水相互作用有效包載抗癌藥物，膠束外殼形成親水性的外層保護(hù)，有效防止藥物的降解(水解或酶解)，其粒徑大約在10～200nm之間，大小與人體內(nèi)多數(shù)大蛋白粒徑接近，因此可以有效避免體內(nèi)免疫系統(tǒng)的排斥。而且，通過多種化學(xué)反應(yīng)，可以對(duì)膠束載體進(jìn)行多功能化修飾，例如，在外部殼層接枝具有靶向作用的功能基團(tuán)(葉酸、寡糖、RGD等)，從而實(shí)現(xiàn)載藥遞送體系的主動(dòng)靶向功能，此外，可以通過調(diào)整兩親性共聚物結(jié)構(gòu)中的親疏水嵌段比例，優(yōu)化膠束核殼結(jié)構(gòu)，提高藥物遞送體系的穩(wěn)定性。膠束藥物遞送體系可有效提高藥物的水溶性，避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)及肝脾等組織的排除和吸收，提高藥物遞送體系體內(nèi)循環(huán)時(shí)間及在病灶部位的累積量，從而實(shí)現(xiàn)高效的藥物遞送和安全治療。但是，近期研究表明，親水性的外殼在給藥物遞送體系提供保護(hù)作用的同時(shí)，也抑制了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物體系的攝取作用(胞飲作用、吞噬作用等)，降低了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物量，從而弱化了藥物的療效。

綜上所述，需要開發(fā)一種理想的納米藥物載體，其制備提純簡(jiǎn)便，具有較高的藥物包載效率，良好的生物相容性，能有效的提高藥物的生物利用度，降低毒副作用，從而提高化學(xué)療法治療腫瘤的效果。

研究已經(jīng)表明，癌細(xì)胞由于較快的細(xì)胞分裂，導(dǎo)致無氧呼吸加劇，糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，而且，腫瘤過表達(dá)的碳酸酐酶能催化二氧化碳和水的反應(yīng)，形成碳酸，腫瘤微環(huán)境中所產(chǎn)生的這些酸性物質(zhì)使得癌細(xì)胞周圍環(huán)境pH值相對(duì)于體內(nèi)正常值(pH 7.4)偏低，大約在6.5-7.0之間，而細(xì)胞內(nèi)溶酶體和內(nèi)涵體的pH值更低，大約在5.0-6.5之間。腫瘤的酸性環(huán)境可以作為信號(hào)用于觸發(fā)載藥膠束的快速藥物釋放，促進(jìn)膠束細(xì)胞內(nèi)吞及其細(xì)胞器靶向等功能作用。pH響應(yīng)聚合物膠束作為一種極具發(fā)展前景的新型藥物輸送載體，具有諸多優(yōu)良的性能特點(diǎn)，如能實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的靶向給藥、增強(qiáng)生物利用度、降低對(duì)正常組織的毒副作用等。但是，近期研究表明，親水性的外殼在給藥物遞送體系提供保護(hù)作用的同時(shí)，也抑制了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物體系的攝取作用(胞飲作用、吞噬作用等)，降低了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物量，從而弱化了藥物的療效。綜上所述，需要開發(fā)一種理想的納米藥物載體，其制備提純工藝簡(jiǎn)便，具有較高的藥物包載效率，良好的生物相容性，較低的毒副作用，能精準(zhǔn)響應(yīng)微小pH變化，并在不同環(huán)境條件下維持較高的穩(wěn)定性，從而提高化學(xué)療法治療腫瘤的效果。

Wang等以2-丙酸-3-甲基馬來酸酐(CDM)為pH敏感小分子連接親水嵌段聚乙二醇單甲醚(Methoxypolyethylene glycols,MPEG)和9個(gè)精氨酸形成的寡肽(R₉)，末端修飾疏水嵌段聚乳酸(PCL)得到具有pH敏感性能的兩親性聚合物聚乙二醇單甲醚-b-寡肽-b-聚乳酸(PEG-Dlink_m-R₉-PCL)，其中Dlink_m在腫瘤細(xì)胞外環(huán)境弱酸(pH 6.5)條件下會(huì)發(fā)生斷裂，從而使MPEG逐漸脫除，所制備的兩親性聚合物可在水溶液中自組裝形成納米膠束體系，用作siRNA的遞送(Tumor Acidity-Sensitive Polymeric Vector for Active Targeted siRNA Delivery.J.Am.Chem.Soc.,2015,137(48),pp 15217–15224)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH 6.5的PBS緩沖溶液中，24h時(shí)PEG的累計(jì)脫除量接近60％，而在pH 7.4的條件下，24h時(shí)只有低于20％的PEG累計(jì)脫除量，通過生物實(shí)驗(yàn)證明，具有PEG脫除功能的siRNA遞送體系較無PEG脫除功能的siRNA遞送體系能有效抑制腫瘤的生長，提高小鼠的成活率和并延長其生存時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物。本發(fā)明的雙pH響應(yīng)的兩親性聚合物分子能在水溶液中自組裝為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米膠束，能有效包載水難溶性藥物，通過調(diào)整聚合物中不同嵌段的比例，可有效調(diào)節(jié)其pH響應(yīng)范圍，使膠束不但能迅速、精確響應(yīng)環(huán)境pH值的變化，而且能有效的緩解突釋，控制藥物釋放。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物，分子式為MPEG-Dliable-PAE-g-Chol，具有如下式I所示結(jié)構(gòu)：

其中，n＝25～100，x＝5～30。

優(yōu)選地，所述共聚物的數(shù)均分子量為7752～23178g/mol，優(yōu)選為10768～18043g/mol。

本發(fā)明提供的共聚物的結(jié)構(gòu)為：通過反應(yīng)修飾大分子單體聚乙二醇單甲醚(MPEG)，得到具有pH響應(yīng)性的親水大分子單體(MPEG-Dliable)；通過邁克爾加成反應(yīng)合成大分子單體聚-β氨基酯(PAE)，得到pH響應(yīng)的大分子單體；通過邁克爾加成反應(yīng)合成PAE兩端修飾MPEG-Dliable的共聚物；通過?；磻?yīng)，在PAE側(cè)鏈修飾疏水性的膽固醇，得到兩親性雙pH響應(yīng)共聚物。

本發(fā)明的目的之一還在于提供一種本發(fā)明所述雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物的制備方法，包括以下步驟：

通過酯化反應(yīng)采用對(duì)醛基苯甲酸修飾末端帶有羥基的聚乙二醇單甲醚(MPEG)，得到醛基封端的聚乙二醇單甲醚大分子單體，再通過親核加成反應(yīng)與1,3-丙二胺反應(yīng)，得到具有pH響應(yīng)性能(苯甲酰亞胺鍵)的親水性大分子單體(MPEG-Dliable)；

通過邁克爾加成反應(yīng)合成具有pH響應(yīng)性能的大分子單體聚-β氨基酯(PAE)，然后，同樣采用此反應(yīng)在PAE兩端修飾MPEG-Dliable單體，得到中間產(chǎn)物；

采用具有疏水性的膽固醇甲酰氯(Chol)與上述中間產(chǎn)物進(jìn)行醇解反應(yīng)制備聚乙二醇單甲醚-Dliable-聚-β氨基酯-g-膽固醇(MPEG-Dliable-PAE-g-Chol)。

作為優(yōu)選，所述方法包括如下步驟：

(1)制備pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable：

a)在惰性氣體保護(hù)和無水條件下，將催化劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)、單體MPEG、小分子單體對(duì)醛基苯甲酸(FA)溶于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選在攪拌下充分溶解，反應(yīng)，反應(yīng)后過濾、濃縮、沉淀、清洗、干燥，得到醛基封端的大分子單體MPEG-CHO；

b)將步驟a)所得MPEG-CHO溶解在無水有機(jī)溶劑中，加入二胺，優(yōu)選在攪拌的條件下充分溶解后反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、濃縮、沉淀、干燥，得到pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable；

(2)制備雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物：

a)采用本體聚合的方法，將1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)和3-氨基-1-丙醇(AP)在惰性氣體保護(hù)和無水條件下反應(yīng)，反應(yīng)后冷卻、沉淀、干燥，得到pH響應(yīng)性嵌段PAE；

b)將步驟(1)所得的MPEG-Dliable單體和上述的PAE溶于無水有機(jī)溶劑中，優(yōu)選在攪拌的條件下混合均勻，在惰性氣體保護(hù)和無水條件下反應(yīng)，反應(yīng)后冷卻、沉淀、干燥，得到雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG；

(3)制備雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物：將步驟(2)所制得的雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物溶于無水二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入已溶解于無水DMF的催化劑三乙胺(TEA)和DMAP，優(yōu)選充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，將膽固醇氯甲酸?Chol)的DMF溶液緩慢加入，惰性氣體保護(hù)保護(hù)下反應(yīng)，將反應(yīng)液例如通過離心或過濾除去副產(chǎn)物及雜質(zhì)，取上層清液透析，除去膽固醇等未反應(yīng)的原料，將產(chǎn)物冷凍干燥，得到雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物。

作為優(yōu)選，步驟(1)的a)中反應(yīng)物的摩爾份數(shù)如下：

優(yōu)選地，所述無水有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿或無水二甲基亞砜中1種或2種以上的組合，優(yōu)選為無水二氯甲烷(DCM)。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)的時(shí)間為6～36h，優(yōu)選為24h。

作為優(yōu)選，步驟(1)的b)中反應(yīng)物的摩爾份數(shù)如下：

MPEG-CHO 0.8～1.3份

二胺 1～2.6份。

優(yōu)選地，所述無水有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿或無水二甲基亞砜中1種或2種以上的組合，優(yōu)選為無水二甲基亞砜(DMSO)。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為30～60℃，反應(yīng)的時(shí)間為0.5～6h，優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為40℃，反應(yīng)的時(shí)間為4h；

優(yōu)選地，所述二胺為1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺，優(yōu)選為1,3-丙二胺。

作為優(yōu)選，步驟(1)中所述過濾為采用漏斗，優(yōu)選布式漏斗過濾收集液體。

優(yōu)選地，所述沉淀為向濃縮后的溶液中加入10倍體積的0℃異丙醇進(jìn)行沉淀。

優(yōu)選地，所述洗滌為采用異丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固體。

作為優(yōu)選，步驟(2)的a)中反應(yīng)物的摩爾份數(shù)如下：

1,6-己二醇二丙烯酸酯 1～1.1份

3-氨基-1-丙醇 0.9～1份。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為80-120℃，優(yōu)選為100℃；反應(yīng)的時(shí)間為12-48h，優(yōu)選為24h。

作為優(yōu)選，步驟(2)的b)中反應(yīng)物的摩爾份數(shù)如下：

PAE 1～1.1份

MPEG-Dliable 0.9～1份。

優(yōu)選地，所述無水有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿或無水二甲基亞砜中1種或2種以上的組合，優(yōu)選為無水二甲基亞砜(DMSO)。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為40-80℃，優(yōu)選為60℃，反應(yīng)的時(shí)間為12～48h，優(yōu)選為24h。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述沉淀為向冷卻后的溶液中加入10倍體積的0℃正己烷進(jìn)行沉淀。

作為優(yōu)選，步驟(3)反應(yīng)物的摩爾份數(shù)配方如下：

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)的時(shí)間為12～48h，優(yōu)選為24h。

步驟(3)所述的離心是除去不可溶的三乙胺鹽酸鹽等雜質(zhì)，離心條件優(yōu)選為轉(zhuǎn)速14000rpm、時(shí)間2min。步驟(3)所述的透析指將離心所得的上清液置于透析袋中，在介質(zhì)DMF中透析48h，繼而將介質(zhì)換成去離子水，繼續(xù)透析48h。

所述的MPEG和Chol其結(jié)構(gòu)式分別如下：

本發(fā)明的目的之一還在于提供本發(fā)明所述的雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物在裝載水難溶性藥物膠束系統(tǒng)中的用途。

優(yōu)選地，所述裝載水難溶性藥物膠束系統(tǒng)由以下方法制備得到：將水難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑中，同時(shí)將雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物溶于同一種有機(jī)溶劑中，待聚合物完全溶解后，將此聚合物溶液與水難溶性藥物溶液混合；透析；過濾、冷凍干燥，得到裝載水難溶性藥物膠束系統(tǒng)。

優(yōu)選地，所述水難溶性藥物指在1L水中溶解度小于或等于1g的藥物。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜和/或二甲基甲酰胺。

優(yōu)選地，將水難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑中過夜。

優(yōu)選地，共聚物溶液與水難溶性藥物溶液混合后室溫下攪拌，優(yōu)選攪拌1h以上，更優(yōu)選攪拌4～6h。

優(yōu)選地，所述透析采用去離子水進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述透析的時(shí)間為12h以上，優(yōu)選為24h。

所述的裝載水難溶性藥物膠束系統(tǒng)可控制裝載的藥物在正常組織(pH 7.4)處緩慢釋放，且長時(shí)間累計(jì)釋放量較低，在腫瘤細(xì)胞外弱酸性環(huán)境(pH 6.5～7.0)下，親水性的外殼逐漸脫除，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)弱酸性條件(pH 5.0～6.5)處實(shí)現(xiàn)快速可控釋放，且藥物累計(jì)釋放量較大。

本發(fā)明的機(jī)理為：

膠束外層親水性的MPEG具有無毒、無免疫原性和無抗原性等優(yōu)點(diǎn)，在增加膠束穩(wěn)定性的同時(shí)，延長膠束在血液中的循環(huán)時(shí)間；疏水膽固醇內(nèi)核能夠增強(qiáng)對(duì)難溶藥物的包載性能；中間層的PAE在pH 7.4時(shí)表現(xiàn)為疏水性，可與膽固醇共同組成膠束的疏水內(nèi)核，這不僅可以防止藥物突釋，同時(shí)可以增強(qiáng)膠束內(nèi)核的穩(wěn)定性；在腫瘤組織處(pH 6.5～7.0)，連接外層MPEG與中間層PAE的苯甲酰亞胺鍵逐步斷裂，使得親水外殼MPEG逐步脫除，促進(jìn)藥物遞送體系通過細(xì)胞內(nèi)吞等作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使得細(xì)胞攝取量增大；在腫瘤細(xì)胞內(nèi)弱酸性(pH 5.0～6.5)條件下，PAE嵌段中的叔胺基發(fā)生質(zhì)子化作用而表現(xiàn)為親水性，膠束開始出現(xiàn)一定程度的溶脹；載藥膠束若進(jìn)入具有更低pH的內(nèi)涵體和溶酶體中，PAE將完全質(zhì)子化，此時(shí)膠束溶脹程度變大，膠束開始出現(xiàn)聚集甚至解離行為，通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”將所包載的藥物釋放到腫瘤細(xì)胞中。通過調(diào)節(jié)聚合物中各嵌段的比例，可以調(diào)控藥物的釋放速率，滿足不同藥物的釋放要求。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明的聚合物分子能在水溶液中自組裝為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米膠束，能有效包載水難溶性藥物，通過調(diào)整聚合物中不同嵌段的比例，可有效調(diào)節(jié)其pH響應(yīng)范圍，使膠束不但能迅速、精確響應(yīng)環(huán)境pH值的變化，而且能有效的緩解突釋，控制藥物釋放。

(2)本發(fā)明的雙pH響應(yīng)的兩親性聚合物分子，能精確響應(yīng)體內(nèi)循環(huán)過程中環(huán)境pH值的變化，在維持藥物遞送體系結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、增大藥物遞送體系在病灶部位的累積量的同時(shí)，也能有效的提高細(xì)胞攝取量，增大藥物的生物利用度，優(yōu)化腫瘤的治療效果。

(3)經(jīng)疏水膽固醇修飾后的共聚物對(duì)水難溶性藥物的包載能力增強(qiáng)，包載效率提高。

(4)本發(fā)明制備得到的雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物，易于調(diào)控各嵌段的比例，應(yīng)用于制備裝載水難溶性藥物膠束系統(tǒng)，可滿足不同藥物的釋放要求。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中MPEG-CHO和MPEG-Dliable的¹H-NMR圖，溶劑為d-CDCl₃；

圖2其中(A)為實(shí)施例1中MPEG-CHO的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜；(B)為實(shí)施例1中MPEG-Dliable的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜；

圖3為實(shí)施例1中PAE的GPC洗脫曲線；

圖4為實(shí)施例1中PAE的¹H-NMR圖，溶劑為d-CDCl₃；

圖5其中(A)為實(shí)施例1中PAE的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜；(B)為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜；

圖6為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的GPC洗脫曲線；

圖7為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的¹H-NMR圖，溶劑為d-CDCl₃；

圖8為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的GPC洗脫曲線；

圖9為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的¹H-NMR圖，溶劑為d-CDCl₃；

圖10為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜；

圖11為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH值條件下的臨界膠束濃度測(cè)試曲線；

圖12為實(shí)施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的pK_b值的測(cè)試曲線；

圖13其中(A)和(B)分別為實(shí)施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol自組裝膠束的粒徑、zeta電位與pH的關(guān)系；

圖14為實(shí)施例1中MPEG和MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在弱酸性條件下孵育不同時(shí)間后的GPC洗脫曲線；

圖15為實(shí)施例6中載阿霉素膠束的體外釋放曲線；

圖16其中(A)為實(shí)施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白膠束對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的毒性曲線圖；(B)為實(shí)施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol載藥膠束以及有利阿霉素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用24h后的毒性曲線圖；(C)為實(shí)施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol載藥膠束以及有利阿霉素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用48h后的毒性曲線圖。

具體實(shí)施方式

為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅用于幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制備

(1)制備pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable：在50mL三口圓底燒瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，在一個(gè)側(cè)口中接入氮?dú)猓硗庖粋€(gè)側(cè)口出氣，在惰性氣體保護(hù)和無水條件下，依次將溶劑DCM(15mL)、催化劑DCC(41mg，0.2mmol)、DMAP(6.1mg，0.05mmol)、單體MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子單體FA(45mg，0.3mmol)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，室溫條件下反應(yīng)24h后，將反應(yīng)液過濾除去其中沉淀，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷異丙醇中，置于冰箱中靜止2h，收集沉淀，用異丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固體，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子單體MPEG-CHO。合成反應(yīng)式見公式(1)，利用核磁與紅外進(jìn)行檢測(cè)，見圖1中(A)和圖2中(A)，產(chǎn)率為95％；于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器將MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(1.04mL，0.0125mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，在40℃下反應(yīng)4h，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷卻至室溫，將其緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable。合成反應(yīng)式見公式(1)，利用核磁和紅外分析，見圖1中(B)和圖2中(B)，產(chǎn)率為95％。

(2)制備雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物：于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，依次用注射器將HDD(24.6mL，110mmol)和AP(7.61mL，100mmol)加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，100℃，反應(yīng)24h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)性嵌段PAE，合成反應(yīng)式見公式(2)，利用GPC測(cè)定其分子量，見圖3，利用核磁和紅外分析，見圖4和圖5(A)，產(chǎn)率為90％，Mn＝3300，Mw/Mn＝1.28；將步驟(1)所制得的單體MPEG-Dliable(41.98mg，0.01mmol)加入50mL單口反應(yīng)瓶中，密封后冷凍-抽真空-通氮?dú)馊危瑢误wPAE(33mg，0.011mmol)加入無水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，60℃，反應(yīng)24h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG。合成反應(yīng)式見公式(2)，利用GPC測(cè)定其分子量，見圖6，并進(jìn)行核磁和紅外分析，見圖7和圖5(B)。產(chǎn)率為85％，Mn＝12089，Mw/Mn＝1.36。

(3)制備雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通單氣-抽真空三次，排除其中氧氣。用注射器將步驟(2)所制得的雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物(2.217g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反應(yīng)瓶中，加入催化劑TEA(0.42mL，3mmol)和DMAP(61mg，0.5mmol)，攪拌1h使其中分混合均勻。將膽固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器緩慢滴加到反應(yīng)瓶中。在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，除去副產(chǎn)物與未反應(yīng)的原料，取上層清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，換液4次，除去膽固醇等雜質(zhì)，繼而將透析液換成去離子水，繼續(xù)透析48h，換液8次，除去有機(jī)溶劑和水溶性雜質(zhì)，然后收集透析后的溶液，冷凍干燥，得到雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物。合成反應(yīng)式見公式(3)，利用GPC測(cè)定其分子量，見圖8，并進(jìn)行核磁和紅外分析，見圖9和圖10。產(chǎn)率為87％，Mn＝14986，Mw/Mn＝1.44。

實(shí)施例2：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制備

(1)制備pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable：在50mL三口圓底燒瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，在一個(gè)側(cè)口中接入氮?dú)猓硗庖粋€(gè)側(cè)口出氣，在惰性氣體保護(hù)和無水條件下，依次將溶劑DCM(15mL)、催化劑DCC(51.25mg，0.25mmol)、DMAP(12.2mg，0.1mmol)、單體MPEG(40mg，0.01mmol)、小分子單體FA(75mg，0.5mmol)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，室溫條件下反應(yīng)24h后，將反應(yīng)液過濾除去其中沉淀，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷異丙醇中，置于冰箱中靜止2h，收集沉淀，用異丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固體，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子單體MPEG-CHO，產(chǎn)率為90％；于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器將MPEG-CHO(53.716mg，0.013mmol)和DAP(0.83mL，0.01mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，在40℃下反應(yīng)4h，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷卻至室溫，將其緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable，產(chǎn)率為90％。

(2)制備雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物：于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，依次用注射器將HDD(24.6mL，110mmol)和AP(8.371mL，110mmol)加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，100℃，反應(yīng)24h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)性嵌段PAE，產(chǎn)率為88％，Mn＝1091，Mw/Mn＝1.30；將步驟(1)所制得的單體MPEG-Dliable(41.98mg，0.01mmol)加入50mL單口反應(yīng)瓶中，密封后冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，將單體PAE(10.91mg，0.01mmol)加入無水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，60℃，反應(yīng)24h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，產(chǎn)率為85％，Mn＝9870，Mw/Mn＝1.44。

(3)制備雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通單氣-抽真空三次，排除其中氧氣。用注射器將步驟(2)所制得的雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物(1.974g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反應(yīng)瓶中，加入催化劑TEA(0.14mL，1mmol)和DMAP(122mg，1.0mmol)，攪拌1h使其中分混合均勻。將膽固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器緩慢滴加到反應(yīng)瓶中。在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，除去副產(chǎn)物與未反應(yīng)的原料，取上層清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，換液4次，除去膽固醇等雜質(zhì)，繼而將透析液換成去離子水，繼續(xù)透析48h，換液8次，除去有機(jī)溶劑和水溶性雜質(zhì)，然后收集透析后的溶液，冷凍干燥，得到雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物，產(chǎn)率為87％，Mn＝10768，Mw/Mn＝1.51。

實(shí)施例3：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制備

(1)制備pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable：在50mL三口圓底燒瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，在一個(gè)側(cè)口中接入氮?dú)?，另外一個(gè)側(cè)口出氣，在惰性氣體保護(hù)和無水條件下，依次將溶劑DCM(15mL)、催化劑DCC(10.25mg，0.05mmol)、DMAP(18mg，0.15mmol)、單體MPEG(200mg，0.05mmol)、小分子單體FA(112.5mg，0.75mmol)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，室溫條件下反應(yīng)24h后，將反應(yīng)液過濾除去其中沉淀，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷異丙醇中，置于冰箱中靜止2h，收集沉淀，用異丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固體，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子單體MPEG-CHO，產(chǎn)率為93％；于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器將MPEG-CHO(53.716mg，0.013mmol)和DAP(2.158mL，0.026mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，在40℃下反應(yīng)4h，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷卻至室溫，將其緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable，產(chǎn)率為93％。

(2)制備雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物：于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，依次用注射器將HDD(24.6mL，110mmol)和AP(6.849mL，90mmol)加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，100℃，反應(yīng)24h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)性嵌段PAE，產(chǎn)率為90％，Mn＝3126，Mw/Mn＝1.45；將步驟(1)所制得的單體MPEG-Dliable(37.782mg，0.009mmol)加入50mL單口反應(yīng)瓶中，密封后冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，將單體PAE(31.26mg，0.01mmol)加入無水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，60℃，反應(yīng)24h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，產(chǎn)率為89％，Mn＝11965，Mw/Mn＝1.52。

(3)制備雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通單氣-抽真空三次，排除其中氧氣。用注射器將步驟(2)所制得的雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物(2.393g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反應(yīng)瓶中，加入催化劑TEA(0.28mL，2.0mmol)和DMAP(24.4mg，0.2mmol)，攪拌1h使其中分混合均勻。將膽固醇(0.45g，1.0mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器緩慢滴加到反應(yīng)瓶中。在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，除去副產(chǎn)物與未反應(yīng)的原料，取上層清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，換液4次，除去膽固醇等雜質(zhì)，繼而將透析液換成去離子水，繼續(xù)透析48h，換液8次，除去有機(jī)溶劑和水溶性雜質(zhì)，然后收集透析后的溶液，冷凍干燥，得到雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物，產(chǎn)率為82％，Mn＝13685，Mw/Mn＝1.48。

實(shí)施例4：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制備

(1)制備pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable：在50mL三口圓底燒瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，在一個(gè)側(cè)口中接入氮?dú)?，另外一個(gè)側(cè)口出氣，在惰性氣體保護(hù)和無水條件下，依次將溶劑DCM(15mL)、催化劑DCC(32.8mg，0.25mmol)、DMAP(18mg，0.15mmol)、單體MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子單體FA(22.5mg，0.15mmol)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，室溫條件下反應(yīng)24h后，將反應(yīng)液過濾除去其中沉淀，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷異丙醇中，置于冰箱中靜止2h，收集沉淀，用異丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固體，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子單體MPEG-CHO，產(chǎn)率為94％；于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器將MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(2.7mL，0.0325mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在攪拌的條件下充分溶解，在40℃下反應(yīng)4h，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷卻至室溫，將其緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)的親水性大分子單體MPEG-Dliable，產(chǎn)率為91％。

(2)制備雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物：于50mL干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，依次用注射器將HDD(22.36mL，100mmol)和AP(6.849mL，90mmol)加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，100℃，反應(yīng)24h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH響應(yīng)性嵌段PAE，產(chǎn)率為97％，Mn＝4524，Mw/Mn＝1.55；將步驟(1)所制得的單體MPEG-Dliable(37.782mg，0.009mmol)加入50mL單口反應(yīng)瓶中，密封后冷凍-抽真空-通氮?dú)馊?，將單體PAE(38.76mg，0.011mmol)加入無水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反應(yīng)瓶中，在攪拌的條件下，60℃，反應(yīng)24h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，產(chǎn)率為87％，Mn＝13553，Mw/Mn＝1.60。

(3)制備雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中裝入攪拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通單氣-抽真空三次，排除其中氧氣。用注射器將步驟(2)所制得的雙pH響應(yīng)共聚物的中間產(chǎn)物(2.71mg，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反應(yīng)瓶中，加入催化劑TEA(0.42mL，3mmol)和DMAP(122mg，1.0mmol)，攪拌1h使其中分混合均勻。將膽固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器緩慢滴加到反應(yīng)瓶中。在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，除去副產(chǎn)物與未反應(yīng)的原料，取上層清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，換液4次，除去膽固醇等雜質(zhì)，繼而將透析液換成去離子水，繼續(xù)透析48h，換液8次，除去有機(jī)溶劑和水溶性雜質(zhì)，然后收集透析后的溶液，冷凍干燥，得到雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物，產(chǎn)率為81％，Mn＝18043，Mw/Mn＝1.43。

實(shí)施例5：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物的臨界膠束濃度CMC值

利用熒光探針法測(cè)試實(shí)施例1制備得到的雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH條件下的臨界膠束濃度。

(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘(Sigma-Aldrich)，配置濃度為12×10^-5M的芘溶液。

(2)樣品溶液的配置：稱取5mg MPEG-Dliable-PAE-g-Chol溶于10mL丙酮中，快速將溶液加入到50mL不同pH(7.4、6.0、5.0)的PBS緩沖溶液中，攪拌24h以揮發(fā)掉丙酮，得到濃度為0.1mg/mL的聚合物母液，稀釋成一系列濃度(濃度范圍為0.0001～0.1mg/mL)。取20支10mL容量瓶，分別加入0.1mL步驟(1)配置的芘溶液，然后分別加入上述不同濃度的共聚物溶液定容，搖勻，得到樣品溶液。樣品溶液中芘的濃度為12×10^-7M。

(3)熒光光譜測(cè)試：以373nm為發(fā)射波長，在300～350nm掃描樣品溶液的熒光激發(fā)光譜。取波長為338nm和334nm的強(qiáng)度比值(I₃₃₈/I₃₃₄)對(duì)聚合物濃度對(duì)數(shù)作圖，如圖11所示，曲線突變點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為lg(CMC)。測(cè)得實(shí)施例1制備得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH(7.4、6.0、5.0)值的PBS緩沖液中的臨界膠束濃度分別為7.3mg/L、14.7mg/L和20.5mg/L。

實(shí)施例6：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物載藥和空白膠束的制備

采用透析法制備載阿霉素(DOX)的聚合物膠束，具體方法如下：稱取10mg DOX·HCl溶于20mL DMSO中，加入2倍摩爾當(dāng)量的TEA，攪拌過夜得到DOX堿。取40mg實(shí)施例1制備得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol溶于20mL DMSO中，待聚合物完全溶解后，將聚合物溶液加入到之前已制備好的DOX溶液中，繼續(xù)攪拌6h后，轉(zhuǎn)入透析袋進(jìn)行透析，每2h更換一次去離子水，12h后每6h更換一次，共透析24h。透析完成后，將透析液用0.45μm過濾膜進(jìn)行過濾，過濾液冷凍干燥后，得到紅色粉末狀固體即為DOX載藥膠束。

空白膠束的制備方法與此相同。

采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)定空白膠束和載藥膠束的粒徑、分布和zeta電位?？瞻啄z束的粒徑D_h為155.6nm，PDI為0.29，zeta電位為21.1mV。載藥膠束的粒徑D_h為178.5nm，PDI為0.31，zeta電位為19.7mV。

實(shí)施例7：雙pH響應(yīng)的兩親性共聚物的pH響應(yīng)行為研究

取20mg實(shí)施例6制備的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白膠束溶于pH 6.5的PBS緩沖溶液中，置于恒溫振蕩儀中，孵育12h，冷凍干燥，得到固體粉末。分別取5mg所制備的固體粉末、實(shí)施例6制備的聚合物空白膠束、MPEG單體溶于1mL的DMF中，采用凝膠滲透色譜(GPC)檢測(cè)其分子量分布，如圖12所示。由圖可知，在弱酸性條件下(pH 6.5)，聚合物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要是由于連接MPEG和PAE嵌段的苯甲酰亞胺鍵發(fā)生斷裂，使得MPEG鏈段逐漸脫除。

分別取20mg實(shí)施例6中制備的聚合物空白膠束溶于pH 9.2、8.1、7.4、7.0、6.8、6.5、6.0、5.5和5.0的PBS緩沖溶液中，采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)定空白膠束在不同pH值條件下的粒徑、分布和zeta電位，如圖13所示。由圖可知，隨著pH值的降低(9.2～7.4)，聚合物膠束粒徑和zeta電位變化較小，顆粒體系較為穩(wěn)定，隨著pH的繼續(xù)降低(7.4～5.0)，膠束大小和zeta電位快速增大，主要是由于pH敏感嵌段PAE的質(zhì)子化作用，使其由疏水性嵌段逐漸變?yōu)橛H水性嵌段，膠束顆粒溶脹，粒徑和zeta電位增大。

采用電位滴定法確定實(shí)施例1聚合物中PAE嵌段的pK_b值，具體步驟如下：50mg實(shí)施例1制備的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol充分溶解于20mL丙酮中，在快速攪拌下快速加入到50mL去離子水中，室溫下攪拌24h以揮發(fā)掉丙酮，得到最終濃度為1mg/mL的聚合物膠束溶液。用NaOH或HCl溶液(0.1M)調(diào)節(jié)膠束溶液的pH值，攪拌平衡一段時(shí)間至pH穩(wěn)定，讀取各pH值，如圖14所示。

實(shí)施例8：載藥膠束的體外釋放

分別稱取5mg實(shí)施例6中制備的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol載藥膠束分散于5mL PBS緩沖液中，緩沖液pH值分別為7.4、6.8、6.5、6.0和5.0。將上述溶液置于透析袋中，轉(zhuǎn)入40mL相同pH值的緩沖液中，置于藥物溶出儀，在37℃，110rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行體外釋放。定時(shí)取樣4mL進(jìn)行紫外分析，并同時(shí)補(bǔ)加4mL新鮮緩沖液。用紫外分光光度法測(cè)定不同時(shí)間釋放液中DOX濃度，繪制體外釋放曲線，如圖15所示。

由圖15可知，載藥膠束在正常組織環(huán)境(pH 7.4)下，DOX的釋放速率非常慢，24h的累積釋放量不超過30％，隨后的釋放速率基本趨于平穩(wěn)，160h累計(jì)釋放量低于40％。而在腫瘤組織的微酸性(pH 6.5)條件下，DOX的釋放速率加快，24h的累積釋放量達(dá)到50％以上，160h累計(jì)釋放量超過60％。隨著pH值的繼續(xù)降低(5.0)，DOX的釋放速率明顯加快，24h的累積釋放量接近70％，160h累計(jì)釋放量接近90％。說明隨著pH值的降低，藥物從載藥膠束中釋放的速率和累計(jì)釋放量明顯加快。

實(shí)施例9

利用實(shí)施例6制備得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白膠束和載藥膠束進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。將MDA-MB-231細(xì)胞(購買于ATCC)按1×104的密度平鋪在96孔板上，加入200μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。將一定濃度的游離阿霉素(DOX)，空白膠束和載藥膠束添加進(jìn)入孔板中，更新培養(yǎng)介質(zhì)。每個(gè)濃度平行重復(fù)3個(gè)。將孔板放入卵化器中，5％CO2和37℃，分別維持24h和48h。用180μL新鮮培養(yǎng)液和20μL MTT溶液替換孔板中介質(zhì)，繼續(xù)卵化4h，用200μL DMSO替換孔板介質(zhì)。將孔板放在37℃搖床中振蕩15min，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm出每個(gè)孔的吸光度A，計(jì)算細(xì)胞存活率，評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性。

圖16中(A)是空白MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的細(xì)胞毒性圖。由圖可知，隨著聚合物濃度的增大，細(xì)胞存活率仍維持在較高水平，當(dāng)聚合物濃度為200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍在97％以上，可見次雙pH響應(yīng)兩親性共聚物材料對(duì)細(xì)胞的毒性較低，說明材料本身幾乎不具有毒副作用。圖16(B和C)分別是游離阿霉素和聚合物載藥膠束在24h和48h后的細(xì)胞毒性圖。由圖可知，隨著時(shí)間和載藥膠束濃度的增大，細(xì)胞成活率均呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)，特別是在48h、載藥膠束濃度為20μg/mL時(shí)，細(xì)胞的成活率接近50％。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。