本發(fā)明屬于生物靶向功能高分子緩釋材料領(lǐng)域，具體涉及一種基于葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備方法。

背景技術(shù)：

一直以來(lái)，傳統(tǒng)的癌癥化療由于選擇性較差，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)不可避免的損傷人體細(xì)胞從而出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，導(dǎo)致治療過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用和耐藥性。因此，在治療癌癥的過(guò)程中，對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療成為趨勢(shì)。

研究表明，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜表面存在著一些受體且在腫瘤組織中異常表達(dá)，該受體與相應(yīng)的配體能夠特異性結(jié)合。由于受體與配體的結(jié)合具有特異性、選擇性、飽和性、親和力強(qiáng)和生物效應(yīng)明顯的特點(diǎn)，這就為腫瘤的靶向治療提供了靶向途徑。其中，葉酸靶向給藥系統(tǒng)是目前研究較多的一種。這是由于與大分子抗體相比，葉酸(FA)屬于小分子物質(zhì)，其與受體結(jié)合具有高親和力、化學(xué)性質(zhì)簡(jiǎn)單、易于修飾、體積小高穩(wěn)定性、到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)。葉酸受體(FR)在正常組織中的表達(dá)高度保守，在實(shí)體瘤組織細(xì)胞(如乳腺癌、卵巢癌、皮膚癌、胰腺癌等)中有過(guò)度表達(dá)，雖然在正常組織細(xì)胞中葉酸受體可選擇性的表達(dá)在細(xì)胞表面，但是其呈極性分布使得血液循環(huán)中的靶向制劑不能接觸該受體，而惡性腫瘤細(xì)胞中葉酸受體的分布失去極性，從而血液循環(huán)中的靶向制劑可以接觸該受體，這就使得葉酸成為腫瘤治療的理想的靶向載體之一。

目前可作為葉酸靶向給藥系統(tǒng)的載體，主要分為3類：脂質(zhì)體、天然高分子及合成高分子。由于脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性，天然聚合物的批量差異性和合成聚合物結(jié)構(gòu)的可控性，葉酸靶向給藥系統(tǒng)的載體主要是用合成聚合物，如聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚-ε-己內(nèi)酯(PCL)及其它們的共聚物。研究表明，，將有親水鏈段的聚合物如聚乙二醇(PEG)接枝到疏水性鏈段上，如聚乳酸(PLLA)，形成雙親性嵌段共聚物PLLA–PEG–PLLA，將大大促進(jìn)藥物釋放，并且可以增加親水性蛋白的釋放率。因此，基于葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物，可以使其具備較好的腫瘤細(xì)胞靶向性。

現(xiàn)有技術(shù)中，葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備方法往往存在有機(jī)溶劑殘留量多、分散性差、接枝率低、穩(wěn)定性差等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：以葉酸和PLLA-PEG-PLLA為反應(yīng)物，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)縮合體系為活化偶聯(lián)劑，制備葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物，反應(yīng)方程式為：

具體步驟如下：

1.將葉酸溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中，配置葉酸溶液，待葉酸充分溶解后，向溶液中加入EDC/NHS縮合體系作為活化劑，使得EDC:NHS:FA的質(zhì)量比例在1:1:1～2:1:1之間，25℃下攪拌，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18～24h，得到溶液；

2.稱取0.1g～0.8g PLLA-PEG-PLLA聚合物加入步驟1得到的溶液，25℃下酯化反應(yīng)18～48h，得到粗化產(chǎn)物；

3.反應(yīng)結(jié)束后，利用DMSO將步驟2中得到的粗化產(chǎn)物透析24h，直至透析液不再變黃，用去離子水透析24h，抽濾，冷凍干燥制得葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物。

優(yōu)選方式下，所述步驟1中葉酸溶液濃度為4mg/ml。

優(yōu)選方式下，所述步驟1中偶聯(lián)劑EDC/NHS與葉酸質(zhì)量比例為2:1:1。

優(yōu)選方式下，所述步驟2中酯化反應(yīng)時(shí)間24h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果：(1)在共聚物微球制備過(guò)程中使用EDC/NHS縮合體系為活化偶聯(lián)劑，克服了傳統(tǒng)方法中引入難以除去的有機(jī)溶劑和催化劑；(2)所得到的共聚物接枝率高；(3)該制備方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便、安全，適用范圍廣。

說(shuō)明書附圖

圖1為本發(fā)明的葉酸、聚乳酸及葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的紅外譜圖，其中a為葉酸、b為聚乳酸、c為葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物；

圖2為本發(fā)明的葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的核磁譜圖；

圖3為本發(fā)明的葉酸、聚乳酸及葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的X射線衍射譜圖，其中a為葉酸、b為聚乳酸、c為葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物；

圖4為本發(fā)明的葉酸、聚乳酸及葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的差示掃描量熱儀譜圖，其中a為聚乳酸、b為葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物；

圖5為本發(fā)明的葉酸、聚乳酸及各制備條件下的葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的接觸角圖，其中a為聚乳酸接觸角圖、b為葉酸溶液濃度2mg/ml，酯化反應(yīng)時(shí)間18h，F(xiàn)A:EDC:NHS＝1：1：1時(shí)葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的接觸角圖、c為葉酸溶液濃度4mg/ml，酯化反應(yīng)時(shí)間18h，F(xiàn)A:EDC:NHS＝1.5：1：1時(shí)葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的接觸角圖、d為葉酸溶液濃度8mg/ml，酯化反應(yīng)時(shí)間18h，F(xiàn)A:EDC:NHS＝2：1：1時(shí)葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的接觸角圖、e為葉酸溶液濃度4mg/ml，酯化反應(yīng)時(shí)間24h，F(xiàn)A:EDC:NHS＝2：1：1時(shí)葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的接觸角圖、f為葉酸接觸角圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

1.活化葉酸：

稱取0.04g葉酸溶于20ml無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，配置成濃度為2mg/ml的溶液，待葉酸充分溶解后，再向溶液中加入與葉酸質(zhì)量比例為1:1:1的EDC和NHS，25℃下，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18h。

2.葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備

將0.3g的PLLA-PEG-PLLA微粒加入到上述含有葉酸的活化溶液中，25℃下攪拌酯化反應(yīng)18h。

3.產(chǎn)物提純

利用DMSO將步驟2中得到的產(chǎn)物透析24h后，用去離子水透析24h，為保證透析完全，透析期間需多次更換透析液，直到透析液不再變黃，抽濾，冷凍干燥制得產(chǎn)物，其接枝率為2.3％。

實(shí)施例2

1.活化葉酸：

稱取0.08g葉酸溶于20ml無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，配置成濃度為4mg/ml的溶液，待葉酸充分溶解后，再向溶液中加入與葉酸質(zhì)量比例為2:1:1的EDC和NHS，25℃下，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18h。

2.葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備

將0.3g的PLLA-PEG-PLLA微粒加入到上述含有葉酸的活化溶液中，25℃下攪拌酯化反應(yīng)24h。

3.產(chǎn)物提純

利用DMSO將步驟2中得到的產(chǎn)物透析24h后，用去離子水透析24h，為保證透析完全，透析期間需多次更換透析液，直到透析液不再變黃，抽濾，冷凍干燥制得產(chǎn)物，其接枝率為11.79％。

實(shí)施例3

1.活化葉酸：

稱取0.16g葉酸溶于20ml無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，配置成濃度為8mg/ml的溶液，待葉酸充分溶解后，再向溶液中加入與葉酸質(zhì)量比例為1.5:1:1的EDC和NHS，25℃下，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18h。

2.葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備

將0.3g的PLLA-PEG-PLLA微粒加入到上述含有葉酸的活化溶液中，25℃下攪拌酯化反應(yīng)48h。

3.產(chǎn)物提純

利用DMSO將步驟2中得到的產(chǎn)物透析24h后，用去離子水透析24h，為保證透析完全，透析期間需多次更換透析液，直到透析液不再變黃，抽濾，冷凍干燥制得產(chǎn)物，其接枝率為11.04％。

實(shí)施例4

1.活化葉酸：

稱取0.04g葉酸溶于20ml無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，配置成濃度為2mg/ml的溶液，待葉酸充分溶解后，再向溶液中加入與葉酸質(zhì)量比例為2:1:1的EDC和NHS，25℃下，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18h。

2.葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備

將0.3g的PLLA-PEG-PLLA微粒加入到上述含有葉酸的活化溶液中，25℃下攪拌酯化反應(yīng)48h。

3.產(chǎn)物提純

利用DMSO將步驟2中得到的產(chǎn)物透析24h后，用去離子水透析24h，為保證透析完全，透析期間需多次更換透析液，直到透析液不再變黃，抽濾，冷凍干燥制得產(chǎn)物，其接枝率為5.99％。

實(shí)施例5

1.活化葉酸：

稱取0.08g葉酸溶于20ml無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，配置成濃度為4mg/ml的溶液，待葉酸充分溶解后，再向溶液中加入與葉酸質(zhì)量比例為1.5:1:1的EDC和NHS，25℃下，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，活化18h。

2.葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的制備

將0.3g的PLLA-PEG-PLLA微粒加入到上述含有葉酸的活化溶液中，25℃下攪拌酯化反應(yīng)18h。

3.產(chǎn)物提純

利用DMSO將步驟2中得到的產(chǎn)物透析24h后，用去離子水透析24h，為保證透析完全，透析期間需多次更換透析液，直到透析液不再變黃，抽濾，冷凍干燥制得產(chǎn)物，其接枝率為6.10％。

根據(jù)上述實(shí)施例做同等實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)如表1所示，當(dāng)葉酸濃度為4mg/ml、EDC:NHS:FA比例為2:1:1，酯化反應(yīng)時(shí)間為24h時(shí)，得到最大接枝率為11.79％(質(zhì)量百分比)，最大DS取代度為2.67，即1mol的PLLA-PEG-PLLA上接了2.67mol的葉酸。

表1.不同實(shí)驗(yàn)條件下FA/PLLA-PEG-PLLA中FA的接枝率

SD,標(biāo)準(zhǔn)偏差；

^aK_i^A＝Σ(同一因素下的DS之和)/3,為某一因素在每一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)偏差的DS的平均值；

^bR_i^A＝max{K_i^A}-min{K_i^A}。

將上述實(shí)施例的接枝產(chǎn)物和接枝反應(yīng)物做紅外光譜實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如圖1所示。接枝產(chǎn)物在2878cm^-1，2946cm^-1，3004cm^-1處存在C-H伸縮振動(dòng)峰。在1753cm^-1和1084cm^-1處對(duì)應(yīng)PLLA-PEG-PLLA聚合物部分中的羧酸酯(C＝O)和醚(C-O-C)。此外，在1640cm^-1，1610cm^-1和1510cm^-1分別對(duì)應(yīng)著葉酸分子中的-CO-NH的C＝O鍵伸縮振動(dòng)峰、羧基C＝O伸縮振動(dòng)峰和苯環(huán)的彎曲振動(dòng)峰。這些官能特征吸收峰的存在證明了PLLA的羧基與葉酸的羥基成功的通過(guò)酯鍵連接到了一起。

將上述實(shí)施例的接枝產(chǎn)物做核磁譜圖，所得結(jié)果如圖2所示，對(duì)接枝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。2.50ppm和3.30ppm處的尖峰屬于_d6-DMSO溶劑和H₂O的特征峰。3.5ppm和3.6ppm處為PEG鏈段上的是-CH₂-(圖2.a)。5.21ppm和1.46ppm處的尖峰為PLLA鏈上-CH-(圖2.b)和-CH₃-(圖2.c)，其比率接近1:3。在6.6-6.7ppm和7.6-7.7ppm處有微弱信號(hào)證實(shí)了產(chǎn)物中FA分子的存在，對(duì)應(yīng)苯環(huán)上的＝CH-(圖2.d、e)，在11.39ppm處有芳香-OH特征峰(圖2.f)，在8.1ppm和8.65ppm處有-NH-特征峰(圖2.g)和蝶啶中＝CH-特征峰(圖2.h)。核磁共振譜中這些特征峰證明了共聚物FA/PLLA-PEG-PLLA成功合成。

將上述實(shí)施例的接枝產(chǎn)物和接枝反應(yīng)物經(jīng)X-衍射、差示掃描量熱儀測(cè)試了葉酸接枝PLLA-PEG-PLLA共聚物的性能，如圖3和4所示，經(jīng)過(guò)接枝后的葉酸/PLLA-PEG-PLLA共聚物結(jié)晶性增大，熱穩(wěn)定性提高。

測(cè)量上述實(shí)施例中接枝共聚物水接觸角，如圖5所示，葉酸接枝率越大，產(chǎn)物親水性越好。

顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。