技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA及其應(yīng)用和抑制plk1基因表達的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種抑制plk1基因表達的siRNA和應(yīng)用，以及利用siRNA抑制plk1基因表達的方法。
背景技術(shù)：
：Polo樣激酶1(polo-likekinase-1，plk1)是一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶。人plk1基因定位于染色體的16p12位點，編碼的mRNA長約2.3kb、蛋白質(zhì)分子量約為67kd。plk1蛋白在其N端有一個高度保守的催化區(qū)域，在其C端通常具有3個被稱作為Polo盒(polobox)的保守區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，plk1有誘導(dǎo)DNA合成、DNA完整性的檢修以及防止細胞凋亡方面的作用。plk1還能通過磷酸化p53而抑制其轉(zhuǎn)活性，進而抑制p53發(fā)揮檢驗點(check-point)蛋白和誘導(dǎo)細胞凋亡的功能。p53是G1期主要的調(diào)控蛋白，plk1對抑癌基因p53的抑制作用誘導(dǎo)持續(xù)的、甚至是永久性的G1期阻滯。另外，plk1與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，plk1基因的表達被抑制之后，會抑制細胞的增殖、促進細胞的凋亡，進而抑制腫瘤生長。plk1還可以通過抑制MAVS調(diào)節(jié)干擾素IFN的誘導(dǎo)生成，破壞先天性免疫。plk1在包括乳腺癌、肝癌、肺癌和結(jié)腸癌的大多數(shù)人類腫瘤組織中均有高表達。plk1的高表達和腫瘤患者的生存率之間具有統(tǒng)計相關(guān)性，腫瘤組織中plk1的表達水平還與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。這說明plk1在腫瘤的生成和發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用，并且是一個潛在的抗腫瘤藥物作用靶點。研究進展還表明，阻斷plk1的表達或抑制其激酶活性可以有效抑制腫瘤細胞增殖并介導(dǎo)其凋亡，但對正常細胞沒有明顯影響。目前處于臨床前或臨床試驗階段的多種plk1抑制劑都表現(xiàn)出了高藥性、低毒性的特點。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療并列成為乳腺癌的四大臨床處置手段。對于大多數(shù)乳腺癌患者來說，在初診確定時癌細胞就有可能已遷移至其他組織，而化療作為重要的全身性干預(yù)手段在乳腺癌治療中占有極其重要的地位。目前主要的化療手段是小分子藥物和大分子靶向藥物，但藥效和隨之產(chǎn)生的耐藥性是乳腺癌治療中常用的小分子藥物面臨的主要問題，而適用人群范圍窄則是大分子靶向藥物的面臨的主要問題。因此，可抑制癌基因表達的小干擾核酸作為替代型藥物有望解決小分子藥物和靶向抗體藥物不能解決的問題。從抗腫瘤藥物提高治療有效性、耐藥性、降低毒副作用等幾個方面講，作為與目前臨床使用的主流藥物的作用機制完全不同的新興藥物分子，開發(fā)有效的siRNA藥物已成為目前臨床實際應(yīng)用的迫切要求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供用于抑制plk1基因表達的siRNA、含有所述siRNA作為藥物活性成分的藥物組合物、利用所述siRNA或藥物組合物抑制plk1基因表達的方法，以及所述siRNA或藥物組合物在治療和/或預(yù)防癌癥疾病中的應(yīng)用。即，本發(fā)明通過提供以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的。一方面，本發(fā)明提供一種具有雙鏈結(jié)構(gòu)的siRNA，所述雙鏈結(jié)構(gòu)由完全互補的第一單鏈和第二單鏈組成，其中，所述第一單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶位點序列相同且由SEQIDNOs:2-133表示的核苷酸序列，與所述第一單鏈互補的所述第二單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶位點序列互補且由SEQIDNOs:134-265表示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述第一單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶作用位點序列相同且由SEQIDNOs:4、17、38、42、55、65、66、68、77、93、103、104、109或129表示的核苷酸序列，與所述第一單鏈互補的所述第二單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶作用位點序列互補且由SEQIDNOs:136、149、170、174、187、197、198、200、209、225、235、236、241或261表示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方式，所述第一單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶作用位點序列相同且由SEQIDNOs:66、68或77表示的核苷酸序列，與所述第一單鏈互補的所述第二單鏈具有與由SEQIDNO:1表示的plk1mRNA序列中的靶作用位點序列互補且由SEQIDNOs:198、200或209表示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，所述第一單鏈和所述第二單鏈中至少一條單鏈的3′末端可以連接1至3個核苷酸，從而在所述第一單鏈和所述第二單鏈互補形成所述雙鏈結(jié)構(gòu)后，在所述雙鏈結(jié)構(gòu)的至少一個末端形成由所述1至3個核苷酸構(gòu)成的3′突出端。其中，優(yōu)選所述3′突出端為由連續(xù)的兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT或連續(xù)的兩個尿嘧啶核苷酸UU構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，所述第一單鏈和所述第二單鏈中分別包含至少一個被修飾的核苷酸基團。其中，所述被修飾的核苷酸基團為磷酸基團、核糖基團或堿基中的至少一種被修飾的核苷酸基團。優(yōu)選所述被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2′-羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中含有所述抑制plk1基因表達的siRNA作為藥物活性成分，以及還含有陽離子組分、非陽離子組分和藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明中的一種實施方式，所述陽離子組分選自N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨、聚乙烯亞胺、聚β-氨基酯和殼聚糖季銨鹽中的至少一種，所述非陽離子組分選自聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)三嵌段共聚物中的至少一種，所述藥學(xué)上可接受的載體選自pH值為4.0-9.0的磷酸鹽緩沖液、pH值為7.5-8.5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩沖液、生理鹽水或質(zhì)量百分比濃度為7-15％的蔗糖溶液。另一方面，本發(fā)明提供一種抑制哺乳動物細胞內(nèi)plk1基因表達的方法，該方法包括向哺乳動物細胞內(nèi)導(dǎo)入如上所述的siRNA的處置，從而使所述siRNA能夠序列特異性地誘導(dǎo)所述plk1基因表達的抑制。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述處置是將所述siRNA直接地進行導(dǎo)入，或以如上所述的含有siRNA的藥物組合物的形式進行導(dǎo)入。另一方面，本發(fā)明提供如上所述的siRNA、及藥物組合物在制備治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。其中，所述腫瘤為plk1基因異常高表達的乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或結(jié)腸癌。本發(fā)明提供的siRNA能夠序列特異性地介導(dǎo)plk1基因表達的抑制，并具有很好的血清穩(wěn)定性。通過將本發(fā)明的siRNA導(dǎo)入至腫瘤細胞內(nèi)，可以有效地抑制內(nèi)源性plk1基因的表達，從而抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡。附圖說明圖1示出實施例2的siRNA抑制plk1mRNA表達水平的檢測結(jié)果。圖2示出實施例3的化學(xué)修飾前后的siRNA的血清穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。圖3示出實施例4的化學(xué)修飾前后的siRNA抑制plk1mRNA表達水平的檢測結(jié)果。圖4為實施例6的通過尾靜脈注射方式系統(tǒng)給藥含plk1siRNA的藥物組合物時對乳腺癌細胞生長的抑制效果圖。圖5為實施例7的通過尾靜脈注射方式系統(tǒng)給藥含plk1siRNA的藥物組合物時對宮頸癌細胞生長的抑制效果圖。具體實施方式對于本說明書中使用的術(shù)語，其定義如下。術(shù)語“polo樣激酶1”、“plk1”或“plk1激酶”意指一種含激酶區(qū)域(kinasedomain)及polo盒區(qū)域(polo-boxdomain)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。關(guān)于plk1激酶的性質(zhì)與功能，詳細描述可參見Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004,5:429-?，F(xiàn)已知plk1激酶的活性及細胞內(nèi)表達水平對于細胞有絲分裂具有關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明中所使用的plk1mRNA序列為Genebank注冊號為NM_005030.3的序列(SEQIDNO:1)。術(shù)語“mRNA(messengerRNA,信使RNA)”意指作為體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的模板將基因的編碼信息由DNA傳導(dǎo)至蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA分子。術(shù)語“RNA干擾(RNAinterference)”或“RNAi”指一種存在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控現(xiàn)象，該現(xiàn)象由單鏈或雙鏈RNA介導(dǎo)的靶mRNA特異性降解而引起。關(guān)于RNAi調(diào)控機制的細節(jié)可參見Biotech.Adv.2008,26(3):202-等文獻的描述。本發(fā)明中，如無特殊說明，術(shù)語“小干擾RNA(smallinterference/small-interferingRNA)”、或“siRNA”意指能夠序列特異性地誘導(dǎo)RNAi現(xiàn)象、且由兩條長度為15-27個核苷酸的單鏈RNA組成、及具有部分或完全互補的雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA分子。本發(fā)明所涉及的siRNA中，互補雙鏈結(jié)構(gòu)的長度可以為17-25個、18-22個、或19-21個堿基對。本發(fā)明所涉及的siRNA可以是由兩條長度為15-27個核苷酸的單鏈RNA組成的平末端的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，或也可以是在雙鏈結(jié)構(gòu)的至少一個末端具有由1-3個連續(xù)的核苷酸組成的3`突出端的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，作為所述3`突出端，優(yōu)選由兩個連續(xù)的脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT、或由兩個連續(xù)的尿嘧啶核苷酸UU組成。本發(fā)明中，如無特殊說明，術(shù)語“第一單鏈”、或“正義鏈”是指siRNA兩條單鏈中的一條單鏈，該單鏈具有與靶mRNA中的該siRNA作用位點核苷酸序列部分或完全相同的核苷酸序列；術(shù)語“第二單鏈”、或“反義鏈”則指在siRNA兩條單鏈中的另一條單鏈，該單鏈具有與靶mRNA中的該siRNA作用位點核苷酸序列部分或完全互補的核苷酸序列。本發(fā)明中提到siRNA的第一單鏈(或正義鏈)可與相應(yīng)的第二單鏈(或反義鏈)形成部分或完全互補的雙鏈結(jié)構(gòu)。術(shù)語“互補”意指兩條核酸鏈的堿基根據(jù)鳥嘌呤G與胞嘧啶C、腺嘌呤A與尿嘧啶U/胸腺嘧啶T堿基配對原則形成反平行互補配對的情況。本發(fā)明中，如無特殊說明，術(shù)語“抑制(suppress/suppressing,inhibit/inhibiting)”意指由于siRNA、或其他小干擾核酸(small-interferingnucleicacid,siNA)抑制劑介導(dǎo)的mRNA降解而使靶基因表達得以顯著下調(diào)(down-regulation)的情況。所述“顯著下調(diào)”指靶基因表達相對于正?；蛱幚砬八较陆?％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上或100％的情況。術(shù)語“系統(tǒng)給藥”、或“系統(tǒng)輸送”意指將siRNA等藥物活性成分輸送至體內(nèi)廣泛組織區(qū)域的一種給藥方式。為了達到系統(tǒng)給藥的效果，通常需要藥物活性成分、或藥物組合物具有較長的血液滯留時間，且不易被肝、腎等主要代謝器官吸收清除。作為siRNA的系統(tǒng)給藥方式，可采用靜脈注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射、或口服等方式。本發(fā)明中，優(yōu)選采用靜脈注射方式進行siRNA的系統(tǒng)給藥。術(shù)語“局部給藥”、“局部輸送”意指將siRNA等藥物活性成分輸送至局部組織區(qū)域的一種給藥方式。例如，可以通過將siRNA等藥物活性成分直接注射或涂覆在病變組織區(qū)域中來實現(xiàn)siRNA的局部給藥。作為適于siRNA等藥物活性成分局部給藥的組織區(qū)域，例如為皮膚、眼部玻璃體腔、肝、腎、肺等器官組織。本發(fā)明中，siRNA的設(shè)計是以plk1的mRNA序列為模板，針對plk1基因的保守區(qū)選取15-27個核苷酸長度的靶序列，從而得到相應(yīng)的siRNA。本發(fā)明中使用的plk1mRNA序列為Genebank注冊號為NM_005030.3的序列(SEQIDNO:1)，其長度為2204個核苷酸，編碼區(qū)自54位的起始密碼子ATG起始至1865位的終止密碼子TAA為止。具體來說，本發(fā)明的siRNA的設(shè)計按以下原則進行。首先，在plk1mRNA的全長序列范圍內(nèi)選取15-27個核苷酸長度的序列。15-27個核苷酸長度的序列的選取主要參考以下幾項原則：1)GC含量在35-60％之間，2)避免處于重復(fù)序列或低復(fù)雜性序列區(qū)域內(nèi)，3)避免出現(xiàn)4個以上的連續(xù)核苷酸序列，4)避免處于包含讀碼框起始密碼和終止密碼的50-100個核苷酸序列區(qū)域之內(nèi)。除此之外，還要分析核苷酸序列的組成和熱力學(xué)性質(zhì)，確保進入體內(nèi)后雙鏈容易解鏈，并避免免疫反應(yīng)的發(fā)生。隨后，通過BLAST分析，將候選siRNA的靶位點序列同人類基因組序列進行同一性比對，排除同其它基因具有16個核苷酸長度以上同一性的序列，以確保候選siRNA的靶位點序列不與其他非相關(guān)基因的序列之間具有高相似性，從而保證設(shè)計的siRNA僅對靶基因plk1具有特異的抑制作用。本發(fā)明中，siRNA的設(shè)計包括與plk1mRNA中的靶作用位點相同的第一單鏈的設(shè)計、以及與plk1mRNA中的靶作用位點互補的第二單鏈的設(shè)計。本發(fā)明中，siRNA的第二單鏈(或反義鏈)與plk1mRNA序列中的靶作用位點序列互補，并通過RNAi機制序列特異性地誘導(dǎo)plk1mRNA的降解，從而對plk1基因表達形成抑制。本發(fā)明所設(shè)計的第一單鏈和第二單鏈彼此完全互補，經(jīng)退火可形成平末端的，即，不具有3`突出端的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一個實施方式中，在根據(jù)上述原則設(shè)計的15-27個核苷酸長度的一條RNA單鏈的3′末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT，互補的另一條RNA單鏈同樣也做3′末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT的處理。這樣，兩條互補的RNA單鏈退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)后，在所述雙鏈結(jié)構(gòu)的兩端可分別形成由兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT構(gòu)成的3′突出端。本發(fā)明的另一個實施方式中，只在siRNA的一條RNA單鏈的末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT，由此，兩條互補的RNA單鏈退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)后，在所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一個末端形成由兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT構(gòu)成的3′突出端。本發(fā)明的siRNA的一條RNA單鏈可以通過固相或液相核酸合成方法進行合成。這些方法包括四個工藝步驟。即，1)寡聚的合成、2)脫保護、3)純化分離、及4)脫鹽的四個工藝步驟。這四個步驟中的技術(shù)細節(jié)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。除化學(xué)合成外，本發(fā)明的siRNA也可通過質(zhì)粒和/或病毒載體的表達而得到。例如，設(shè)計一個長度為50-90個核苷酸的DNA序列，并在其兩端加上兩個不同的限制酶切位點，例如加上BamHI和EcoRI的酶切位點。由所設(shè)計的DNA編碼的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有中間一段序列可形成環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，經(jīng)U字折返(U-turn)后的環(huán)兩端的序列可形成互補配對的雙鏈結(jié)構(gòu)。通過克隆技術(shù)將所設(shè)計的DNA插入到用相應(yīng)限制酶酶切過的表達載體中。將表達載體導(dǎo)入至細胞中，由所設(shè)計的DNA序列生成的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被細胞固有的siRNA加工機制加工成成熟的siRNA。由此，即可在細胞中一時或穩(wěn)定地表達siRNA。本發(fā)明對siRNA進行的化學(xué)修飾可以是以下一種或一種以上化學(xué)修飾的組合：1)對RNA鏈骨架結(jié)構(gòu)中連接核苷酸殘基的磷酸二酯鍵的修飾，2)對RNA鏈骨架結(jié)構(gòu)中核糖的修飾，3)對RNA的核苷酸殘基中堿基的修飾。例如，本發(fā)明提到的磷酸基團的修飾是指對磷酸基團中的氧進行修飾，包括硫代磷酸修飾(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如下式所示分別用硫和硼烷基置換磷酸基團中的氧，兩種修飾都能穩(wěn)定核酸的結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特異性和高親和力。本發(fā)明中，核糖基團的修飾是指對核糖基團中2′-羥基(2′-OH)的修飾。在核糖基團的2′-羥基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加了核酸的穩(wěn)定性，使核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。對核苷酸戊糖中2′-羥基的修飾包括2′-氟修飾(2′-fluromodification)、2′-甲氧基修飾(2′-methoxymodification)、2′-甲氧乙氧基修飾(2'-methoxyethoxymodification)、2′-2,4-二硝基苯酚修飾(2′-DNPmodification)、鎖核酸修飾(Lockednucleicacidmodification)、2′-氨基修飾(2′-Aminomodification)、2′-脫氧修飾(2′-deoxymodification)等。本發(fā)明中，堿基的修飾是指對核苷酸基團中的堿基進行修飾，如在尿嘧啶的5’位點引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶(5′-bromo-uracil)和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修飾是常使用的堿基修飾方法，其他還有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修飾、2,6-二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)修飾等。本發(fā)明中，核糖基團被修飾的核苷酸基團優(yōu)選為核糖基團的2′-羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。修飾后的siRNA抵抗核酸酶酶解的能力增強，但其抑制plk1基因表達的活性不會因修飾產(chǎn)生明顯變化。在本發(fā)明的一個實施方式中，為了促進siRNA的脂溶性，可以在siRNA的正義鏈的5′或3′末端引入如膽固醇、脂蛋白、維生素E、脂肪鏈等親脂性基團，這些親脂性基團可以通過共價鍵與siRNA結(jié)合。所述親脂性基團也可通過非共價鍵與siRNA結(jié)合，例如，siRNA通過疏水鍵或離子鍵與中性磷脂分子、多肽、多糖等結(jié)合。已知在siRNA上通過共價結(jié)合或非共價結(jié)合引入親脂性基團可以增加siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性、血液代謝特性和生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個實施方式中，siRNA的第一單鏈(或正義鏈)的5′末端和/或3′末端連接有5′-和/或3′-帽子(5`-and/or3′-cap)。所述5′-和/或3′-帽子結(jié)構(gòu)可以使siRNA抵御核酸外切酶的攻擊，進而提高siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性。作為所述5′-和/或3′-帽子，可以列舉但不限于甘油、無堿基反向脫氧異核苷(inverteddeoxyabasicmoiety)、4′,5′-亞乙基核苷(4′,5′-methylenenucleotide)等。在本發(fā)明的一個實施方式中，siRNA的第二單鏈(或反義鏈)的5′末端連接有磷酸基團。已知siRNA的反義鏈的5′端磷酸基團可以提高siRNA的活性。本發(fā)明中，所述抑制plk1基因表達的siRNA可與協(xié)助藥物體內(nèi)輸送的載體體系形成藥物組合物，并以藥物組合物形式在哺乳動物體內(nèi)施用。所述載體體系包括但不限于陽離子組分、非陽離子組分、以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，所述陽離子組分可以是但不限于帶正電的多肽或蛋白質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、帶正電的聚合物等。作為所述帶正電的多肽或蛋白質(zhì)，可列舉寡聚精氨酸、寡聚賴氨酸、魚精蛋白等。作為所述陽離子脂質(zhì)，可以是選自二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨丙烷、1,2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1,2-二油?；?3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、1,2-二棕櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1,2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、二肉豆蔻?；趸谆u基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化銨、N-(a-三甲基銨基乙?；?-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺鹽酸鹽、N-(a-三甲基銨基乙酰基)-O,O’-雙-(1H,1H,2H,2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化銨、N-{p-(w-三甲基銨基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、9-(w-三甲基銨基丁基)-3,6-雙(十二烷?；?咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)銨鹽酸鹽、N-w-三甲基銨基癸?；?二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基銨基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基銨基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-1-0810)、p-{w-(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、O,O’,O”-三(十二烷?；?-N-(w-三甲基-銨基癸?；?-三(羥基甲基)氨基甲烷澳化物鹽(TC-1-12)、1,2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、1,2-二肉豆蔻?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1,2-二棕櫚?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1,2-二硬脂?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1,2-二油?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1-棕櫚?；?2-油?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨(BHEM-Chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨(DOTAP)和N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨中的至少一種陽離子脂質(zhì)。作為所述帶正電的聚合物，可以是選自聚乙烯亞胺、聚β-氨基酯、殼聚糖季銨鹽中的至少一種正電性聚合物。本發(fā)明中，優(yōu)選N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨、或聚己內(nèi)酯-聚(N,N-二甲氨乙基甲基丙烯酸酯)嵌段共聚物類聚β-氨基酯作為陽離子組分。本發(fā)明所述的藥物組合物中，所述非陽離子組分可以是但不限于中性的膜融合脂質(zhì)(fusogeniclipid)、陰離子脂質(zhì)、兩親性聚合物等。作為所述膜融合脂質(zhì)，可以列舉二油?；字Ｒ掖及贰⒍王；字Ｄ憠A、反式磷脂酰基乙醇胺、1,2-雙(10，12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1,2-二反油?；姿嵋掖及贰?,2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1,2-二己?；姿嵋掖及贰?,2-二月桂?；姿嵋掖及贰?,2-二亞油?；姿嵋掖及?、1,2-二肉豆蔻?；姿嵋掖及贰?,2-二油?；姿嵋掖及贰?,2-二棕櫚油?；姿嵋掖及?、1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及贰?,2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂?；姿嵋掖及?、1-棕櫚酰基-2-油?；姿嵋掖及贰?-棕櫚?；?2-(10,12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1,2-二油?；姿嵋掖及?N-己酰胺、1,2-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N,N-二甲基-1,2-二油?；姿嵋掖及?、N,N-二甲基-1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及贰-十二烷?；?1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及?、N-十二烷?；?1,2-二油?；姿嵋掖及贰?,2-二油?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1,2-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二油?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1,2-二油?；姿嵋掖及?N-乳糖、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽]、二棕櫚酰磷酸乙醇胺-N-[4-(p-馬來酸亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽]、1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酰胺]、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-甲基-1,2-二油?；姿嵋掖及?、N-甲基-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油?；姿嵋掖及?N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、1,2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽]、N-(琥珀酰)-1,2-二油?；姿嵋掖及?、N-(琥珀酰)-1,2-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺等。本發(fā)明的藥物組合物中，通過含有上述膜融合脂質(zhì)，能夠進一步提高所述藥物組合物在哺乳動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運及輸送效率。作為所述兩親性聚合物，可以列舉聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)兩嵌段共聚物、或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)三嵌段共聚物、聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯兩嵌段共聚物、聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯兩嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三嵌段共聚物等。其中，在本發(fā)明的藥物組合物中優(yōu)選使用二油?；字Ｒ掖及贰⒒蚓垡叶?聚乳酸嵌段共聚物作為非陽離子組分。本發(fā)明的藥物組合物中，所述藥學(xué)上可接受的載體可以是pH值為4.0-9.0的磷酸鹽緩沖液、pH值為7.5-8.5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩沖液、生理鹽水、或7-15％的蔗糖溶液，其中，優(yōu)選使用pH值為4.0-9.0的磷酸緩沖液作為本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物中還可以含有保護劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑。保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種，滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉和/或氯化鉀。以注射用液體制劑形式的藥物組合物為例，所述保護劑的含量可以是0.01-30重量％。對于滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量沒有特殊限定，只要可保持液體制劑的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克即可。向動物或人類個體施用本發(fā)明的液體制劑形式的藥物組合物時，其劑量可以為本領(lǐng)域常用的劑量。例如，單次注射的劑量可以是在1-10g/kg體重的范圍內(nèi)。具體使用時，劑量選擇可以由各種參數(shù)、尤其根據(jù)待動物或人類個體的年齡、體重和癥狀等來確定。本發(fā)明中，以所述siRNA作為活性成分的藥物組合物中還可以包含可增強藥物組合物的穩(wěn)定性、維持和增強siRNA的抑制效果、可促進藥物組合物的代謝特性及組織靶向性的輔助組分。作為輔助組分，可列舉但不限于膽固醇、多肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂肪鏈、中性磷脂、及聚乙二醇-脂質(zhì)(PEG-lipid)中的一種或幾種。對于這些輔助組分在本發(fā)明的藥物組合物中的用量沒有特別的限制，只要能夠增強藥物組合物的穩(wěn)定性、血液代謝性能、靶向輸送效果即可。根據(jù)本發(fā)明提供的抑制哺乳動物細胞內(nèi)plk1基因表達的方法，該方法包括向哺乳動物細胞內(nèi)導(dǎo)入上述提到的抑制plk1基因表達的siRNA，從而使導(dǎo)入的siRNA能夠序列特異性地誘導(dǎo)所述plk1基因表達的抑制。本發(fā)明中，在體外將siRNA導(dǎo)入到細胞內(nèi)時可以采用已知方法進行。常用的體外siRNA導(dǎo)入方法如電穿孔法、顯微注射法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、病毒包裹法及脂質(zhì)體包裹法等。其中，脂質(zhì)體包裹法已成為siRNA的常規(guī)體外導(dǎo)入方法。本發(fā)明中，作為脂質(zhì)體可利用市售的陽離子脂質(zhì)體，例如利用Lipofectamin2000(Invitrogen公司制)、Oligofectamine(Invitrogen公司制)及Tfx50(Promega公司制)等。對于siRNA和陽離子脂質(zhì)體的配合比率沒有特殊限定，只要可有效地進行導(dǎo)入且不對細胞顯示劑量毒性即可，例如，相對于100重量份的小干擾RNA，陽離子脂質(zhì)體的含量可以為100-10000000重量份。本發(fā)明中，將siRNA導(dǎo)入到哺乳動物體內(nèi)細胞時的方法有兩種。一是將裸的siRNA(nakedsiRNA)直接導(dǎo)入到易于到達的皮膚組織細胞、眼部組織細胞、肺部組織細胞中等；二是以本發(fā)明的藥物組合物形式進行siRNA系統(tǒng)輸送。以下，結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基等實驗材料均為市售商品。實施例1：siRNA的設(shè)計與合成針對人plk1的mRNA序列(Genebank注冊號：NM_005030.3，SEQIDNO:1)并根據(jù)上述提到的設(shè)計原則得到了132個siRNA，得到的siRNA的序列示于表1。其中，127條siRNA(PLK-1～PLK-127)分布于plk1基因的編碼區(qū)，最后5條siRNA(PLK-128～PLK-132)分布于plk1基因的3’端非翻譯區(qū)。表1中，對于一個siRNA，分別示出其正義鏈、及互補的反義鏈序列，具體如，siRNAPLK-1的正義鏈具有由SEQIDNO:2表示的序列，且與plk1mRNA序列中相應(yīng)的靶位點序列相同，反義鏈具有由SEQIDNO:134表示的序列，與plk1mRNA序列中相應(yīng)的靶位點序列互補；其他siRNA的兩條單鏈序列也如同siRNAPLK-1依次對各自的兩條單鏈進行序列編號。表1：針對人mRNA的siRNA序列對于上述132個siRNA，進一步依據(jù)物種同源性分析得到12個人-小鼠同源的siRNA序列，結(jié)果示于表2；同樣，得到11個人-大鼠同源的siRNA序列、105個人-獼猴同源的siRNA序列、119個人-黑猩猩同源的siRNA序列，這些結(jié)果分別示于表3-表5中。表2：人-小鼠同源的siRNA序列表3：人-大鼠同源的siRNA序列表4：人-獼猴同源的siRNA序列表5：人-黑猩猩同源的siRNA序列對于上述經(jīng)由設(shè)計得到的132個siRNA進一步進行優(yōu)選。此時，考慮點包括以下六個方面。即，1)需使所選siRNA的作用靶點均勻分布在mRNA全長序列中，2)避免作用靶點位于mRNA復(fù)雜的二級或三級結(jié)構(gòu)域中，3)siRNA的作用靶點序列位于plk1mRNA的編碼區(qū)。plk1mRNA的5′端非編碼區(qū)只有53個核苷酸長度，這個區(qū)域的序列可能會被結(jié)合的翻譯調(diào)控蛋白和核糖體亞基等封閉，因此并不適合于作為siRNA的作用靶點。對于編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)的靶點，則應(yīng)優(yōu)先考慮位于編碼區(qū)的靶點，尤其需避免靶點位于3′端非編碼區(qū)中接近poly(A)尾的低復(fù)雜性且長度易變區(qū)域，4)優(yōu)先選擇第一單鏈中第1個堿基為G/C，第13個堿基不是G，第19個堿基是A而不是G的序列，5)優(yōu)先選擇第一單鏈中第3個堿基是A，第10個堿基是U的序列，6)避免含有單核苷酸多態(tài)性位點。基于以上考慮，從132個設(shè)計的siRNA序列中最終優(yōu)選出14個siRNA序列，結(jié)果示于表6。siRNA的寡聚核苷酸單鏈按照本領(lǐng)域公知的方法進行化學(xué)合成。合成的寡聚核苷酸的序列示于表6。合成時，在寡聚核苷酸單鏈的3′末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT(表6中，用下劃線標記)?；パa的寡聚核苷酸單鏈退火形成雙鏈RNA，雙鏈結(jié)構(gòu)的兩端分別具有dTdT的3′突出端。表6實施例2：siRNA對plk1基因表達的抑制效果驗證(siRNA的轉(zhuǎn)染)將人類肝癌細胞株HepG2用含10％胎牛血清、2mML-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基接種于24孔板，細胞密度為4×105細胞/孔，每孔0.5ml，37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染的具體操作步驟如下。將100ng實施例1中合成的14個siRNAPLK-3、16、37、41、54、64、65、67、76、92、102、103、108和128分別稀釋于50μlDEME無血清培養(yǎng)基中，同時將1μlLipofectamineTM2000(Invitrogen公司制)稀釋于50μlDEME無血清培養(yǎng)基中，將上述兩種溶液分別在室溫下孵育5分鐘后，均勻混合?；旌先芤河谑覝仂o置20分鐘后，把100μl的上述混合溶液加入到接種有HepG2細胞的24孔板中。siRNA的最終濃度約為10nM。細胞于37℃培養(yǎng)4小時，再加入1ml含10％胎牛血清、2mML-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，然后在37℃再培養(yǎng)24小時。作為陰性對照，同時轉(zhuǎn)染正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′、互補的反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′的陰性對照siRNA(N.C.siRNA)。(siRNA對plk1mRNA表達水平的抑制效果)通過熒光定量實時PCR(QuantitativeReal-TimePCR,qRT-PCR)檢測分別轉(zhuǎn)染了siRNAPLK-3、16、37、41、54、64、65、67、76、92、102、103、108和128的HepG2細胞中plk1mRNA的表達量，具體步驟如下。即，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞24小時后，用RNeasyminiKit(Qiagen公司制)提取細胞中的總RNA。用紫外分光光度計測定提取的RNA樣品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式：RNA濃度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀釋倍數(shù)，計算RNA樣品的濃度。然后用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit(Takara公司制)合成cDNA，每個樣品使用2μg通過上述步驟提取的總RNA。在合成cDNA后，利用PremixExTaqTM(Takara公司制)試劑盒進行熒光定量實時PCR反應(yīng)。其中，用于擴增plk1和作為定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參的β-actin的PCR擴增引物如表7所示。表7上游引物下游引物plk15′-GCCCCTCACAGTCCTCAATA-3′5′-TACCCAAGGCCGTACTTGTC-3′β-actin5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′siRNA對plk1mRNA表達水平的抑制率按如下等式計算。抑制率＝[1-(實驗孔plk1mRNA的表達量/實驗孔β-ActinmRNA的表達量)/(陰性對照孔plkmRNA的表達量/陰性對照孔β-ActinmRNA的表達量)]×100％。結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，本發(fā)明的siRNA均具有抑制plk1mRNA表達水平的效果。其中，siRNAPLK-65、siPLK-67和siPLK-76對plk1mRNA表達水平的抑制率均高于60％，分別為64％、68％和78％，這說明本發(fā)明的siRNA對plk1基因表達具有抑制活性，可用于抑制plk1基因的表達。制備例1委托蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司合成表8中所列的寡聚核苷酸。這些寡聚核苷酸中包含修飾的核苷酸基團，互補的寡聚核苷酸鏈退火形成修飾的siRNA，分別標記為PLK(m)-65-1、PLK(m)-65-2、PLK(m)-67-1、PLK(m)-67-2和PLK(m)-76-1。其中，(OMe)代表它左邊的核苷酸殘基中戊糖基團的2′羥基被甲氧基取代，(F)代表它左邊的核苷酸殘基中戊糖基團的2′羥基被氟取代。這些siRNA未加修飾前的核苷酸序列分別對應(yīng)于實施例1中的PLK-65、PLK-67和PLK-76。表8實施例3：化學(xué)修飾對小干RNA血清穩(wěn)定性的影響的評價對制備例1中得到的PLK(m)-65-1、PLK(m)-65-2、PLK(m)-67-1、PLK(m)-67-2和PLK(m)-76-1，以及實施例1中得到的PLK-65、PLK-67和PLK-76測定其在血清環(huán)境中的穩(wěn)定性。具體步驟如下。將10μl上述修飾和未修飾的siRNA(20μmol)分別與50μl胎牛血清(FBS，購自HyClone，貨號GTB0060)和40μlPBS混合后，在37℃下孵育0、2、4、8、24、48和72小時后得到處理樣品。處理樣品取樣10μl進行20％的PAGE凝膠電泳。由上述處理樣品的電泳條帶光強度與0小時的電泳條帶光強度的比值計算降解率，結(jié)果如圖2及表9所示。表9中列出的降解率為由72小時的電泳條帶光強度與0小時的電泳條帶光強度的比值算出的降解率。由圖2及表9可以看出，在血清環(huán)境中，修飾的siRNA的穩(wěn)定性相比未修飾的siRNA的穩(wěn)定性明顯提高。表9實施例4：化學(xué)修飾前后siRNA對plk1mRNA表達水平的抑制效果驗證按照與實施例2相同的方法，對制備例1中得到的siPLK(m)-65-1、siPLK(m)-67-1和siPLK(m)-76-1，以及實施例1中得到的siPLK-65、PLK-67和PLK-76分別測定其對plk1mRNA表達水平的抑制效果。轉(zhuǎn)染時，對于上述各siRNA采用梯度劑量進行轉(zhuǎn)染，使其終濃度分別為0.1nM、1nM和10nM。作為陰性對照，采用與實施例2中相同的正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′、互補的反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′的陰性對照siRNA(N.C.siRNA)。熒光定量實時PCR測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，修飾的siRNA對于plk1mRNA表達量具有與未修飾的siRNA類似的抑制效果。采用10nM劑量時，PLK(m)-65-1、PLK(m)-67-1相比對應(yīng)的未修飾的siRNAPLK-65、PLK-67具有更為優(yōu)異的抑制效果。顯然，這是由于所述修飾增強了siRNA的穩(wěn)定性，并由此加長了siRNA在細胞內(nèi)存留時間的緣故。實施例5：局部給藥siRNA對于乳腺癌細胞生長的抑制在BALB/c裸鼠第二個乳腺的脂肪墊下原位接種人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s(5×106個細胞/每只裸鼠)，14天左右后形成可見腫瘤。腫瘤的體積按以下公式計算：V＝0.5×a×b2，其中，a指腫瘤長徑，b指腫瘤短徑。每5只接種的裸鼠作為一組，每組裸鼠的腫瘤體積平均約為50mm3。作為處理組，將10μgsiRNAPLK-65、PLK(m)-65-1、PLK(m)-65-2、PLK-67、PLK(m)-67-1、PLK(m)-67-2、PLK-76和PLK(m)-76-1分別溶于100μl的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)中，并直接進行瘤內(nèi)注射。作為陰性對照組，采用實施例2中提到的陰性對照siRNA(N.C.siRNA，正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′、互補的反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′)。每隔一天，再將10μg上述siRNA進行瘤內(nèi)注射一次。第一次注射起20天后，按照如上所述的方法測量腫瘤體積，結(jié)果如表10所示。表10由表10可知，與陰性對照組相比，PLK-65、PLK(m)-65-1、PLK(m)-65-2、PLK-67、PLK(m)-67-1、PLK(m)-67-2、PLK-76和PLK(m)-76-1處理組的腫瘤細胞生長均得到了顯著抑制。實施例6：通過尾靜脈注射系統(tǒng)給藥siRNA藥物組合物時對于乳腺癌細胞生長的抑制(siRNA藥物組合物的制備)本實施例中，采用聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物(PEG-PLA)、及陽離子脂質(zhì)N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨(BHEM-Chol)制備siRNA藥物組合物，具體制備步驟參考了YangXZ.,etal.J.Cont.Release2011,156(2):203中的方法。即，將25mgPEG5000-PLA25000和1mgBHEM-Chol溶于0.5mL氯仿中，加入siRNA(0.025mL，0.2mg)水溶液后，冰浴下超聲形成初始乳液；隨后，將初始乳液加入到1.5mL的1％聚乙烯醇(Polyvinylalcohol,PVA)水溶液中，冰浴下超聲乳化得到乳液，將乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中；減壓下蒸除有機溶劑，離心收集沉積物，用水重懸并離心收集2次以除去PVA，從而得到含小干擾核酸的給藥組合物。通過上述步驟得到的藥物組合物中，各組分的質(zhì)量比為siRNA/陽離子脂質(zhì)/聚合物＝0.2/1.0/25.0。(siRNA藥物組合物尾靜脈注射給藥對于乳腺癌細胞生長的抑制)在BALB/c裸鼠右側(cè)第二個乳腺的脂肪墊下原位接種人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s(5×106個細胞)，14天左右后形成可見腫瘤，腫瘤體積平均約為50mm3。將裸鼠隨機分成4組，每組為8只裸鼠，分別通過尾靜脈注射進行給藥。給藥劑量以有效siRNA的量計算為1mg/kg(約20μgsiRNA/每只小鼠)，隔天給藥一次，共給藥10次。作為陰性對照組，通過尾靜脈注射150μlPBS溶液(陰性對照組1)、及通過上述步驟制備的含20μg實施例2中提到的陰性對照siRNA(正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′、互補的反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′)的PBS溶液150μl(N.C.siRNA藥物組合物，陰性對照組2)。作為處理組，分別通過尾靜脈注射通過上述步驟制備的、含20μgPLK(m)-65-1的PBS溶液150μl(PLK(m)-65-1藥物組合物，處理組1)、或含20μgPLK(m)-67-1的PBS溶液150μl(PLK(m)-67-1藥物組合物，處理組2)。每次給藥后均對腫瘤大小進行測量，得到腫瘤生長數(shù)據(jù)。腫瘤的大小按以下公式計算：V＝0.5×a×b2，其中，a指腫瘤長徑，b指腫瘤短徑。分析結(jié)果時，將每組小鼠第一次給藥時的“腫瘤大小平均值”(即給藥第0天)定為100％，其標準方差除以腫瘤大小平均值得到相對標準方差。之后的給藥過程中，每次測得的各組腫瘤大小平均值及標準方差同樣對第0天腫瘤大小平均值進行校正，即得到如圖4所示的腫瘤細胞生長抑制曲線。由圖4可以看出，與陰性對照組相比，通過尾靜脈注射系統(tǒng)給藥含PLK(m)-65-1及PLK(m)-67-1的藥物組合物可以有效促進乳腺癌細胞凋亡，并抑制腫瘤組織生長。實施例7：通過尾靜脈注射給藥siRNA藥物組合物時對于宮頸癌細胞生長的抑制(siRNA藥物組合物的制備)本實施例中，采用聚己內(nèi)酯-聚(N,N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)嵌段共聚物(PCL-PDMAEMA)、聚乙二醇嵌段修飾有葉酸的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(folate-PEG-PGA)制備siRNA藥物組合物。其中，PCL-PDMAEMA為聚β-氨基酯類兩親性陽離子聚合物，PEG-PGA為輔助性的聚合物。siRNA藥物組合物的制備步驟參考了HuangYY.,etal.Biomaterials.2012,(18):4653-中的方法。即，20μlsiRNA脫離子水溶液(含約1μgsiRNA)與50μlPCL5000-PDMAEMA2000的PBS溶液混合，室溫靜置20分鐘后，再加入50μlfolate-PEG5000-PGA46000的水溶液充分混合，室溫孵育20分鐘，之后用PBS調(diào)整體系即得到所需的藥物組合物。其中，PCL5000-PDMAEMA2000的氮(N)、siRNA的磷(P)、PEG5000-PGA46000的碳(C)的摩爾比為5:1:8。(siRNA藥物組合物尾靜脈注射給藥對于宮頸癌細胞生長的抑制)在BALB/c裸鼠右腋皮下接種人宮頸癌細胞Hela(5×106個細胞)，10天左右后形成可見腫瘤，腫瘤體積平均約為50mm3。將裸鼠隨機分成3組，每組為7只裸鼠，分別通過尾靜脈注射進行給藥。給藥劑量以有效siRNA的量計算為2mg/kg(約40μgsiRNA/每只小鼠)，每三天給藥一次，共給藥7次。作為陰性對照組，通過尾靜脈注射200μl空白PBS溶液(陰性對照組1)、及用200μlPBS溶解的PLK(m)-67-1(裸PLK(m)-67-1，陰性對照組2)。作為處理組，通過尾靜脈注射通過上述步驟制備的、含40μgPLK(m)-67-1的PBS溶液200μl(PLK(m)-67-1藥物組合物，處理組)。每次給藥后均對腫瘤大小進行測量，得到腫瘤生長數(shù)據(jù)。腫瘤的大小按以下公式計算：V＝0.5×a×b2，其中，a指腫瘤長徑，b指腫瘤短徑。分析結(jié)果時，將每組小鼠第一次給藥時的“腫瘤大小平均值”(即給藥第0天)定為100％，其標準方差除以腫瘤大小平均值得到相對標準方差。之后的給藥過程中，每次測得的各組腫瘤大小平均值及標準方差同樣對第0天腫瘤大小平均值進行校正，即得到如圖5所示的腫瘤細胞生長抑制曲線。由圖5可以看出，與陰性對照組相比，通過尾靜脈注射系統(tǒng)給藥含PLK(m)-67-1的藥物組合物可以有效促進宮頸癌細胞凋亡，并抑制腫瘤組織生長。當前第1頁1 2 3